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Genetics

एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति का उपयोग कर मक्का Mitochondrion में प्राथमिक और प्रसंस्कृत ट्रांसस्क्रिप्ट के भेदभाव और मानचित्रण

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/60019
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Summary

हम परिपत्र आरटी-पीसीआर, मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचार, और उत्तरी दाग के संयोजन के द्वारा एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल अस्थिर 5' ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक सामान्यीकरण कदम भी शामिल है, और यह भेदभाव और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि stably मक्का mitochondrion में जमा मानचित्रण के लिए उपयुक्त है.

Abstract

संयंत्र mitochondria में, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि 5' triphosphate प्रतिलेखन दीक्षा (प्राथमिक प्रतिलिपि) से व्युत्पन्न है, जबकि अन्य होते हैं 5' मोनोफॉस्फेट उत्पन्न पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनलली (प्रसंस्कृत प्रतिलिपि). दो प्रकार की प्रतिलिपियों के बीच भेदभाव करने के लिए, कई रणनीतियों को विकसित किया गया है, और उनमें से अधिकांश 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव पर निर्भर करते हैं। हालांकि, प्राथमिक 5' टर्मिनी पर ट्राइफॉस्फेट अस्थिर है, और यह दो प्रकार के ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालता है। मक्का माइटोकोन्ड्रियोन में जमा प्राथमिक और प्रसंस्कृत प्रतिलिपियों में व्यवस्थित रूप से अंतर और मैप करने के लिए, हमने सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफोशपैटस उपचार, मात्रात्मक के संयोजन से एक परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर) आधारित रणनीति विकसित की है। आरटी-पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर), और उत्तरी दाग। एक सुधार के रूप में, इस रणनीति अस्थिर 5' ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक आरएनए सामान्यीकरण कदम भी शामिल है।

इस प्रोटोकॉल में, समृद्ध माइटोकोंड्रियाल आरएनए का आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेट द्वारा पूर्व-उपचार किया जाता है, जो 5' त्रिफॉफेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है। परिपत्रीकरण और रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, 5' पॉलीफॉस्फेटसे से व्युत्पन्न दो सीडीएनए इलाज और गैर-उपचारित आरएनए को मक्का 26एस परिपक्व आरएनए द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, जिसमें एक संसाधित 5' अंत होता है और 5' पॉलीफॉस्फेटस के प्रति असंवेदनशील होता है। सामान्यीकरण के बाद, प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि इलाज और गैर इलाज RNAs से प्राप्त cRT-PCR और आरटी-QPCR उत्पादों की तुलना द्वारा भेदभाव कर रहे हैं। ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी को cRT-PCR उत्पादों की क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है, और फिर उत्तरी दाग द्वारा सत्यापित किया जाता है।

इस रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि निर्धारित किया गया है. कुछ mitochondrial जीन की जटिल प्रतिलिपि पैटर्न के कारण, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि भेदभाव नहीं थे और / हमें यकीन है कि नहीं कर रहे हैं कि इस रणनीति के लिए भेदभाव और अन्य संयंत्र mitochondria में या प्लास्टिड में स्थिर राज्य प्रतिलिपि नक्शा उपयुक्त है.

Introduction

संयंत्र mitochondria में, कई परिपक्व और अग्रदूत आरएनए कई आइसोफॉर्मकेस के रूप में जमा कर रहे हैं, और स्थिर राज्य प्रतिलिपि उनके 5 ' समाप्त होता है पर अंतर के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है1,2, 4. प्राथमिक प्रतिलिपि 5' triphosphate समाप्त होता है, जो प्रतिलेखन दीक्षा से प्राप्त कर रहे हैं. इसके विपरीत, संसाधित प्रतिलिपि है 5' मोनोफॉस्फेट पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल प्रोसेसिंग द्वारा उत्पन्न. भेदभाव और प्रतिलिपि के दो प्रकार के मानचित्रण के लिए आणविक प्रतिलेखन और प्रतिलिपि अंत परिपक्वता अंतर्निहित तंत्र को जानने के लिए महत्वपूर्ण हैं.

संयंत्र माइटोकोन्ड्रिऑन में प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों के बीच अंतर करने के लिए, चार प्रमुख रणनीतियों को विकसित किया गया है। पहली रणनीति तंबाकू एसिड पायरोफॉस्टास (टीएपी) के साथ माइटोकोंड्रिल आरएनए का पूर्व उपचार करना है, जो 5' ट्राइफॉस्फेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है और प्राथमिक ट्रांसक्रिप्टकोआरए लिगेज द्वारा परिपत्रीकृत करने में सक्षम बनाता है। टेप इलाज और गैर इलाज आरएनए नमूनों की प्रतिलिपि बहुतायत तो cDNA समाप्त होता है (आरईएस) या परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर)2,3,4के तेजी से प्रवर्धन द्वारा तुलना कर रहे हैं। दूसरी रणनीति में, संसाधित प्रतिलिपि सबसे पहले माइटोकोंड्रिल आरएनए से टर्मिनेटर 5'-फॉस्फेट-निर्भर एक्सोनुलेस (टेक्स) का उपयोग करके समाप्त हो जाती है, और प्राथमिक प्रतिलिपियां छोड़ दी जाती हैं फिर प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण द्वारा मैप की जाती हैं5,6 . तीसरी रणनीति के लिए guanylyl transferase का उपयोग कर प्राथमिक प्रतिलिपि पूर्व टोपी है, और फिर triphosphated 5' टर्मिनी की स्थिति प्राइमर विस्तार द्वारा एक साथ ribonuclease या S1 nuclease संरक्षण विश्लेषण7,8 के साथ निर्धारित किया जाता है ,9. 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव के आधार पर उन लोगों से अलग, चौथी रणनीति इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, साइट-निर्देशित म्यूटेजनन, और प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण को जोड़ती है जो पुटेटिव प्रमोटरों की विशेषता है और प्रतिलेखन निर्धारित करती है दीक्षा स्थल8,10,11. इन रणनीतियों का उपयोग करके, कई प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि संयंत्र mitochondria में निर्धारित किया गया है.

तथापि, कई अध्ययनों से पता चला है कि प्राथमिक प्रतिलिपियों के 5' ट्राइफॉस्फेट अस्थिर थे, और वे आसानी से अज्ञात कारण2,4,12,13के लिए मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित हो गए थे। यह समस्या 5' ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अनुपस्थिति के आधार पर तकनीकों का उपयोग करके दो प्रकार की ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालती है, और संयंत्र में प्राथमिक और संसाधित ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच व्यवस्थित रूप से भेदभाव करने के पिछले प्रयासों में बाधा डालती है। माइटोकोंड्रियाअसफल २,१२.

इस प्रोटोकॉल में, हम सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस उपचार, आरटी-क्यूपीसीआर, और उत्तरी दाग को व्यवस्थित रूप से मक्का में जमा प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों को व्यवस्थित रूप से अलग करने के लिए गठबंधन करते हैं (जीए मई) मिटोकोन्ड्रिऑन (चित्र 1)। cRT-PCR एक आरएनए अणु के 5' और 3' extremities के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है, और यह आमतौर पर पौधों में प्रतिलिपि टर्मिनी नक्शा करने के लिए अनुकूलित किया जाता है2,12,14,15. आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटेस ट्राइफॉस्फेट5 टर्मिनी से दो फॉस्फेट निकाल सकता है, जो प्राथमिक प्रतिलिपि आरएनए लिगेस द्वारा आत्म-लिगेशन के लिए उपलब्ध बनाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मक्का में परिपक्व 26S rRNA 5' टर्मिनस संसाधित किया था, और यह आरएनए 5 ' polyphosphatase1,16के प्रति असंवेदनशील था. प्राथमिक 5' टर्मिनी पर अस्थिर ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए, 5' पॉलीफॉस्फेटकास-उपचार और गैर-उपचारित आरएनए परिपक्व 26S RRNA द्वारा सामान्यीकृत हैं, और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि फिर तुलना करके विभेदित हैं सीआरटी-पीसीआर उत्पादों दो आरएनए नमूनों से प्राप्त की। cRT-PCR मानचित्रण और भेदभाव के परिणाम क्रमशः उत्तरी दाग और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सत्यापित किए जाते हैं। अंत में, वैकल्पिक प्राइमर उत्तरी दाग में पता चला उन प्रतिलिपियों बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन cRT-पीसीआर द्वारा नहीं. इस cRT-PCR-आधारित रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि अलग और मैप किया गया है1.

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Protocol

1. प्राइमर डिजाइन

  1. पीसीआर प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर (सामग्रीकीतालिका) का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर डिजाइन प्राइमर डिजाइन17के सामान्य नियमों के आधार पर डिजाइन करें।
    नोट: आरटी प्राइमर लक्ष्य प्रतिलिपि के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं, और वे आम तौर पर कोडिंग दृश्यों (परिपक्व mRNAs और अग्रदूत RNAs), या $ 500-600 nt प्रत्याशित 5 के अंत (18S और 26S rRNAs) के भाग पर लंगर डाले हैं.
  2. सीआरटी-पीसीआर द्वारा परिपत्रीकृत ट्रांसक्रिप्ट्स को बढ़ाना अलग-अलग प्राइमर के डिजाइन जोड़े।
    नोट: युग्मित अपसारी प्राइमर परिपत्रकृत प्रतिलिपियों के 5'-3' संधि के बगल में होते हैं, और उनकी स्थिति विश्लेषण किए गए लक्ष्य प्रतिलिपियों में भिन्न होती है (चित्र S1)। कुछ प्रतिलिपि लंबे UTRs है; उदाहरण के लिए, nad2-1 5' UTR और rps4-1 3' UTR 1,985 और 1,826/1,834 nt, क्रमशः1हैं। यदि दोनों प्राइमर कोडिंग क्षेत्र पर लंगर डाले जाते हैं, तो लक्ष्य प्रतिलिपि बढ़ाना मुश्किल होगा। इसके विपरीत, कुछ UTRs कम कर रहे हैं; उदाहरण के लिए, nad2-1 और nad4-1 के 3 ' UTRs हैं 34/35 और 29-31 nt, क्रमशः1. युग्मित प्राइमर कोडिंग अनुक्रम से दूर स्थित हैं, तो PCR विफल हो जाएगा। आम तौर पर, अलग प्राइमर के दो जोड़े प्रत्येक लक्ष्य प्रतिलिपि के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जबकि कई जोड़े उन लोगों को मैप करने के लिए आवश्यक हो सकते हैं जिनके ट्रांसक्रिप्ट पैटर्न जटिल हैं और/या UTRs बहुत लंबे हैं।
  3. उत्तरी दाग के लिए आरएनए जांच तैयार करने के लिए अभिसरण प्राइमर के डिजाइन जोड़े।
    नोट: युग्मित प्राइमर लक्ष्य जीन के कोडिंग क्षेत्र पर स्थित हैं, और पीसीआर उत्पाद का आकार 100 से 1,000 बीपी की सीमा में होना चाहिए। प्रत्येक आगे प्राइमर एक प्रतिबंध एंजाइम साइट के परिणामस्वरूप जांच में वेक्टर दृश्यों को कम करने के लिए होना चाहिए.

2. मक्का के विकास कर्नेल से कच्चे Mitochondrion की तैयारी

  1. कीट, मोर्टार, कांच की पफ़ल, ट्यूब, और autoclave द्वारा सुझावों का बंध्याकरण, और उन्हें ओवन में सूखी.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर या बर्फ पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन, और सभी समाधान पूर्व शांत।
  3. निकासी बफर (ईबी) के 100 एमएल तैयार करें, 0.3 एम एस यू रोस, 5 एमएम टेट्रासोडियम पायरोफॉस्फेट, 10 एमएम केएच2पीओ4, 2 एमएम ईएलटीए, 1% [w] पॉलीविनाइलपिरोलिडोन 40, 1% [w/v] गोविन सीरम एल्बुमिन, 5 एमएम एल-सिस्टीन, और 20 एम एम एबीकोक एसिड। KOH के साथ पीएच 7.3 करने के लिए समायोजित करें और निस्पंदन द्वारा बाँझ।
  4. 0.3 एम सुक्रोज, 1 एमएम ईजीटीए, और 10 एमएम एमओपीएस (3-(एन-मॉर्पोलिनो) प्रोपेनेसल्फोनिक एसिड से मिलकर 100 एमएल वॉश बफर (डब्ल्यूबी) तैयार करें। NaOH के साथ पीएच 7.2 करने के लिए समायोजित करें और निस्पंदन द्वारा बाँझ।
    नोट: यह ईबी और WB DEPC का उपयोग कर तैयार करने के लिए सुझाव दिया है deionized एच2हे इलाज.
  5. परागण के बाद 11-20 दिनों में 20 ग्राम विकासशील गुठली लीजिए (डीएपी) बर्फ पर रखा एक 50-एमएल ट्यूब करने के लिए, और फिर पूर्व ठंडा मोर्टार के लिए गुठली हस्तांतरण।
    नोट: ईबी के 100 एमएल से 20 ग्राम मक्का के दानों के अनुपात का प्रयोग करें।
  6. प्रत्येक मोर्टार में 10-20 एमएल बर्फ-ठंडा ईबी डालें, और गुठली को पूरी तरह से पीस लें।
  7. अधिक ईबी जोड़ें, और फिल्टर कपड़े की दो परतों के माध्यम से जमीन के ऊतकों को फ़िल्टर करें (सामग्री की तालिका)।
  8. 10 मिनट के लिए 8,000 x ग्राम पर छानना centrifuge, और गोली त्यागें.
  9. एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण, और यह 20,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए centrifuge.
  10. supernatant बंद डालो, और 6 एमएल WB में गोली resuspend.
  11. अलीकोट पांच 1.5 एमएल RNase मुक्त ट्यूबों के लिए निलंबन, और उन्हें 5 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर centrifuge.
  12. सुपरनेटेंट को छोड़ दें, तरल नाइट्रोजन में माइटोकोंड्रिल गोली को फ्रीज करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. Mitochondrial आरएनए का निष्कर्षण

  1. एक वाणिज्यिक अभिकर्मक के साथ mitochondrial आरएनए निकालें (सामग्रीकीतालिका) निर्माण के निर्देशों के अनुसार.
    चेतावनी: इस अभिकर्मक में फीनॉल और ग्वानिडाइन आइसोथियोसाइनेट होता है। एक धूआं हुड में इसके साथ काम करते हैं, और प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनते हैं।
  2. DEPC-उपचारित deionized H2O में पृथक माइटोकोंड्रियाल आरएनए को भंग करें, और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिका) के साथ आरएनए एकाग्रता और शुद्धताकाअनुमान लगाते हैं।
    नोट: आम तौर पर, $250 ग्राम माइटोकोंड्रियाल आरएनए 20 ग्राम 15-डीएपी मक्का के दानों से प्राप्त किया जाता है।
  3. 1x TAE बफर (40 एमएम एसिटिक एसिड, 1mM EDTA), 1.5% agarose ( सामग्रीकी तालिका), और 1x परमाणु धुंधला डाई (सामग्री की तालिका) से बना एक agarose जेल तैयार करें।
  4. 10x लोडिंग बफर की एक उचित मात्रा जोड़ें (0.5% ब्रोमोफेनोल ब्लू, 0.5% xylene cyanol एफएफ, और 50% ग्लिसरॉल), और लोड mitochondrial आरएनए / लोड बफर मिश्रण पर 1.5% agarose जेल.
  5. 20-25 मिनट के लिए 5-6 V/cm पर 1x TAE बफर में जेल चलाने के लिए, और एक जेल प्रलेखन प्रणाली के साथ जेल इमेजिंग द्वारा mitochondrial आरएनए अखंडता का मूल्यांकन (सामग्री की तालिका) .
    नोट: दो अलग बैंड की उपस्थिति ($3,510 और $1,970 nt मक्का mitochondrial 26S और 18S RRNAs, क्रमशः के लिए) बरकरार mitochondrial आरएनए के लिए एक स्वीकार्य मानक है. संभावित अवक्रमण को बाहर करने के लिए, आरएनए अखंडता परिपत्रीकृत आरएनए तैयारी के कई चरणों के दौरान जांच की जानी चाहिए (चित्र 2)।

4. आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस उपचार

  1. आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस (तालिका और सामग्री) उपचार ( तालिका1) और 30-60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट की स्थापना करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए शुद्धि किट (सामग्री कीतालिका) के साथ 5' पॉलीफॉस्फेटाज-उपचारित आरएनए को पुनर्प्राप्त करें।
  3. 3.3 से 3.5 तक चरण दोहराएँ.

5. आरएनए परिपत्रीकरण

  1. 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित और गैर-उपचारित माइटोकोंड्रियाल आरएनए(तालिका 2) की समान मात्रा का उपयोग करके दो वृत्ताकार अभिक्रियाएँ तैयार कीतथा दोनों अभिक्रियाओं को 12-16 ज के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट की।
  2. चरण 4.2 में के रूप में एक ही किट का उपयोग कर स्वयं-ligated RNAs के दो सेट पुनर्प्राप्त करें।
    नोट: यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि केवल mitochondrial आरएनए का एक अंश स्वयं-ligated किया जाएगा, और बरामद आरएनए रैखिक और परिपत्र ीकृत प्रतिलिपि का एक मिश्रण होगा.
  3. 3.3 से 3.5 तक चरण दोहराएँ.

6. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. परिपत्रित 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित और गैर-उपचारित आरएनए (200 एनजी) की एक ही मात्रा से cDNAs के दो सेट संश्लेषित करें।
  2. 26S-CRT के बराबर अनुपात और 7 अन्य आरटी प्राइमर तक जोड़कर प्राइमर मिश्रण तैयार करें।
    नोट: प्राइमर मिश्रण की अंतिम सांद्रता 1 डिग्री सेल्सियस होनी चाहिए।
  3. सारणी 3में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को मिलाकर दो पूर्व मिश्रण तैयार करें, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें।
  4. दो आरटी अभिक्रिया प्रणालियों (सारणी 4) को इकट्ठा करें तथा उन्हें 50 मि के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर दोनों आर टी प्रतिक्रियाओं गर्मी, और फिर उन्हें बर्फ पर ठंडा.

7. सामान्यीकरण

  1. 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित या गैर-उपचारित आरएनए से व्युत्पन्न टेम्पलेट सीडीएनए की समान मात्रा को जोड़कर दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार करें, परिपत्रकृत 26S आरआरएनए (अर्थात 26S-CF1 और -CR1) आदि के 5'-3 जंक्शन के बगल में अलग-अलग प्राइमर।
  2. सारणी 6में वर्णित परिस्थितियों में तापीय चक्रक (सामग्री तालिका) में दो अभिक्रियाएँ चलाएँ .
  3. 1x TAE बफर, 1.0% agarose, और 1x परमाणु धुंधला डाई से बना एक agarose जेल तैयार करें।
  4. दो पीसीआर उत्पादों में से प्रत्येक के लिए 2 $L 10x लोडिंग बफर (0.5% ब्रोमोफेनोल ब्लू, 0.5% xylene cyanol एफएफ, और 50% ग्लिसरॉल) जोड़ें, और उन्हें जेल पर लोड करें।
  5. 30-40 मिनट के लिए 5-6 V/cm पर 1x TAE बफर में जेल चलाने के लिए, और यह कदम 3.5 के रूप में एक ही जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर छवि.
  6. कंप्यूटर सॉफ्टवेयर (सामग्री कीतालिका, चित्र 4A)का उपयोग कर दो पीसीआर उत्पादों की बहुतायत की तुलना करें, और यदि आवश्यक हो तो टेम्पलेट cDNAs की मात्रा बदलकर सामान्यीकरण का अनुकूलन।

8. पीसीआर प्रवर्धन

  1. लक्ष्य प्रतिलिपिकेके 5'-3 के संधि के बगल में सामान्यीकृत सीडीएए की उपयुक्त मात्रा और भिन्न-भिन्न प्राइमरों की एक जोड़ी जोड़कर पीसीआर अभिक्रियाओं के जोड़े तैयार करें (सारणी 7)।
    नोट: लक्ष्य प्रतिलिपि के पीसीआर प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया टेम्पलेट cDNAs की राशि 26S rRNA सामान्यीकरण परिणामों द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.
  2. सारणी 8में वर्णित प्रोग्राम के अनुसार पीसीआर अभिक्रियाएँ की ंवप्रतिकरें।
  3. चरण 7.3 से 7.5 करने के लिए दोहराएँ।
  4. नेस्टेड डाइवरजेंट प्राइमर में परिवर्तित करें, और चरण 8.1 और 8.2 दोहराकर पहले दौर PCR परिणामों की जाँच करें।
  5. चरण 7.3 से 7.5 करने के लिए दोहराएँ।
  6. एक जेल डीएनए वसूली किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करपीसीआर प्रवर्धन के दो दौर में दोहराया जा सकता है कि प्रमुख बैंड पुनर्प्राप्त करें।

9. ट्रांसस्क्रिप्ट टर्मिनी का निर्धारण

  1. मानक तकनीकों का उपयोग करके जेल-शुद्ध पीसीआर उत्पादों को एक कुंद-एंड वेक्टर (सामग्री कीतालिका) में क्लोन करें।
  2. लक्ष्य आवेषण युक्त सकारात्मक क्लोन का चयन करने के लिए कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन, और उन्हें व्यावसायिक रूप से अनुक्रम।
    नोट: परिवर्तनीय आकार के साथ आवेषण युक्त सकारात्मक क्लोन आमतौर पर एक बरामद बैंड से पाए जाते हैं क्योंकि संयंत्र माइटोकोंड्रियाल में कई स्थिर राज्य प्रतिलिपि विषम 5 और /या 3' समाप्त होता है1,12.
  3. जैव प्रौद्योगिकी सूचना (एन सीबीआई) के लिए राष्ट्रीय केंद्र के बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग कर मक्का mitochondrial जीनोम के साथ अनुक्रमण डेटा संरेखित करें। जीव चुनें "maize(taxid:4577)", और खोज डेटाबेस "न्यूक्लिओटाइड संग्रह (nr/
  4. परिपत्रीकृत प्रतिलिपि के 5'-3' जंक्शन का पता लगाएं, और 5' और 3' ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी की स्थिति निर्धारित करें।
  5. लक्ष्य प्रतिलिपिकेशों के आकार की गणना करें.

10. आरएनए जेल ब्लॉट हाइब्रिडाइजेशन द्वारा सीआरटी-पीसीआर मानचित्रण परिणामों का सत्यापन

नोट: आरएनए जेल ब्लॉट संकरण एक वाणिज्यिक किट (सामग्रीकीतालिका) का उपयोग करके किया जाता है जिसमें डिगोक्सीजेनिन (डीआईजी) और टी 7 आरएनए पॉलिमरेज, हाइब्रिडाइजेशन, और इम्यूनोलॉजिकल डिटेक्शन के साथ आरएनए के ट्रांसक्रिप्शन-लेबलिंग के लिए अभिकर्मक होते हैं। कृपया अधिक जानकारी के लिए इस किट में प्रदान किए गए प्रोटोकॉल को देखें। सुनिश्चित करें कि केवल RNase मुक्त उपकरण पूरी प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. डीएनए टुकड़ा आरएनए जांच तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया बढ़ाना, और यह चरण 9.1 में के रूप में एक ही वेक्टर के लिए क्लोन, जो एक T7 प्रमोटर 17 बीपी प्रविष्टि साइट के ऊपर होता है.
  2. उचित प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर के निर्माण linearize, एक डीएनए शुद्धि किट (सामग्रीकीतालिका) द्वारा linearized प्लाज्मिड ठीक है, और यह DEPC में भंग deionized एच2हे.
  3. लेबल आरएनए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट (सामग्री कीतालिका) द्वारा डीआईजी-11-यूटीपी के साथ जांच करता है।
  4. 10x MOPS बफर (0.2 एम एम एम एस पी एस, 50 एमएम ऐसीटेट, और 10 एमएम EDTA) के 500 एमएल तैयार DEPC का उपयोग कर deionized एच2ओ. NAOH द्वारा पीएच 7.0 के लिए समायोजित करें, और निस्पंदन द्वारा बाँझ।
  5. बढ़ते बफर (50% फॉर्मामिड, 6.2% फार्मेल्डिहाइड, 1x एमओपीएस, 10% ग्लिसरॉल, और 0.1% ब्रोमोफेनोल ब्लू) की 2-3 मात्राएं जोड़ें जो चरणों में तैयार किए गए माइटोकोंड्रियाल आरएनए में 3.1-3.3.
  6. 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए नमूना /लोडिंग बफर मिश्रण, और फिर 1 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा।
  7. एक विकृत agarose जेल तैयार (2% formaldehyde, 1.2% agarose, और 1x MOPS), और जेल के लिए आरएनए नमूना / लोड बफर मिश्रण लोड (1-2 g mitochondrial आरएनए प्रति अच्छी तरह से).
  8. $ 4 ज के लिए 3-4 V/cm पर 1x MOPS में जेल चलाएँ।
  9. 20x एसएससी के 2 एल (3 एम NaCl, 0.3 एम सोडियम साइट्रेट, पीएच 7.0) तैयार करें। यह 0.1% DEPC रात भर के साथ इलाज, और autoclave द्वारा बाँझ.
  10. 20x एसएससी (15 मिनट हर बार) में दो बार जेल कुल्ला, और 10-16 एच के लिए 20x एसएससी के साथ केशिका हस्तांतरण द्वारा एक नायलॉन झिल्ली (सामग्री की तालिका) के लिए जेल आरएनए हस्तांतरण।
  11. 30 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर पाक द्वारा झिल्ली के लिए आरएनए को ठीक करें।
  12. निर्माता के निर्देश के अनुसार आरएनएसंकरीकरण और इम्यूनोलॉजिकल डिटेक्शन को एक वाणिज्यिक किट (सामग्री तालिका) के साथ निष्पादित करें।

11. प्राथमिक और संसाधित 5 के भेदभाव समाप्त होता है

  1. सामान्यीकृत 5' पॉलीफॉस्फेटसे-उपचारित और गैर-उपचारित आरएनए से प्राप्त cRT-PCR उत्पादों की तुलना करके प्राथमिक और संसाधित 5' सिरों को भेदभाव करें।
    नोट: प्राथमिक प्रतिलिपियों के लिए, 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित आरएनए से पीसीआर उत्पादों की बहुतायत गैर-उपचारित समकक्ष से बहुत अधिक है (चित्र 1, 'जीन ए,' और चित्र 4क)। तथापि, प्रसंस्कृत प्रतिलिपियों के लिए, पीसीआर उत्पादों का एक तुलनीय स्तर माइटोकोंड्रियाल आरएनए के दो सेटों से परिलक्षित होगा (चित्र 1, 'जीन बी')।
  2. cRT-PCR मैपिंग परिणामों के आधार पर RT-QPCR प्राइमर डिज़ाइन करें।
  3. RT-QPCR द्वारा cRT-PCR भेदभाव परिणामों की जाँच करें।
    नोट: 5' पॉलीफॉस्फेटस से प्राप्त दो सी डीएनए नमूनों का इलाज किया गया और गैर-उपचारित आरएनए को 26एस परिपक्व आरआरएनए के आरटी-क्यूपीसीआर उत्पादों द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है।

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Representative Results

माइटोकोंड्रियाल आरएनए परिपत्रीकरण दक्षता का अनुमान

पिछले एक अध्ययन में, दोनों कुल और mitochondrial RNAs Arabidopsis में mitochondrial प्रतिलिपि टर्मिनी के cRT-पीसीआर मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया (Arabidopsis thaliana), और आरएनए के दो प्रकार के समान मानचित्रण परिणामदिया 12. प्रारंभ में, हमने मक्का में माइटोकोंड्रियाल ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी की सीआरटी-पीसीआर मानचित्रण के लिए कुल आरएनए का भी उपयोग किया। कई परीक्षणों के बाद, हमने पाया कि लक्ष्य प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए मुश्किल थे. एक सुधार के रूप में, हम मक्का के विकास गुठली से mitochondrial आरएनए समृद्ध है, और यह पीसीआर के एक दौर में परिपत्र लक्ष्य प्रतिलिपि के प्रवर्धन संभव बना दिया.

संवर्धन के बाद लक्ष्य प्रतिलिपियों के आसान प्रवर्धन की व्याख्या करने के लिए, हमने प्रतिनिधि माइटोकोंड्रियाल जीन नाद5 पर आरटी-पीसीआर का प्रदर्शन करके आरएनए परिपत्रीकरण दक्षताका अनुमान लगाया था (चित्र 3 और चित्र S2)। मक्का nad5 जीन दो ट्रांसहोता है - और दो cis-splicing introns. कुल और mitochondrial आरएनए के आत्म-लिगेशन के बाद, पहले किनारा cDNAs स्वतंत्र रूप से nad5-RT1 और -RT2 प्राइमर का उपयोग कर संश्लेषित किया गया। दो प्राइमर रैखिक और वृत्ताकार nad5 mRNAs (चित्र S2) दोनों प्रतिलेखन को उलट सकते हैं। पीसीआर प्रवर्धन के लिए चार जोड़े का उपयोग पीसीआर प्रवर्धन के लिए किया जाता है: अर्द्ध-मात्रात्मक आरटी-पीसीआर (आरटी-एसक्यूपीसीआर) के लिए वर्गएफ 1 और वर्ग आर 1 और वर्ग एफ आर 2 और एसक्यूआर2 आरटी-क्यूपीसीआर के लिए। nad5-RT1 द्वारा लिखित cDNAs के लिए, प्राइमर के सभी चार जोड़े दोनों परिपत्र और रैखिक nad5 परिपक्व mRNAs का पता चला; nad5-RT2 रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए, वर्ग 2 और वर्ग 2 और QF2 और QR2 MRNA के दोनों रूपों का सर्वेक्षण किया, जबकि वर्ग F1 और वर्ग 1 और QF1 और QR1 पीसीआर उत्पादों परिपत्रnad5 से ही प्राप्त किए गए थे. इस विश्लेषण के आधार पर, हमने वर्गएफ 2 और वर्ग 2 (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) और क्यूएफ 2 और क्यूआर2 (आरटी-क्यूपीसीआर के लिए) पीसीआर उत्पादों का उपयोग nad5-RT1 और -RT2 रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं को सामान्य करने के लिए किया है, और परिपत्र ित nad5 के अनुपात का अनुमान लगाया वर्गएफ 1 और वर्ग आर 1 (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) या क्यूएफ 1 और क्यूआर1 (आरटी-क्यूपीसीआर के लिए) पीसीआर उत्पादों। आत्म-लिगेशन से पहले, आरएनए को आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटेस द्वारा आरएनए लिगेस द्वारा सर्कुलराइजेशन के लिए सभी ट्रांसक्रिप्ट्स उपलब्ध कराने के लिए पूर्व-उपचार किया गया था। आरटी-वर्गपीसीआर विश्लेषण से पता चला कि नाद5 एमआरएनए का एक बहुत छोटा सा अंश तब परिपत्रीकृत किया गया था जब कुल आरएनए का उपयोग किया गया था, लेकिन जब समृद्ध माइटोकोंड्रियाल आरएनए का उपयोग किया गया था तो अनुपात नाटकीय रूप से बढ़ गया था (चित्र 3 बी)। आरटी-क्यूपीसीआर परिणामों से पता चला है कि संवर्धन के बाद स्व-लिटेड नाड5 एमआरएनए का अनुपात 3.7% से बढ़कर 32% हो गया है (चित्र 3 C)। nad1 के विश्लेषण इसी तरह के परिणाम दिया है, और nad1 MRNA के परिपत्र दक्षता 0.7% से 30% तक वृद्धि हुई (चित्र 3 डी-एफ) .

इन विश्लेषणों के अनुसार, सुधार के बाद लगभग 30% मक्का माइटोकोंड्रियाल आरएनए आत्म-लक्षित थे, और बढ़ी हुई सर्कुलेशन दक्षता cRT-पीसीआर द्वारा लक्ष्य प्रतिलिपिका आसान पता लगाने के बारे में बताती है।

मक्का का निर्धारण कॉक्स2 सीआरटी-पीसीआर-आधारित रणनीति का उपयोग करके MRNA टर्मिनी

हमने cRT-PCR-आधारित कार्यनीति का उपयोग करके मक्का माइटोकोंड्रियाल ट्रांसक्रिप्ट्स की मैपिंग और भेदभाव को लागू करने के लिए एक उदाहरण के रूप में कॉक्स2 जीन का उपयोग किया ( चित्र 4)।

मानचित्रण cox2 MRNA की शुरुआत में, तीन जावक-फ़ेसिंग प्राइमर CF1, CF2, और CR1 जीन कोडिंग क्षेत्र पर डिजाइन किए गए थे (चित्र 4D)। CF1 और CF2 नेस्टेड प्राइमर थे, और CF2 CF1 के 69 बीपी डाउनस्ट्रीम था। टेम्पलेट CDNAs चरणों में संश्लेषित का उपयोग करना 6.1-6.5 और चरणों में सामान्यीकृत 7.1-7.6, CF1 और CR1 प्राइमर जोड़ी दो प्रमुख बैंड प्रवर्धित, और प्रवर्धन परिणाम नेस्टेड प्राइमर CF2 और CR1 (चित्र 4A) द्वारा दोहराया गया . इसके अलावा, दो बैंड दृढ़ता से 5' polyphsophatase इलाज आरएनए से परिलक्षित थे, जबकि वे गैर इलाज समकक्ष में पता लगाने के लिए मुश्किल थे, सुझाव है कि वे आरएनए के प्रति संवेदनशील हैं 5' polyphsophatase और प्राथमिक 5' शब्दावली है.

दो उम्मीदवार बैंड cox2-1 और -2 नाम थे, और वे agarose जेल से स्वतंत्र रूप से बरामद किया गया और वेक्टर में क्लोन. कालोनी पीसीआर परिणामों से पता चला है कि सकारात्मक क्लोनचर आकार के साथ आवेषण होते हैं, जिसका अर्थ है विषम 5' और /या 3' ट्रांसक्रिप्ट्स की टर्मिनी (चित्र 5)। सकारात्मक क्लोन व्यावसायिक रूप से अनुक्रम थे, और अनुक्रमण डेटा के रूप में कदम 9.3 में वर्णित मक्का mitochondrial जीनोम के साथ गठबंधन किया गया.

अनुक्रमण और संरेखण परिणामसे पता चला कि दो प्रतिलिपि 3' सिरों पर समान थे, लेकिन 5 की लंबाई में अलग UTRs (चित्र 4D)। cox2-1 और -2 के 5 ' सिरों 992-1,030 और 1,276-1,283 AUG के upstream में समृद्ध थे, क्रमशः, जबकि उनके 3' अंत था 39 बंद codon के nt downstream. cRT-PCR परिणामों से वंचित, cox2-1 और -2 की गणना आकार क्रमशः 1,804-1,832 और 2,088-2,095 nt थे.

cRT-PCR मानचित्रण परिणामों को सत्यापित करने के लिए, आरएनए जेल धब्बा संकरण cox2 जीन कोडिंग क्षेत्र से व्युत्पन्न जांच का उपयोग करके किया गया था, और cox2-1 और -2 के रूप में समान आकार के साथ दो प्रमुख बैंड का पता लगाया गया (चित्र 4C)। इसके अतिरिक्त, दो बड़े बैंड के बारे में 2,500 और 2,800 nt उत्तरी दाग में पाया गया, लेकिन वे cRT-पीसीआर द्वारा परिलक्षित नहीं थे. दो बड़े बैंड cox2-3 और -4, क्रमशः के रूप में नामित किया गया. उन्हें नक्शा करने के लिए, एक और दो जावक का सामना करना पड़ प्राइमर (यानी CR2 और CF3), पर लंगर डाले 5' और 3' cox2-2 के UTRs, डिजाइन किए गए थे, और उनकी स्थिति cox2-3 और -4 की उम्मीद प्रतिलिपि समाप्त होता है के करीब थे. प्राइमर युग्म CF3 और CR2 का उपयोग करते हुए, दो प्रमुख बैंड ों को सीडीएनए से दृढ़ता से परिलक्षित किया गया जो 5' पॉलीफसोफैटेस-उपचारित आरएनए से प्राप्त होते हैं, लेकिन गैर-उपचारित प्रतिपक्ष से नहीं (चित्र 4क)। अनुक्रमण परिणाम से पता चला कि वे समान था 5' टर्मिनी जबकि चर 3' समाप्त होता है. दो प्रतिलिपियों का परिकलित आकार क्रमशः 2,512/2,513 और 2,833-2,835 nt थे, और वे उत्तरी दाग में पाए गए दो बड़े बैंडों के साथ आकार में बंद थे। इसके अलावा, cRT-पीसीआर परिणामों का सुझाव दिया है कि कॉक्स2-3 और -4 प्राथमिक है 5' टर्मिनी.

भेदभाव के परिणामों की पुष्टि करने के लिए, पांच जावक-फ़ेसिंग प्राइमर को सीआरटी-पीसीआर मैपिंग परिणामों के अनुसार डिजाइन किया गया था, अर्थात क्यूसीएफ1, क्यूसीएफ2, क्यूसीआर2, और क्यूसीआर3, और प्राइमर जोड़े ुसीएफ1 और क्यूसीआर1, क्यूसीएफ1 और क्यूसीआर2, क्यूसीएफ1 और क्यूसीआर3, और क्यूसीएफ1 और क्यूसीआर3 का उपयोग किया गया था। cox2-1, -2, -3, और -4, क्रमशः के आरटी-QPCR विश्लेषण। 5' polyphsophatase-उपचार नमूना में सभी चार आरटी-QPCR उत्पादों के रिश्तेदार बहुतायत बहुत अधिक है कि गैर इलाज समकक्ष में उन है, जो cRT-पीसीआर भेदभाव परिणामों की पुष्टि करता है.

सारांश में, मक्का cox2 जीन की प्रतिलिपि पैटर्न जटिल है, और cRT-पीसीआर आधारित रणनीति प्रभावी ढंग से भेदभाव और cox2 mrna के कई isoforms नक्शे.

Figure 1
चित्र 1: cRT-PCR-आधारित रणनीति का ओवरव्यू. cRT-PCR-आधारित रणनीति के प्रमुख चरणों का उदाहरण। 5'+ और 5'- - आरएनए के दो नमूनों का उपचार किया गया और क्रमशः आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस द्वारा गैर-उपचार किया गया। दो cDNA नमूने से व्युत्पन्न 5' polyphosphatase इलाज और गैर इलाज आरएनए मक्का में 26S परिपक्व RRNA द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं, और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि cRT-पीसीआर उत्पादों की तुलना द्वारा भेदभाव कर रहे हैं. जीन ए के लिए, इसी आरएनए एक प्राथमिक है 5' अंत क्योंकि पीसीआर उत्पाद बहुतायत से 5' polyphosphatase इलाज आरएनए गैर इलाज समकक्ष से बहुत अधिक है; जीन बी के लिए, mitochondrial आरएनए के दो सेट से पीसीआर उत्पादों को एक तुलनीय स्तर पर परिलक्षित कर रहे हैं, इसी आरएनए के एक संसाधित 5' टर्मिनस जिसका अर्थ है। कोडिंग क्षेत्र और UTRs क्रमशः ग्रे बॉक्स और बोल्ड लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए CRT - प्राइमर; CF1, CF2, CR1, और CR2 - पीसीआर प्राइमर परिपत्र प्रतिलिपि के 5'-3' जंक्शन के बगल में; क्यूसीएफ और क्यूसीआर आरटी-क्यूपीसीआर के लिए अलग-अलग प्राइमर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एग्रोस जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा माइटोकोंड्रियाल आरएनए अखंडता का मूल्यांकन। (क) 15-डीएपी मक्का के दानों से तैयार माइटोकोंड्रियाल आरएनए। एम जेड डीएनए आणविक मार्कर. (बी) कर्नेल माइटोकोंड्रियाल आरएनए उपचार के बाद 5' पॉलीफॉस्फेटेस और/ 5'+ ] माइटोकोंड्रियाल आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस द्वारा उपचार के बाद; T4 और 5'+ ] mitochondrial आरएनए द्वारा उपचार के बाद 5' polyphosphatase और T4 आरएनए लिगेस द्वारा परिपत्र; T4 और 5'- ] केवल परिपत्रीकरण के बाद mitochondrial आरएनए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आरटी-पीसीआर द्वारा अनुमानित नाद5 और नाद1 एमआरनए की परिपत्रीकरण दक्षता। (ए) और (घ ) क्रमशः नाद5 और नाद1 जीनों का योजनाबद्ध आरेख। एक्सजेड एक्सऑन। Exons और introns क्रमशः ग्रे बक्से और घुमावदार लाइनों के रूप में दिखाए जाते हैं। रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर RT1 और RT2 की स्थिति तीर द्वारा संकेत दिया जाता है. काले डॉट्स पीसीआर प्राइमर की स्थिति से संकेत मिलता है, और पीसीआर उत्पादों की भविष्यवाणी आकार दिखाया गया है। वर्गएफ 1, वर्ग एफ 2, वर्ग आर 1, और वर्ग 2 आरटी-वर्गपीसीआर के लिए प्राइमर हैं; ुF1, ुF2, ुR1, और ुR2 RT-QPCR के लिए प्राइमर हैं। (ठ) और (ई) क्रमशः नाद5 और नाद1 एमआरनए के परिपत्रीकरण दक्षता का आरटी-वर्गपीसीआर विश्लेषण। एम जेड डीएनए आणविक मार्कर. (ग) और (च ) नद5 और नाद1 एमआरनए के परिपत्रीकरण दक्षता का क्रमशः आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण। आरटी1 और आरटी2 प्राइमर द्वारा लिखित दो सीडीएएनए नमूने वर्ग 2 और वर्ग 2 (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) या क्यूएफ 2 और क्यूआर2 (आरटी-क्यूपीसीआर के लिए) पीसीआर उत्पादों द्वारा सामान्यीकृत हैं। nad5 और nad1 mRNAs के परिपत्रदक्षता वर्ग 1 और वर्ग 1 (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) या QF1 और QR1 (आरटी-QPCR के लिए) के पीसीआर उत्पादों की तुलना द्वारा अनुमान लगाया गया है। RT2 अभिक्रिया में ुF2 एवं ुR2 पर ुF1 एवं ुR1 तथा ुF1 तथा ुR1 पर ुF2 तथा ुR2 पर RT1 अभिक्रिया में ुF1 एवं ुR1 पर ुF1 एवं ुR1 पर ुF1 एवं ुR1 मान तीन जैविक प्रतिकृति के साधन और एसडी हैं। 5 "त्रिफॉस्फेट द्वारा संभावित प्रभाव को बाहर करने के लिए, आरएनए आत्म-लिगेशन से पहले 5" पॉलीफॉस्फेट द्वारा इलाज किया गया था। कुल और Mito - कुल और mitochondrial आरएनए, क्रमशः. RT1 और RT2 - cDNAs रिवर्स RT1 और RT2 प्राइमर्स द्वारा लिखित, क्रमशः कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 4
चित्रा 4: cRT-PCR-cased रणनीति का उपयोग करके cox2 परिपक्व MRNA टर्मिनी का मानचित्रण. (क) कॉक्स2 सीआरटी-पीसीआर उत्पादों का जेल पृथक्करण। + और - [ सीडीएनएएस क्रमशः 5" पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित और गैर-उपचारित माइटोकोंड्रियाल आरएनए से प्राप्त होते हैं। दो सी डी ए एन ए नमूनों को 26एस सीडीएएनए (26 एस) के प्रवर्धन द्वारा सामान्यीकृत किया गया था . पांच प्राइमर परिपत्रित cox2 mRNA के cRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है: CF1, CF2, और CF3 नेस्टेड प्राइमर हैं, और CF2 और CF3 क्रमशः CF1 के 69 और 138 बीपी डाउनस्ट्रीम हैं; CR1 और CR2 नेस्टेड प्राइमर हैं, और CR2 CR1 के ऊपर 1,288 बीपी है। '1' और '2' द्वारा इंगित बैंड दोनों CF1 और CR1 और CF2 और CR1 द्वारा परिलक्षित किया गया, जबकि '3' और '4' बैंड CF3 और CR2 द्वारा परिलक्षित किया गया. बैंड के सभी चार क्लोनिंग द्वारा अनुक्रम थे. तारांकन द्वारा चिह्नित बैंड दोहराया नहीं जा सका, और उन्हें परिणामों से बाहर रखा गया. एम जेड डीएनए आणविक मार्कर. (ख) 5' पॉलीफॉस्फेट उपचार के बाद परिपत्रित कॉक्स2 एमआरएनए के सापेक्ष बहुतायत का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण। दो cDNA नमूने 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT, और बराबर अनुपात में cox1-CRT युक्त एक प्राइमर मिश्रण द्वारा संश्लेषित किया गया था, और 26S परिपक्व RRNA से cDNA व्युत्पन्न सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था. +/- ] cox2 पर 26S इलाज नमूना में / मान तीन जैविक प्रतिकृतियों के साधन और एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं। आरटी-क्यूपीसीआर के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर का संकेत दिया जाता है। (ग) कॉक्स2 टेपों का उत्तरी दाग विश्लेषण। 2 g mitochondrial आरएनए भरी हुई थी. cox2 परिपक्व MRNA के विभिन्न आइसोफॉर्म्स के लिए इसी बैंड चिह्नित कर रहे हैं. (डी) सीआरटी-पीसीआर परिणामों से आकर्षित cox2 MRNA की ट्रांसस्क्रिप्ट टर्मिनी। UTRs और खुले पढ़ने फ्रेम क्रमशः बोल्ड लाइनों और ग्रे बक्से के रूप में दिखाए जाते हैं. AUG (+1) और UAA (-1) के सापेक्ष 5' और 3' टर्मिनी की स्थिति और उन स्थितियों में अनुक्रम वाले एकल क्लोनों की संख्या दिखाई जाती है। रिवर्स प्रतिलेखन और पीसीआर प्रवर्धन प्राइमर की स्थिति क्रमशः बंद और खुले तीर सिर के रूप में दिखाए जाते हैं। आरटी-क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले बाहरी-फ़ेसिंग प्राइमर खुले वर्गों के रूप में दिखाए जाते हैं, और कॉक्स2 जांच की स्थिति के रूप में संकेत दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: कॉलोनी पीसीआर द्वारा cox2-4 सम्मिलित करता है युक्त सकारात्मक क्लोन का चयन। (ए) कालोनी पीसीआर cox2-4 आवेषण युक्त एकल क्लोन स्क्रीन करने के लिए। cox2-4 डालने के आकार के बारे में 1,165 बीपी है, और वेक्टर दृश्यों की है कि 100 बीपी है. कॉलोनी पीसीआर उत्पादों की गणना आकार के बारे में 1,265 बीपी है, और छोटे आकार के आवेषण युक्त उन क्लोन अनुक्रम नहीं थे, यानी, संख्या 11, 14, 22, और 23. (ख) (क) में जांचे गए सकारात्मक क्लोनों के अनुक्रमण परिणाम। 5'/3' समाप्त होता है - 5' और 3' AUG (+1) और UAA (-1) के सापेक्ष क्रमशः समाप्त होता है। वे दूसरों की तुलना में बहुत छोटे थे क्योंकि संख्या 12 और 20 के अनुक्रमण परिणाम बाहर रखा गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक 50 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया के लिए वॉल्यूम (जेडएल) अंतिम एकाग्रता
10x आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस बफर 5 1x
RNase अवरोधक (40 यू/ 0.75 0.6 यू/
माइटोकोंड्रिल आरएनए एक्स 0.2 ग्राम/
आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस (20 यू/ 2.5 1 U/जेडएल
DEPC-उपचारित deionized H2O 50 डिग्री सेल्सियस तक -

तालिका 1: आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटस उपचार के प्रतिक्रिया घटक।

घटक 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया के लिए वॉल्यूम (जेडएल) अंतिम एकाग्रता
10x T4 आरएनए लिगे मैं बफर २ 1x
डीएटीपी (1 मीटर) 1 50 डिग्री मी.
PEG8000 (50%) 6 15%
आरएनए अवरोधक (40 यू/ 0.5 1 U/जेडएल
5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित या गैर-उपचारित माइटोकोंड्रियाल आरएनए एक्स 0.1$0.2 ग्राम/
T4 आरएनए लिगेस मैं (30 यू / 0.4 0.6 यू/
DEPC-उपचारित deionized एच2हे करने के लिए 20 $L -

तालिका 2: माइटोकोंड्रियाल आरएनए परिपत्रीकरण के प्रतिक्रिया घटक।

घटक 10 डिग्री पूर्व मिश्रण के लिए वॉल्यूम (जेडएल)
प्राइमर मिश्रण (1 डिग्री एम कुल)एक २
डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम प्रत्येक) 1
परिपत्रित 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचारित या गैर-उपचारित माइटोकोंड्रियाल आरएनएख एक्स
DEPC-उपचारित deionized H2O करने के लिए 10 $L

तालिका 3: रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए पूर्व मिश्रण. एक प्राइमर मिश्रण में 26S-CRT का समान अनुपात होता है और 7 अन्य आरटी प्राइमर तक, और अंतिम सांद्रता 1 डिग्री सेल्सियस है, खदो पूर्व मिश्रण साथ-साथ तैयार किए जाते हैं, और उनमें एक ही राशि (200 एनजी) होती है जो परिपत्रकृत 5' पॉलीफॉस्फेटेज-उपचारित या गैर इलाज mitochondrial आरएनए.

घटक 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए वॉल्यूम (जेडएल) अंतिम एकाग्रता
टेम्पलेट आरएनए/प्राइमर/डीएनटीपी* 10 -
5x आरटीएस बफर 4 1x
RNase अवरोधक (40 यू/ 0.5 1 U/जेडएल
आरटीए (200 यू/ 1 10 यू/
DEPC-उपचारित deionized एच2हे करने के लिए 20 $L -

तालिका 4: रिवर्स प्रतिलेखन की प्रतिक्रिया घटक. * टेम्पलेट आरएनए/प्राइमर/डीएनटीपी पूर्व मिश्रण चरण 6.3 पर तैयार किया गया है।

घटक 20 डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए वॉल्यूम (जेडएल) अंतिम एकाग्रता
Deionized एच2हे 7 -
2x प्रतिक्रिया बफर 10 1x
डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम प्रत्येक) 0.4 0.2 एमएम प्रत्येक
26S-CF1 (10 डिग्री सेल्सियस) 0.8 0.4 एम.एम.
26S-CR1 (10 डिग्री सेल्सियस) 0.8 0.4 एम.एम.
टेम्पलेट्स cDNA परिपत्रित 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचार ित या गैर-उपचारित आरएनए से व्युत्पन्न * 0.6 -
डीएनए पॉलिमरेज (1 यू/ 0.4 0.02 यू/

तालिका 5: 26S cDNA के पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रतिक्रिया घटक. * प्रारंभ में, टेम्पलेट CDNAs (0.6 $L) के बराबर मात्रा सामान्यीकरण के लिए उपयोग किया जाता है. यदि आवश्यक हो, दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं के बीच 26S पीसीआर उत्पादों की एक ही बहुतायत सुनिश्चित करने के लिए टेम्पलेट cDNAs की मात्रा परिवर्तित करें।

चरण तापमान समय चक्र संख्या
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट 1 चक्र
विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 22-25 चक्र
प्राइमर अनीलन 56 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1 चक्र
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞ -

तालिका 6: पीसीआर शर्तों बढ़ाना करने के लिए 26 एस सामान्यीकरण के लिए cDNA.

घटक 20-$L प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए वॉल्यूम ($L) अंतिम एकाग्रता
Deionized H2O करने के लिए 20 $L -
2x प्रतिक्रिया बफर 10 1x
डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम प्रत्येक) 0.4 0.2 एमएम प्रत्येक
डाइवर्जेंट प्राइमर-फॉरवर्ड (10 डिग्री सेल्सियस) 0.8 0.4 एम.एम.
डाइवर्जेंट प्राइमर-रिवर्स (10 डिग्री सेल्सियस) 0.8 0.4 एम.एम.
टेम्पलेट cDNA परिपत्रित 5' पॉलीफॉस्फेटस-उपचार ित या गैर-उपचारित आरएनए से व्युत्पन्न * एक्स -
डीएनए पॉलिमरेज (1 यू/ 0.4 0.02 यू/

तालिका 7: परिपत्रीकृत लक्ष्य प्रतिलिपिकेगए PCR प्रवर्धन के लिए प्रतिक्रिया घटक. * इन प्रतिक्रियाओं में प्रयुक्त टेम्पलेट cDNAs की मात्रा 26S rRNA सामान्यीकरण परिणामों द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.

चरण तापमान समय चक्र संख्या
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट 1 चक्र
विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 22-40 चक्र ग
प्राइमर अनीलिंग एक 50-65 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड
एक्स्टेंशन b 72 डिग्री सेल्सियस 0.5-1 मिनट
फिनाल एक्सटेंशन 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1 चक्र
पकड़ 4 डिग्री सेल्सियस ∞ -

तालिका 8: PCR शर्तों लक्ष्य प्रतिलिपि बढ़ाना करने के लिए। एक सटीक अनायालिंग समशीतोष्ण पीसीआर प्राइमर के पिघलने के तापमान पर निर्भर करता है। ख दीर्घीकरण समय प्रवर्धित होने के लक्ष्य की लंबाई पर निर्भर करता है। अनुशंसित समय पीसीआर टुकड़ा के 1 बीबी प्रति 1 मिनट है। सी सामान्य में, 30 डिग्री 35 चक्र पीसीआर उत्पाद की एक पर्याप्त राशि का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त हैं. कम प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपि के लिए, अप करने के लिए चक्र की संख्या में वृद्धि 40 चक्र.

चित्रS1: प्रतिनिधि मक्का mitochondrial प्रतिलिपि के लिए प्राइमर की स्थिति. CRT - रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर; CF1, CF2, CR1, और CR2 - पीसीआर प्रवर्धन के लिए अलग प्राइमर; क्यूसीएफ और क्यूसीआर आरटी-क्यूपीसीआर के लिए अलग-अलग प्राइमर। मक्का nad2-1, rps4-1, और nad4-1 की प्रतिलिपि termini पहले निर्धारित किया गया है (जंग एट अल., 20191). AUG (+1) और स्टॉप कोडोन के अंतिम न्यूक्लिओटाइड (-1) के सापेक्ष 5'- और 3'-ends की स्थितियाँ दिखाई जाती हैं। कोडिंग क्षेत्रों और UTRs क्रमशः ग्रे बक्से और बोल्ड लाइनों के रूप में संकेत दिया जाता है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

चित्र ा2ः मक्का में नाद5 एमआरएनए की वृत्तीयकरण दक्षता का अनुमान लगाने का सिद्धांत। स्व-लिगेशन अभिक्रिया में, माइटोकोंड्रियाल आरएनए का केवल एक अंश परिपत्रीकृत होता है। परिपत्रित nad5 MRNA के अनुपात की गणना करने के लिए, दो जीन-विशिष्ट प्राइमर का उपयोग पहले किनारा सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए किया जाता है, अर्थात, nad5-RT1 और -RT2. nad5-RT2 रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) प्रतिक्रिया में, पीसीआर उत्पादों वर्ग 2 और वर्ग 2 द्वारा परिलक्षित (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) और QF2 और QR2 (आरटी-QPCR के लिए) दोनों रैखिक और परिपत्र nad5 से प्राप्त कर रहे हैं, जबकि वर्ग एफ 1 और वर्ग 1 (आरटी-वर्गपीसीआर के लिए) और QF1 और QR1 (आरटी-QPCR के लिए) पीसीआर उत्पादों परिपत्रित nad5 से ही प्राप्त कर रहे हैं; nad5-RT1 प्रतिक्रिया में, पीसीआर प्राइमर के सभी चार जोड़े nad5के दोनों रूपों बढ़ाना सकता है। परिपत्रित nad5 MRNA के अनुपात की गणना करने के लिए, दो प्रतिक्रियाओं वर्ग एफ 2 और वर्ग 2 या Qr2 और QR2 पीसीआर उत्पादों द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं। दो आर टी प्रतिक्रियाओं के बीच वर्गएफ 1 और वर्ग 1 या क्यूएफ 1 और क्यूआर1 पीसीआर उत्पादों की बहुतायत की तुलना करके, nad5 MRNA की परिपत्रीकरण दक्षता मोटे तौर पर अनुमान लगाया गया है। पूर्वार्णम् । Exons और introns क्रमशः ग्रे बक्से और घुमावदार लाइनों के रूप में दिखाए जाते हैं। nad5-RT1 और -RT2 प्राइमर की स्थिति तीर द्वारा संकेत दिया जाता है. काले डॉट्स पीसीआर प्राइमर की स्थिति से संकेत मिलता है, और पीसीआर उत्पादों की भविष्यवाणी आकार दिखाया गया है। इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका S1: प्राइमर जानकारी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक पिछले अध्ययन में, Arabidopsis के सेल निलंबन संस्कृति से कुल और mitochondrial आरएनए cRT-पीसीआर द्वारा mitochondrial प्रतिलिपि शब्दावली नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इसी तरह के परिणामप्राप्त किए गए 12. तथापि, केवल समृद्ध माइटोकोंड्रियाल आरएनए का उपयोग कई अन्य अध्ययनों1,2,39में माइटोकोंड्रियाल ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी को मैप करने के लिए किया जाता था। हमने पाया कि माइटोकोंड्रियाल आरएनए का संवर्धन मक्का में माइटोकोंड्रियाल ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी के सीआरटी-पीसीआर मानचित्रण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इस संवर्धन के बाद, परिपत्रकृत माइटोकोंड्रियाल आरएनए का अनुपात नाटकीय रूप से 0.3%-3.7% से बढ़कर $30% (चित्र3 और चित्र S2)हो जाता है, जो पीसीआर के एक दौर में परिपत्रीकृत लक्ष्य प्रतिलिपियों के प्रवर्धन को संभव बनाता है।

माइटोकोंड्रियाल आरएनए की गोलाकार दक्षता का अनुमान मक्का नाड1 और नाद5पर आरटी-पीसीआर विश्लेषण द्वारा लगाया गया था, जिनमें से दोनों को सिस-स्प्लिकिंग इनट्रॉन्स द्वारा स्वतंत्र अग्रदूतों में विभाजित किया गया है। क्योंकि अग्रदूत आरएनए की उपस्थिति से संभावित प्रभाव के साथ ही आरटी दक्षता की भिन्नता से इनकार नहीं किया जा सकता है, यह केवल वास्तविक mitochondrial आरएनए परिपत्र दक्षता का एक मोटा अनुमान है.

हमने माइटोकोंड्रियाल आरएनए और PEG8000 की सांद्रता को बदलकर आत्म-लिगेशन स्थितियों को बदल दिया, साथ ही ऊष्मायन समय को लंबा करके, लेकिन इन परिवर्तनों को माइटोकोंड्रियाल आरएनए परिपत्रीकरण दक्षता को प्रभावित नहीं किया। हालांकि हमें यकीन नहीं कर रहे हैं कि आगे Percoll ढाल शुद्धि परिपत्रीकरण दक्षता में वृद्धि कर सकता है, खंड 2 में तैयार कच्चे mitochondrion की गुणवत्ता मक्का में mitochondrial प्रतिलिपि टर्मिनी के cRT-पीसीआर मानचित्रण के लिए काफी अच्छा है. पीसीआर के कई दौर झूठी सकारात्मक परिणाम का कारण हो सकता है के बाद से, एक दौर पीसीआर में लक्ष्य प्रतिलिपि के प्रवर्धन मानचित्रण परिणाम और अधिक विश्वसनीय बनाता है.

प्राथमिक प्रतिलिपि के 5' triphosphate अस्थिर है, और यह करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है 5' अज्ञात कारणों के लिए मोनोफॉस्फेट. यह समस्या 5' ट्राइफॉस्फेट1,2,4की उपस्थिति/अभाव के आधार पर दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्राथमिक और संसाधित ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच स्पष्ट अंतर को बाधित करती है। मक्का 26S rRNA के परिपक्व रूप में एक मोनोफॉस्फेट 5' अंत है, और यह आरएनए 5' पॉलीफॉस्फेटकेस के प्रति असंवेदनशील है। अस्थिर 5' triphospahte के प्रभाव को कम करने के लिए, परिपक्व 26S rRNA दो आरएनए नमूनों को सामान्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इलाज और द्वारा इलाज नहीं 5' पॉलीफॉस्फेटस, और यह मक्का में प्रतिलिपि के दो प्रकार के अंतर करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम होना दिखाया गया है माइटोकोन्ड्रिओन। सामान्यीकरण के बाद, प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि cRT-PCR और आरटी-QPCR परिणामों की तुलना द्वारा भेदभाव किया जा सकता है 5' polyphosphatase इलाज और गैर इलाज आरएनए नमूने से प्राप्त. प्राथमिक प्रतिलिपि 5' polyphosphatase के प्रति संवेदनशील हैं, और वे दृढ़ता से से परिलक्षित कर रहे हैं 5' polyphosphatase-उपचारित नमूना लेकिन नहीं (या अस्थिर के कारण एक बहुत कम स्तर पर 5' triphosphate) गैर इलाज समकक्षी से. इसके विपरीत, संसाधित प्रतिलिपि दो नमूनों के बीच तुलनीय स्तर पर पाए जाते हैं.

पौधों में अनेक माइटोकोंड्रियाल जीनों के प्रतिलेखन पैटर्न जटिल1,2होते हैं। उदाहरण के लिए, मक्का nad6 और atp6 जीन दोनों monocistrons और dicistrons के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और nad6, atp6, और atp6-na6 परिपक्व mRNAs क्रमशः दो, तीन, और दो isoforms है. इसके अलावा, एक mitochondrial जीन की प्रतिलिपि आबादी वास्तव में अग्रदूत, परिपक्व, और गिरावट आरएनए का एक मिश्रण है. PCRs छोटे आकार के अणुओं बढ़ाना करने के लिए प्रवण हैं, और यह प्राइमर की एक जोड़ी का उपयोग कर सभी प्रतिलिपि isoforms का पता लगाने के लिए मुश्किल है. इसलिए, आरएनए जेल धब्बा संकरीकरण cRT-पीसीआर मानचित्रण परिणामों को सत्यापित करने के लिए आवश्यक है, और वैकल्पिक प्राइमर उत्तरी दाग में पता चला उन प्रतिलिपि बढ़ाना करने के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन पहली बार cRT-पीसीआर द्वारा नहीं।

इस प्रोटोकॉल cRT-PCR भेदभाव परिणामों को सत्यापित करने के लिए एक RT-QPCR चरण शामिल हैं। क्योंकि कुछ परिपक्व mRNAs के एकाधिक isoforms आकार में बहुत करीब हैं1, यह RT-QPCR द्वारा भेदभाव के परिणामों के सभी की पुष्टि करने के लिए असंभव है, और कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि इलाज के बीच cRT-पीसीआर परिणामों की तुलना द्वारा निर्धारित किए गए थे और गैर इलाज RNAs केवल.

इस प्रोटोकॉल में, लक्ष्य प्रतिलिपि की 5' और 3' टर्मिनी cRT-PCR उत्पादों की क्लोनिंग और अनुक्रम द्वारा मैप की गई थी, और यह अनुक्रम किए जाने के लिए एकल क्लोन की संख्या को सीमित करता है। एक वैकल्पिक विधि के रूप में, cRT-पीसीआर उत्पादों अगली पीढ़ी अनुक्रमण, जो स्थिर राज्य प्रतिलिपि का एक सेट के लिए अणुओं के हजारों दृश्यों द्वारा अनुक्रम किया जा सकता है, और मानचित्रण परिणाम अधिक सटीक होगा.

सीआरटी-पीसीआर और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा प्राथमिक और संसाधित 5' टर्मिनी के भेदभाव के अलावा, मोनोफॉस्फेट 5'टर्मिनी को आसपास के आरएनए माध्यमिक संरचनाओं 1,12की पहचान द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि आरएनए माध्यमिक संरचनाओं जैसे tRNA और टी-तत्व, आरएनसे पी और/या आरनेस के एंडोन्यूक्लिटिक क्लीवेज को निर्देशित करके माइटोकोंड्रियाल ट्रांसक्रिप्ट अंत गठन को मध्यस्थता कर सकते हैं , 20| इसलिए, उन 5' termini tRNA या टी-तत्व के निकट पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल प्रोसेसिंग से प्राप्त किया जाना चाहिए और मोनोफॉस्फेट होते हैं।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, स्थिर राज्य प्रतिलिपि का एक बड़ा हिस्सा मक्का mitochondria1में निर्धारित किया गया है. हालांकि, कुछ भेदभाव नहीं किया गया और/ इसके अलावा, हमें लगता है कि 5' ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी की स्थिति प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण द्वारा पुष्टि की जा करने के लिए बेहतर है, हालांकि यह इस प्रोटोकॉल में शामिल है. प्रायोगिक आंकड़ों की कमी के कारण हमें इस बात की जानकारी नहीं है कि यह रणनीति अन्य पादप प्रजातियों जैसे चावल (ओरिजा सैटाइवा) और अरबिडोप्सिसके लिए उपयुक्त है या नहीं . संयंत्र mitochondria के अलावा, दोनों प्राथमिक और प्रसंस्कृत प्रतिलिपि stably प्लास्टिड21में जमा कर रहे हैं, और यह अनिश्चित है कि क्या इस रणनीति के नक्शे और प्लास्टिड प्रतिलिपि भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31600250, वाई.जेड.), गुआंग्झू शहर की विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाओं (अनुदान संख्या 201804020015, एच.एन.) और चीन कृषि अनुसंधान प्रणाली (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था। CARS-04-PS09, एच.एन.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

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References

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एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति का उपयोग कर मक्का Mitochondrion में प्राथमिक और प्रसंस्कृत ट्रांसस्क्रिप्ट के भेदभाव और मानचित्रण
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Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng,… More

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

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