Summary
Her presenterer vi detaljerte behandlingsprotokoller for Imaging delikate vevsprøver ved hjelp av skanning elektron mikroskopi (SEM). Tre ulike behandlingsmetoder, nemlig hexamethyl disilazana (HMDS) kjemisk tørking, enkel lufttørking og kritisk punkt tørking er beskrevet for å forberede stive eggeskall, embryo på tidlige utviklingsmessige stadier, og fungal kulturer hhv.
Abstract
Selv om skanning elektron mikroskopi (SEM) blir mye brukt for den ultra-strukturelle analyse av ulike biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder involvert i behandling av ulike biologiske prøver innebære unik praksis. Alle konvensjonelle praksiser beskrevet i litteraturen for behandling prøvene fortsatt finne nyttige programmer, men subtile endringer i prøven preparatet kan endre bildekvalitet, samt, innføre artefakter. Herav, benytter en enestående eksemplar forberedelse teknikk spesifikk å typen av tissue analysert er krevde å få en fint kvalitet image med ultrastructural resolution. Fokuset i denne studien er å gi den optimale prøven forberedelse protokoller for Imaging embryo, stive eggeskall, og fungal kulturer bruker SEM. Følgende optimaliseringer ble anbefalt å gi gode resultater for de tre forskjellige delikate biologiske prøver studert. Bruk av mildere fiksativene som 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde etterfulgt av dehydrering med etanol-serien er obligatorisk. Fungal mycel på agar blokker innhentet av lysbilde kulturer gir en bedre ultrastructural integritet i forhold til kulturer tatt direkte fra agar plater. Kjemisk tørking av embryo med HMDS gir tørking uten å innføre overflate spennings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørking. HMDS hindrer sprekker forårsaket av krymping som prøvene er mindre sprø under tørking. For sopp kultur gir imidlertid kritisk punkt tørking akseptabel bildekvalitet sammenlignet med kjemisk tørking. Eggeskall kan bli avbildet uten spesielle Forberedelses trinn, bortsett fra grundig vasking og lufttørking før montering. Forberedelses metoder ble standardisert basert på akseptabel bildekvalitet oppnådd med hvert forsøk.
Introduction
Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastructural analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensjonal profilering av prokaryoter, planter og dyr. Den høye romlig oppløsning av en SEM gjør den til en av de mest allsidige og kraftige teknikker tilgjengelig for undersøkelse av mikrostrukturelle karakteristikker av prøvene på nanometer til mikrometer skala. Desiccated prøver løses til struktur og topografiske strukturer med intense detaljer, som gir grunnlaget for å utvikle gyldige konklusjoner om funksjonelle forhold1,2,3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9. Når tolke SEM bilder av biologiske prøver, er det en stor utfordring å skille mellom innfødte strukturer og gjenstander som er opprettet under behandling. SEM er generelt operert ved svært høye vacuums å unngå interferens fra gass molekyler som påvirker den primære, sekundære eller tilbakespredte elektron bjelker slippes ut fra prøven10,11. Også biologiske materialer er mottakelige for stråling skader på grunn av deres fattige eller ikke-gjennomfører egenskaper. Det er viktig for prøvene lastet inn i SEM å være helt tørt og fritt for eventuelle organiske forurensninger for å eliminere eventuelle outgassing i et høyt vakuum miljø10,11. Som biologiske prøver er hovedsakelig sammensatt av vann, ytterligere preparativ teknikker er nødvendig for å sikre at de innfødte strukturene beholdes.
Oppløsningen oppnådd er basert på optimalisering forberedelser metoder spesifikke for prøvetyper og instrumental parametre utnyttet. Derfor er det nødvendig å unngå å bruke generalisert behandlingstrinn for alle vevstyper. Noen biologiske prøver vil kreve mindre strenge prosessering for å bevare sin struktur, mens mer tid og omsorg kan være nødvendig for delikate typer prøver for å unngå innføring av tørking gjenstander, for eksempel krymping og kollaps. Prøve utarbeidelse er et kritisk trinn i SEM Imaging; funnene i morphometric studier er bemerkelsesverdig påvirket av prøve Forberedelses prosedyrer12,13. Felles forberedelse skritt for mange biologiske prøver er fiksering, dehydrering og belegg med et metall som gull, platina eller Palladium å konvertere sine overflater for å være ledende for SEM analyse. Naturen og kombinasjonen av trinnene som brukes vil variere avhengig av type vev, og de konkrete målene for studien. Lad oppbygging, følsomhet for vakuum og elektronstråle skade utgjør problemer ved behandling av myke delikate biologiske prøver, nødvendiggjør ytterligere behandlingstrinn for å beholde den opprinnelige strukturen av objektet. Ved hjelp av konvensjonelle metoder som Osmium tetroxide festing, og dehydrering forårsake krymping og sammenbruddet av delikate vev14,15,16,17. Målet med studien er å etablere elegante metoder avledet ved å kombinere ideer fra tidligere studier med modifikasjoner for å forberede og bilde myke delikate vev (f. eks, reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder, og fungal kulturer).
Valg av en passende feste metode er det første viktigste steget for mikroskopisk analyse av biologiske prøver. Fikse vevet umiddelbart etter isolere fra en organisme er avgjørende for å hindre endring i deres morfologi på grunn av nedbrytning. En effektiv bindemiddel bør avslutte cellulære prosesser ved permeating cellene raskt og opprettholde effekten irreversibelt å stabilisere strukturen av prøven til å tåle både påfølgende behandling trinn og undersøkelse under SEM17 , 18. selv om flere kjemiske og fysiske fiksering metoder er kjent, kjemisk fiksering er mer vanlig å bruke for biologiske prøver å unngå eventuelle cellulære endringer på grunn av autolyse, forråtnelse, og tørking effekter. Det er mange bindemiddel kjemiske formuleringer diskutert i litteraturen17,19,20,21,22,23, fiksativene som fungerer ved denaturering og coagulating biologiske makromolekyler, og de som løser ved covalently kryss-linking makromolekyler. Alkoholer brukes som denaturering fiksativene som bevarer Ultrastructure svært dårlig og brukes mest for lette mikroskopi og ikke anbefalt for elektron mikroskopisk analyse. Cross-Linking fiksativene som formaldehyd, glutaraldehyde, og Osmium tetroxide skape Intermoleylære og intramolekylær Cross Linking mellom makromolekyler innen vev, gir utmerket bevaring av ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiske prøver er følsomme for temperatur. Temperaturen i begynnelsen av fiksering anbefales å være 4 ° c for å redusere den laterale mobilitet av membran proteiner, for å bremse spredningen av intercellulære molekyler, og for å bremse hastigheten på fiksering11. Tiden som kreves for å fikse vev avhenger i stor grad av størrelsen på prøven og hastigheten som bindemiddel diffunderer og reagerer med komponentene i prøven. En overnatting fiksering i 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde i PBS ved 4 ° c er den foretrukne metoden for SEM analyse av prøver som brukes i denne studien for deres sekvensielle penetrative egenskaper, som tillater mindre delikate prøver å bli behandlet17 , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 27. en post-fiksering trinn med Osmium tetroxide elimineres ikke bare på grunn av sin giftige natur, men også funnet å gjennomføre ingen ekstra fordel å forbedre bildekvaliteten for prøvene analysert i denne studien.
Biologiske prøver inneholder væsker som forstyrrer SEM-operasjonen; derav, prøvene må tørkes før du setter den i SEM prøve kammer. Når dehydrering er sikret, må løsemiddel fjernes fra vevet uten å skape gjenstander i prøvene på grunn av overflaten spenning/tørking. Tre forskjellige tørking metoder ble ofte brukt under prosessering vev for SEM Imaging: lufttørking, kritisk punkt tørking, og frysetørking prøver28,29,30,31. Få studier rapporterer alle tre tørking metoder som produserer identiske resultater med animalsk vev prøver28,29,30,31. En generell praksis som brukes for mindre eksemplarer er kjemisk dehydrering av stigende konsentrasjons serie av alkohol og hexamethyldisilazane (HMDS), men større eksemplarer er tørket ved hjelp av et kritisk punkt tørking (CPD) instrument32. Under tørkeprosessen, store krefter dannet i små hulrom som er gått gjennom prøven med en væske/gass-grensesnitt; Dette kan også føre til en fullstendig kollaps av hul strukturene33. Enhver deformasjon som oppstår på grunn av behandlingen kan deretter forveksles som en innfødt strukturell funksjon av prøven. Dermed bør generalisert fenomen for behandling elimineres og en unik tørkeprosessen bør være standardisert for hver type vev spesielt når delikate vevsprøver analyseres.
I flere forsøk utført ved hjelp av ulike kombinasjoner av alle de ovennevnte prosesser, standardiserte vi metodene som kan brukes til SEM analyse av tre delikate vev: reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder og sopp kulturer. Utviklingsmessige biologer og morphologists beskriver normal og unormal morphogenesis under embryoutvikling i representative virveldyr dyr. Undersøkelser på gen signalering trasé avhenge av morfologiske beskrivelse av romanen strukturer. For å unngå brå endringer i embryo Foster strukturen under SEM-analyse, anbefaler vi kjemisk tørking etter dehydrering. Kjemisk tørking ved hjelp av HMDS er den relativt nyeste tørke metoden og fordelene inkluderer relativ hurtighet, brukervennlighet, tapt kostnad, og den begrensede kompetansen og utstyret som trengs9. CPD er en ofte brukt tørking teknikk ved hjelp passaging CO2 over prøvene ved en bestemt temperatur og trykk. Vi identifiserte at HMDS er egnet for tørking mykt delikat vev og tillater større prøver å bli behandlet i forhold til kritisk punkt tørking, noe som forårsaket omfattende deformasjon til embryonale vev. Flere metoder har blitt brukt til å forberede prøvene for SEM Imaging å studere morfologiske karakteristikker av sopp34. Sopp prøver er vanligvis løst i Osmium tetroxide etterfulgt av etanol dehydrering og kritisk punkt tørking, som kan gi tilfredsstillende resultater, selv om toksiske effekter av Osmiumtetroxide35 og miste sopp materialer mens skiftende løsninger under behandling er uttalt ulemper. Prøven forberedelse teknikken bruker luft-tørking uten fiksering har også vært praktisert36 men resulterer i krympet og kollapset strukturer, og observasjon av slike prøver kan lett bli misforstått mens karakteriserer arten. Fungal hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en enda tørking kan ikke oppnås for å gjenopprette strukturen. På grunn av denne effekten, fryse-tørking brukes vanligvis for tørking bløtvev som sopp mycel. Frysetørking fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen av noen salter eller sekresjon vil skjule overflate detaljer som vil bli identifisert bare på SEM ser scenen. Vi koblet raset kulturen metoden med glutaraldehyde festing og kritisk punkt tørking å gi strukturelle detaljer intakt fungal hyfer og sporer. Selv om CPD tørking forårsaket krymping i embryo, resulterte det i godt bevarte Mycelial strukturer når kombinert med glutaraldehyde fiksering. Eggeskall er av primær betydning for fosteret av oviparous dyr ved å ikke bare opptre som en beskyttende dekker, men også gi mekanisk stabilitet, permeabilitet til gass og vann, og en kalsium Reserve for utviklingsland embryo. Freshwater Turtle eggeskall er klassifisert som "rigid" basert på deres struktur, og på grunn av deres tilgjengelighet har fått betydelig oppmerksomhet fra biologer1,2,3,4 , 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 37 for alle , i 38.
Vi detaljer enkle metoder for enkel undersøkelse av eggeskall og skall membraner av malte skilpadde som kan brukes på alle stive eggeskall arter. Forberedelses metoder ble evaluert basert på resulterende bildekvalitet og reduserte potensielle artefakter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: malt skilpadde (Chrysemys picta) egg brukt i denne studien ble samlet i løpet av hekkende sesongen av mai til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillatelse innhentet fra New York State Department of Environmental Bevaring (desember).
1. kjemisk tørking metode for å behandle embryo for SEM
- Samle skilpadde egg fra feltet områder i hekketiden. Forbered inkubasjons kamre på forhånd, laget av plast bokser med lokk (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm fylt med sengetøy medium tilberedt med en fuktig blanding av vermikulitt og torv mose (1:1 ratio). Lag 4-6 hull på ca 0,25 cm langs sidene av boksene og på lokket for å tillate lufting.
- Forsiktig fjerne jord fra reiret for å avdekke eggene. Tørk overflaten av skilpadde egg med fortynnet jod tinktur (1:25000) for å kontrollere mikrobiell forurensning under inkubasjons. Plasser klørne atskilt fra hverandre, clutch størrelse malt skilpadde kan variere fra 5-9 egg og plassere maksimalt 8-9 egg per boks.
Merk: Håndter eggene forsiktig under oppsamling, tørking, merking og plassering inne i boksene. Plassering og justering av egg må være den samme som de ble lagt, vil enhver bevegelse hemme embryoutvikling. - Manuelt begrave eggene halvparten i sengetøy, dekk og plasser boksen inne i inkubator satt ved 30 ° c. Ruge eggene for 10-17 dager for å oppnå de embryonale stadiene 12, 13 og 18 henholdsvis brukt i denne studien. Legg destillert vann for å delvis fukte sengetøyet medium annenhver dag for å unngå dehydrering og for å opprettholde fuktnivået for normal utvikling av embryo.
Merk: Inkubasjons og staging embryo er i henhold til en komplett utviklings tabell utgitt tidligere39. - Fest embryo ved å gjøre det første kuttet på den ene siden av rygg eggeskall og eggeplomme membran sammen, vertikalt til den lange aksen ved hjelp av spiss saks. Sett saksen inn i eggeplomme nøye for å unngå å kutte embryonale platen. Nå kuttes den laterale siden av egget langs den lange aksen og deretter kutte den andre siden av egget langs den korte aksen.
- Peel åpne excised stykke med embryo side opp med tang. Skjær den andre siden av eggeskall og plasser excised tykket i fosfat bufret saltvann (PBS ved en pH på 7,4).
Merk: skilpadden egg er fylt med svært tyktflytende eggeplomme og rygg side av fosteret overholder eggeskall membranen. Den eggeskall membranen i nærheten av embryo endres med inkubasjons fra gjennomskinnelig hvit til en ugjennomsiktig, Chalky hvit. Dette gjør det mulig å lokalisere fosteret i sentrum av den lange aksen og bli sett på som en mørk forkalket flekk fra utvendig40,41. - Bruk en stereomikroskopet å isolere embryo sammen med eggeplomme membranen ved peeling dem fra eggeskall ved hjelp av tang. Fjern ekstra-embryonale membraner ved hjelp av pinsett og mikro-saks. Overfør fosteret ved hjelp av et embryo skjeen til frisk PBS i en Petri parabolen å vaske noe blod eller eggeplomme.
- Bruk klare 12-brønn plater for å fikse embryo over natten i 4% paraformaldehyde i PBS ved 4 ° c eller i 2-3% glutaraldehyde i PBS. Plasser en til tre embryo i hver brønn, avhengig av størrelsen på embryo. Sørg for fullstendig infiltrasjon (prøver vises hvitt) for eldre embryo ved å forlenge fikserings tiden for 2-3 dager. Skyll embryo 3x med frisk PBS i 5 minutter hver skylling.
Merk: unngå å skade overflaten av fosteret ved å bruke polystyren inserts med polyester mesh bunner for 12-brønn plater å overføre prøver fra ett løsemiddel til et annet. - Tørke prøver ved hjelp av en rekke etanol konsentrasjon i destillert vann: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, og 100% og behandle prøver for 1 t i hver dehydrering løsning. Gjenta trinnet med 100% etanol to ganger for å sikre fullstendig dehydrering. Hvis den ikke brukes umiddelbart, lagre prøver i 70% etanol ved-20 ° c i en lengre periode.
- Tørt embryo ved hjelp av en rekke hexamethyldisilazana (HMDS) til 100% etanol konsentrasjon: 1:2, 2:1 og 100%. La prøvene i hver løsning i 20 min og holde Petri parabolen delvis dekket under prosessen.
Merk: Utfør alle trinn som involverer HMDS i avtrekks hette med nødvendig personlig verneutstyr, da HMDS er svært giftig. - La embryo i finalen 100% HMDS løsning dekket helt eller delvis i en avtrekksvifte over natten hjelpe til fordampning av HMDS, forlater prøver klar for montering og frese belegg. Dekk fatet for å eliminere støv settling over prøvene.
Merk: vevet vises hvitt etter fullstendig tørking og delvis tørket prøver vil se gul i farge, la disse vev i avtrekks panseret i lengre tid. - Velg størrelsen på aluminium stubber og karbon teip per størrelse av prøven analysert. Monter de tørkede prøvene forsiktig på en standard aluminiums nål spire (12,7 mm x 8 mm) ved hjelp av dobbel pinne karbon ledende tape (12 mm).
- Introduser monterte prøver i kammeret til frese elektrostatisk for å belegge prøven med en svært tynn film av gull for å eliminere lade effekten. Gold plate prøvene for 60-120 s på en 35 mA frese.
- Monter stubber på tilsvarende pore-plater ved å festesett skruene sikkert. Overfør prøveholderen inn i eller ut av prøvekammeret i SEM ved hjelp av prøve utvekslings verktøyet. Image prøvene ved høy vakuum-modus med en akselererende stråle spenning på 10 kV og utslipps strøm 10 μA.
Merk: Bruk alltid hansker mens du håndterer prøver, prøve holdere, monterings stubber og overføringsverktøy for å unngå fett kontaminering fra hendene til SEM-systemet. - Test alternative teknikker nedenfor for å sammenligne oppløsningen på prøvene som er innhentet fra ovenstående prosedyre.
- Inkluder en post-fiksering med 1% Osmium tetroxide for 1 t ved romtemperatur etter trinn 1,7.
- Delvis eller fullstendig fjerne HMDS på trinn 1,10 for rask rask fordampning av HMDS.
- Behandle embryo etter trinn 1,8 ved hjelp av kritisk punkt tørking (CPD) ved å følge trinn 3.3-3.4.
2. klargjøre eggeskall for SEM ved hjelp av en lufttørke metode
- Samle og ruge den malte skilpadden (Chrysemys picta) egg for å fikse embryo som angitt i trinn 1.1-1.7.
- Lagre eggeskall i destillert vann i trinn 2,1 etter embryo fiksering. Rengjør eggeskall grundig ved å slikke i destillert vann i minst 1 time for å eliminere eggeplomme og albumin forurensning.
- Air-Dry eggeskall etter vask på delikate antistatiske kluter i avtrekks panseret over natten. Oppbevar tørkede eggeskall i rene prøveflasker merket med nummer og trinn.
- Monter, frese pels og bilde prøvene ved å følge trinnene som er angitt i trinn 1.11-1.13.
3. kritisk punkt tørking metode for å forberede fungal kulturer for SEM
- Etablere lysbilde kulturer
- Forbered potet druesukker agar (PDA) Media for fungal kulturer: tilsett 39 g PDA strøm i 1 L av destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. Bland godt ved å virvlende flasken og autoklav mediene ved 121 ° c i 30 min. la medie løsningen avkjøles og legg deretter til antibiotika kloramfenikol (25 μg/mL) ved hjelp av en steril micropipette.
Merk: etter sterilisering, den agar løsningen skal være varm og det vil ikke stivne snart. Avkjøle den nok i den grad at den ville ikke deaktivere det antibiotika. - Bland det ved å virvlende og helle plater (ca 10-12 mL av media for hver 10 cm Petri parabolen), forsiktig stable opp og la stivne.
- Bruk en steril skalpell blad til å kutte ut små blokker av agar ca 1/2 til 3/4 av en tomme. Fjern og Plasser en agar blokk på et rent glass mikroskop lysbilde.
- Plasser lysbildet i en ren Petri rett for å hindre forurensning og bevare fuktighet under inkubasjons.
- Hev raset av bunnen av Petri parabolen ved hjelp av en steril tannpirker for å skape overflatespenning mellom platen og skyv for å fjerne glasset lysbildet uten å forstyrre den delikate veksten etter inkubasjons.
- Bruk en steril sløyfe eller en nål til å overføre noen av sopp fra prøven inokulum til hver av de fire sidene av agar blokken på lysbildet.
- Plasser en ren dekkglass på overflaten av agar blokken følgende inoculation. Tilsett noen dråper sterilt destillert vann til Petri parabolen rundt lysbildet for å sikre fuktighet for den voksende sopp.
- Forsegle platen delvis med para fin film og ruge platen ved 30 ° c i en passende tidsperiode (for Fusarium arter ruge for 36 til 48 h).
- Fjern lysbildet fra Petri parabolen og skille tett overholdt dekkglass fra agar blokken ved hjelp av steril tang. Fix agar blokkene i 3% glutaraldehyde i PBS over natten ved 4 ° c.
- Forbered potet druesukker agar (PDA) Media for fungal kulturer: tilsett 39 g PDA strøm i 1 L av destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. Bland godt ved å virvlende flasken og autoklav mediene ved 121 ° c i 30 min. la medie løsningen avkjøles og legg deretter til antibiotika kloramfenikol (25 μg/mL) ved hjelp av en steril micropipette.
- Tørke prøvene ved å passere gjennom en etanol-serie: 10%, 25%, 50%, 75% og 90% med 15 min per endring. Behandle prøvene for endelig dehydrering med to endringer i 100% etanol som varer 30 minutter hver for å sikre fullstendig metning.
- Tørking av kritisk punkt: Plasser dehydrert prøver i kammeret til CPD-apparatet. Seal og kjøle kammeret ved å åpne ventiler for å tillate flytende CO2 inn og vent etanol ut, til væske co2 helt fyller kammeret.
- Forsegle og varme kammeret langsomt for å oppnå et kritisk punkt når kammer trykket overstiger 1000 PSI og temperaturen overstiger 31 ° c, den flytende og gassfasen av CO2 er i likevekt. Sakte tappe CO2 fra kammeret og prøven som gass for å unngå effekter av overflatespenning.
- Utføre montering, gull plating og Imaging prøvene ved å følge trinnene som er angitt i trinn 1.11-1.13.
- Utfør sammenlignende analyse ved kjemisk tørking av prøvene fra trinn 3,2 ved hjelp av HMDS ved å følge trinn 1,9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 Vis skanning elektron hhv analyse av malt skilpadde (Chrysemys picta) embryo. Malte skilpadde egg samlet og inkubert på et sengetøy medium, montert på aluminium stubber etter kjemisk tørking ble brukt for SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning av en etappe 12 embryo viser kraniofacial strukturer; maksillære prominence strekker seg utover søvnapnéskinne og begrenser en godt merket nese pit anteriort; fem pharyngeal buer ble også observert (figur 1F). Nyopprettede somites på bakre halen regionen av fosteret er lett countable i forhold til segmentert kroppen somites. Forlemen knopper vises lengre sammenlignet med bakben lem knopper og peker mer caudally enn ventrally. En veldefinert utvekst av en ryggskjoldet ås er sett langs hele Inter-lem flanken regionen på scenen 15 embryo (figur 1G. På scenen 18, malte skilpadder besitter en kort, svakt prosjektering snute. Den nedre nebb hviler i øvre kjeve og er litt hvelvet med en Terminal krok som passer inn i den sentrale hakk av øvre nebb (figur 1H). Den øvre kjeven av malte skilpadder viser et hakk utseende danner en midtre U-V formet bakside spissen med en liten cusp på hver side, begynner en liten egg tann å danne på tuppen av den øvre kjeven. Lem knopper som dukket opp lenger under tidligere stadier danner en paddle-lignende struktur i etapper 13-14 med digital plate vagt indikert. Lem mesenchyme avgrenset av apikale ectodermal ryggen er sett langs fremre-bakre marginer (figur 1I-J).
Figur 2 viser ultra-strukturell analyse av Chrysemys picta eggeskall og Shell membran bruker SEM Imaging. Malte skilpadde eggeskall ble innhentet som beskrevet ovenfor, og ble utsatt for luft-tørking etter vask med dobbelt destillert vann (figur 2A, B). Eggeskall montert på aluminium stubber med dobbeltsidig karbon tape (figur 2C) ble avbildet med SEM. En lateral visning av skallet viste ytre kalkholdige eggeskall lag fast feste til den indre trådformede Shell membran (figur 2D). Den ytre overflaten av eggeskall består av godt skilles mineralisert skall enheter, laget av globular/sfæriske knuter arrangert i grupper og mellom tilstøtende Shell enheter en konsentrasjon av små avrundede depresjoner eller porene i ulike størrelser ble observert (figur 2E). Knuter fra hver gruppe av Shell-enheter møtes i et koblings knutepunkt, midtpunktet (figur 2F). Den ytre overflaten ble manuelt skrelles ved hjelp av Tang for å observere overflaten av skallet membran. Rader med sentrale plaketter ble sett som gir festepunkt mellom Shell enheter og underliggende flerlags fiber membran (figur 2G).
Figur 3 viser morfologiske karakterisering av Ascomycete fungal isolat fra lysbilde kulturer observert ved hjelp av SEM Imaging. Ordningen med lysbilde kultur oppsett etablert (Figur 3A) viser fungal vekst på agar blokken innen to dager etter inoculation. Koloniene vokser raskt med hvit til krem-farget antenne mycel (Figur 3B). SEM Imaging følgende kritisk punkt tørking og frese belegg av agar skiver avslørt fungal hyfer, buet conidia, og ris som sporer. Conidiophores ble sett som følge sidelengs fra septate antenne hyfer (Figur 3C). Macroconidia produsert på kortere, utvidet conidiophores er moderat buet, med korte, Butte apikale og utydelig pedicellate basal celler meste septate (Figur 3D).
Figur 4 viser de komparative resultatene for behandling av lignende prøver ved hjelp av alternative teknikker. Fordype hodene på scenen 15 embryo i HMDS og tørking av gradvis fordampning viser godt bevarte kraniofacial strukturer, nesten ingen krymping eller forvrengning er sett med lengre tider med langsom fordampning fra HMDS (Figur 4A). Embryo post-fast med Osmium tetroxide viste ingen identifiserbar forskjell i bildekvalitet bortsett fra liten krymping av vev i forhold til HMDS langsom prosessering (Figur 4B). Tørking embryo ved å fjerne HMDs delvis eller helt tillater rask fordampning resulterer i strukturell forvrengning og krymping (Figur 4C), mens langsom fordampning løst gode overflatestrukturer av en tilsvarende iscenesatt embryo ( Figur 4 A). tørking gjenstander ble sett i embryo behandlet med CPD teknikken forårsaker omfattende krymping og ødeleggelse av vev (Figur 4D, E). Agar skiver fra lysbilde kulturer viser ufullstendig tørking av sopp isolere med HMDS behandling i forhold til CPD (figur F). Fullstendig tørking oppnås med CPD behandling av agar skiver med en godt tørket, hvit prøve viser intakt høyoppløselig strukturelle funksjoner av fungal hyfer og sporer (Figur 4g-g '). Agar blokker med fungal kulturer vises krympet og gul i fargen gjør dem ikke egnet for SEM Imaging (Figur 4H-h ').
Figur 1 : Scanning elektron micrographs av Chrysemys picta embryo fremstilt ved kjemisk tørking. (A) Chrysemys picta, hekkende under avl sesongen på ris Creek Field Station, Oswego, ny. (B) godt konstruert reir utenfra. (C) overflate jord fjernet med forsiktighet til eksponering eggene lagt. (D) egg plassert i inkubasjons kammer med sengetøy medium. (E) montering av embryo på aluminiums stubber etter kjemisk tørking, E4 viser frese belagt embryo. (F) lateral visning av etappe 12 embryo som viser ansikts strukturer, lem knopper og somites. (G) veldefinert ryggskjoldet Ridge og paddle-formede lem knopper er sett på scenen 15. (H) kraniofacial strukturer av scenen 18 embryo viser øvre og nedre kjeve, noterer en liten egg tann dannet på tuppen av øvre nebb. (I) rygg visning av høyre forlemen på etappe 13-14 og NÆRBILDE av Aer (J) ved rygg-ventrale grensen. Vektstenger: F-H, 500 μm; Jeg, 100 μm, og J, 10 μm. keys: MB, mellomhjernen; NP, nese grop; MXP, maksillære prominence; pa, pharyngeal buer; h, hjerte; FL, forlemen; s, somite; HL, bakben; t, hale spissen; CR, carapacial Ridge; et, egg tann; OC, munnhulen; e, øye; UJ, øvre kjeve; LJ , lavere kjeve; m, mesenchyme, AER, apikale ectodermal Ridge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Ultrastructural analyser av luft-tørket eggeskall og skallet membran av malte skilpadde egg. (A) etter innfesting av embryo, ble eggeskall vasket grundig i destillert vann for å fjerne eggeplomme og albumin. (B) Clean eggeskall var luft tørket minst over natten. (C) montering av en eggeskall på aluminium stubber. (D) radial visning av skall fragment som viser ytre kalkholdige lag og indre skall membran. (E) ytre kalkholdige lag viser globular skall enheter (su) arrangert i grupper og porer sett i mellom disse enhetene (stjerner). (F) forstørret visning av en nodule som viser midtpunktet (c) mellom skall enhetene. (G) fjerning av kalkholdige lag viser den ytre overflaten av skallet membran med depresjoner igjen brutt fra Shell enheter. Vektstenger: E, 100 μm; F, 10 μm, og G, 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Forbereder sopp kultur for SEM Imaging. (A) skjematisk diagram for å vise oppsett av lysbilde kultur. (B) hvit farget fungal kolonier sett på agar blokken etter to dager med inkubasjons ved 30 ° c. (C) SEM bilde som viser en del av mycel av Fusarium solani, svart stjerner som markerer macroconidia i sporodochia, en pil som peker til phialide, og pilspisser rettet mot microconidia, skala bar, 10 μm. (D) forstørret bilde av septate chlamydospores, skala bar 5 μm. keys: AB, agar blokk; CS, dekkglass; f, fungal kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sammenlignende analyse av alternative teknikker for å behandle lignende prøver. (A) frontal syn på malt skilpadde hode tørket med langsom fordampning av HMDs (a), etter post-festing med Osmium tetroxide (B), rask raskere fordampning av HMDs (C), og CPD (D-E). Inkludert en post-fiksering trinn ved hjelp av Osmium tetroxide ikke viser noen synlige forskjellen i bildekvalitet sammenlignet med HMDS behandling uten etter fiksering. Deformasjoner er sett etter rask fordampning av HMDS, mens gradvis tørking med langsom fordampning gir en bedre overflatestruktur. Ulike grader av krymping og kollapset strukturer er sett i regionene av hjernen, øyne og ansikts prominences i embryo behandlet med CPD. (F) montering av lysbilde kulturer behandlet med HMDs (1), CPD (2) og FRESE belagt CPD behandlet prøven (3) på aluminium stubber. (g-g ') Komplett tørking sett på som intakt hvit farget agar skive med sopp vaksinere oppnås ved CPD bevare strukturer av fungal mycel og sporer av Fusarium solani. (h-h ') Utilstrekkelig tørking av lysbilde kultur, krymping og skadet strukturell integritet sett med HMDS bevaring teknikk. Vektstenger: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm, og G'-H ', 20 μm. keys: et, egg tann; OC, munnhulen; e, øye; UJ, øvre kjeve; LJ, lavere kjeve; svart stjerner, macroconidia i sporodochia; pil, phialide; og pilspisser, microconidia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår studie, ulike fiksering agenter, dehydrering og tørking metoder ble testet for å forberede tre ulike delikate biologiske prøver for SEM Imaging: embryo, eggeskall, og fungal kulturer. SEM er vanligvis brukes til overflate analyse, så bindemiddel penetrasjon er mindre om, men det må forstås at dårlig fast indre strukturer vil føre innover krymper eller/og kollapset overflatestrukturer. Forlenget fiksering tid bør også vurderes for større vevsprøver, erstatte bindemiddel løsningen et par ganger avhengig av fiksering varighet. På grunn av aktiv interaksjon mellom bindemiddel og vevet, ville de osmotisk egenskapene til cellene endres betraktelig. Tissue væsker ville fortynne bindemiddel og således en aldehyd bevirke bidrar å det total osmolalitet kan neglisjert så langt som virkninger opp på cellen kvantum er bekymret. Dessuten ville formaldehyd trenge raskere inn i vev og er mer effektiv som Cross-linker sammenlignet med glutaraldehyde. En bufret formaldehyd-glutaraldehyde blandingen ble også rapportert for å fikse en rekke vev, men for monolagere og celle suspensjoner fortynnede løsninger var mer egnet for innfesting15,16. Imidlertid er de fortynnede løsningene også hypertonic, slik at aldehyder ikke selv er osmotically aktive. For delikate prøver som brukes i denne studien, ble PBS på pH 7,4 brukt som et redskap for feste midlene, ettersom fosfat buffere antas å være mer lik de cytoplasmatiske miljøene i de fleste biologiske prøvene. Videre er OSMOLARITETSSYSTEM identifisert å være innenfor det fysiologiske området som kreves for prøven mens PBS opptrer som et redskap for festemiddelet. Etter fiksering med Osmium tetroxide er ofte anbefalt for ulike biologiske prøver16,22,42 men har blitt eliminert for alle biologiske prøvene som brukes i denne studien. Prøver uten Osmium tetroxide gitt skarpe bilder og prøver festet med Osmium tetroxide gitt skille resultater (Figur 4A). Osmium tetroxide forårsaker forvrengning av blad vev strukturer og gir dårligere prøve bevaring sammenlignet med glutaraldehyde og formaldehyd blanding43, og det har blitt antydet at en oppbygging av Osmium molekyler kan hemme infiltrasjon av dehydrating agenter og overgangs agenter brukes i CPD, og løsemidler som HMDS brukes for kjemisk tørking. Effekten er vev-spesifikke og unntatt Osmium tetroxide vil ikke ha noen effekt på bildekvaliteten for den type delikate eksemplarer analysert i denne studien. For andre typer vev bruk av Osmium tetroxide kan elimineres med utvidet primær fiksering.
HMDS tørket skilpadde embryo eksemplarer viste godt bevarte overflater, og mindre forvrengning eller krymping i forhold til CPD (Figur 4). CPD minimerer sjansen for forvrengning i celle morfologi og artefakter produksjon på grunn av null eller minimal overflatespenning opprettet i løpet av prosessen. Imidlertid kan CPD forårsake en potensiell fysisk fare for delikate skjøre prøver. I tråd med vår observasjon, HMDs gitt lignende eller høyere kvalitet Imaging ved å minimere overflatespenningen skyldes tørking basert på tidligere studier publisert44,45,46,47. Sammenlignet med CPD behandling, HMDS bevarte strukturelle detaljer av den organiske meshwork utmerket i etset muslinger og Barnacle skjell48 og gitt høy oppløsning av de strukturelle trekk ved komplekse interne organiseringen av mermithid nematoder49 og insekt interne vev28. Tørke plate gjenstandene ble sett i store mengder på prøvene utarbeidet av CPD teknikken i forhold til HMDS teknikken. Membranen blebs og pellet artefakter ble økt i livmorhals cellene utarbeidet ved hjelp av CPD teknikk50. HMDS reagerer med vann for å produsere hexamethyldisiloxane og ammoniakk, som begge fordamper fra objektet. HMDS er vanligvis brukes i gass kromatografi å skape silyl etere av forbindelser som sukker, aminosyrer, alkoholer, og en rekke andre forbindelser. Det er ikke kjent om HMDS reagerer med noen av disse forbindelsene i vev. HMDS kan krysskobling proteiner og stive vevet under tørkeprosessen28, selv om den nøyaktige årsaken til at HMDs gir bedre bevaring av embryo ikke kunne forklares med unntak av vev spesifisitet. Basert på resultatene av våre undersøkelser, CPD forårsaket omfattende krymping i forhold til HMDS, og er mye mer egnet for behandling av embryonale vev, spesielt for å analysere overflatestruktur for tidlig iscenesatt embryo. Mekanismen som HMDS fungerer på vev tørking har ikke blitt belyst, selv om langsom tørking med gradvis fordampning i absolutte vannfri omgivelser kan være en grunn for å få en utmerket overflatestruktur av dyrene.
Små biter av agar blokker med sopp kolonier fra tidligere etablerte lysbilde kulturer ble brukt i denne studien for å unngå problemer med å opprettholde den opprinnelige luftighet av Mycelial matten. CPD tørking av agar stykker med sopp kolonier resulterte i en vaske effekt, mens endringer i fiksativene, buffere og etanol ble funnet å være et bedre valg overvinne vanskelighetene med frysetørking. HMDS som fungerer godt for embryo av alle stadier var ute av stand til å løse fungal kulturer, mens lufttørking med HMDS utgjorde et betydelig problem: curling opp og miste den strukturelle stivhet. Mens CPD fungerer godt for fungal kulturer, det indusert umiddelbar skade på embryo spesielt på tidlige stadier i utviklingen, forårsaker krymping på overflaten. Det ble ikke observert noen lade-eller tørke artefakter når HMDS og CPD ble brukt til henholdsvis embryo-og sopp kulturer. For stivt vev som eggeskall av skilpadder, er ingen spesiell behandling nødvendig unntatt for vasking og lufttørking ved romtemperatur før montering for bildebehandling.
Uavhengig av forberedelse metoden, bør gradvis etanol gradient trinnene brukes til å redusere potensialet for tørking gjenstander. I utgangspunktet ble både HMDS og CPD prøver funnet å ha overflate gjenstander med krymping etter dehydrering og tørking protokoller tilgjengelig i litteraturen. Etter en rekke standardizations, bestemte vi at gjenstandene var resultatet av alkohol dehydrering. Det er viktig å bruke en langsom dehydrering prosess ved hjelp av mer gradvis etanol øker under dehydrering. Varigheten av hver gjentakelse bør også være lengre for embryo sammenlignet med sopp kulturer. Videre, et ekstra trinn på 100% etanol sikret fullstendig ensartet metning. HMDS kan fjernes helt eller delvis for å tillate lufttørking av prøver, men utvidet eksponering for HMDS og gradvis lufttørking ved fordampning ble funnet å være effektive for embryo å unngå avbrudd (Figur 4A, C) forårsaket av stor overflate spenning som observert for mikrobiell celle feste51. Fordype prøver i HMDS og langsom tørking over natten avdekket en utmerket overflatestruktur i daphnia arter52 antyder at mykt delikat vev kan dra nytte av den langsomme tørkeprosessen. Akseptabel bildekvalitet for embryo kan fås med langsom kjemisk tørking ved gradvis å øke konsentrasjonen av HMDS til etanol etter dehydrering.
Alle prøvene var montert på aluminium stubber ved hjelp av en dobbeltsidig karbon tape for å gi en ledende overflate, et tynt lag av fargeløs neglelakk kan også brukes hvis den samme prøven må avbildet i en annen orientering. Prøvene kan lett fjernes fra stubber når neglelakk brukes på spire overflaten og posisjonering prøvene i alternative fly er mulig i forhold til å bruke dobbeltsidig karbon tape. Som prøvene er ikke, er det nødvendig å frese et tynt lag av metall på prøvene for å øke konduktans. En gull målet ble brukt i denne studien under frese belegg, og gull-Palladium også gir lignende resultater unngå lading effekter. Riktig stråle spenning er prøve avhengig, for lett belagt prøver, Imaging med et felt utslipp SEM på 2-5 kV vil gi en god definisjon av overflatestrukturer. For vev med tilstrekkelig belegg, gir 5 kV generelt bedre signal uten mer stråle penetrasjon. For prøver som mangler dybde og er belagt med gull alene, Imaging på en høyere spenning (10 kV) tillot bedre visualisering av overflate topografi.
Utarbeidelse av delikate vev for SEM utgjør særegne utfordringer, og en rekke prøve forberedelser teknikker kan brukes til å overvinne og minimere Imaging gjenstander. Vi tilbyr omfattende metoder for å behandle tre ulike delikate biologiske vevsprøver, for SEM Imaging: embryo, stive eggeskall, og fungal kulturer. I vår etterforskning, subtile endringer i populære metoder tilgjengelig fra tidligere publiserte studier ble gjort, og vi identifiserte den mest hensiktsmessige dehydrering og tørking metoder som er spesifikke for hver delikat vev type. Disse protokollene kan tilpasses for å få akseptabel SEM bildekvalitet fra lignende biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego for nyttige diskusjoner og kommentarer om manuskriptet. Denne studien ble støttet av Rice Creek førsteamanuensis Grants, Oswego; Challenge Grants SUNY Oswego og National Science Foundation (NSF) små tilskudd til PGL og JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
