Summary
우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.
Abstract
식물 미토콘드리아에서, 몇몇 정상 상태 전사체는 전사 개시 (1 차 적인 전사체)에서 파생된 5' 삼인산염이 있고, 그 외는 5' 단인산염 생성 후 전사 (처리된 전사)를 포함합니다. 성적 증명서의 두 가지 유형을 구별하기 위해, 몇 가지 전략이 개발되었으며, 그들 대부분은 5 '삼인산염의 존재 / 부재에 따라 달라집니다. 그러나, 1 차 5'termini에 있는 삼인산염은 불안정하고, 녹취록의 2개의 모형의 명확한 차별을 방해합니다. 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 차별화하고 매핑하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포슈파타제 처리, 정량적 을 결합하여 원형 RT-PCR(cRT-PCR) 기반 전략을 개발했습니다. RT-PCR(RT-qPCR) 및 북부 블롯. 개선으로, 이 전략은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 RNA 정규화 단계를 포함한다.
이 프로토콜에서 농축 된 미토콘드리아 RNA는 RNA 5 '폴리포스파타제에 의해 전처리되어 5'삼중산염을 모노포스페이트로 변환합니다. 순환화 및 역전사 후, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA는 5' 말단을 처리하고 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않은 옥수수 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화된다. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 처리된 RNA로부터 수득된 cRT-PCR 및 RT-qPCR 제품을 비교하여 차별된다. 전사체 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 결정된 다음, 북부 블롯에 의해 검증된다.
이 전략을 사용 하 여, 옥수수 미토 콘 드리 온에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서 결정 되었습니다. 일부 미토콘드리아 유전자의 복잡한 전사체 패턴으로 인해, 몇몇 정상 상태 전사체는 북부 얼룩에서 검출되었지만 분화 및/또는 매핑되지 않았습니다. 우리는 이 전략이 다른 식물 미토콘드리아또는 석고에 있는 정상 상태 전사체를 차별하고 지도로 지도하기에 적당한지 확실하지 않습니다.
Introduction
식물 미토콘드리아에서, 많은 성숙및 전구체 RNA는 다중 이소형태로 축적되고, 정상 상태 전사체는 그들의 5' 끝에있는 차이에 기초하여 2개의 단으로 분할될 수 있습니다 1,2,3, 4. 1 차적인 전사는 전사 개시에서 파생되는 5' 삼인산염 끝이 있습니다. 대조적으로, 처리된 전사체는 전사 후 처리에 의해 생성된 5' 단인산염을 갖는다. 2가지 유형의 전사체의 차별 및 매핑은 전사 및 전사 말기 성숙의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 중요하다.
식물 미토콘드리아에서 1 차적인 및 가공된 전사체를 구별하기 위하여는, 4개의 중요한 전략이 개발되었습니다. 첫 번째 전략은 5'삼인산염을 모노포스페이트로 변환하고 RNA 리가제에 의해 원형화될 수 있도록 담배 산 열포스파타제(TAP)로 미토콘드리아 RNA를 미리 치료하는 것입니다. TAP 처리 및 비처리 RNA 샘플의 전사체 풍부는 cDNA 말단(RACE) 또는 원형 RT-PCR(cRT-PCR)의 신속한 증폭에 의해 비교된 후 2,3,4. 두 번째 전략에서, 처리된 전사체는 먼저 터미네이터 5'-인산염 의존성 외핵항 (TEX)을 사용하여 미토콘드리아 RNA로부터 고갈되고, 1차 적인 전사체는 프라이머 확장 분석 5, 6에 의해 매핑됩니다. . 세 번째 전략은 guanylyl 트랜스퍼라제를 사용하여 1차 전사체를 미리 캡을 씌우고, 트리포스피테5'의 위치는 리보누클레아제 또는 S1 뉴클레아제 보호 분석과 함께 프라이머 확장에 의해 결정되는7,8 ,9. 5' 삼인산염의 존재/부재에 따라 다른, 네 번째 전략은 시험관 내 전사, 사이트 지시 돌연변이 발생 및 프라이머 확장 분석을 결합하여 가양성 프로모터를 특성화하고 전사를 결정합니다. 개시 사이트8,10,11. 이러한 전략을 사용 하 여, 많은 기본 및 처리 된 전사체 식물 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다.
그러나, 몇몇 연구 결과는 1 차적인 전사체의 5' 삼인산염이 불안정했다는 것을 보고하고, 그(것)들은 알 수 없는 이유 2, 4,12,13를위해 monophosphate로 쉽게 변환되었다. 이 문제는 5'triphosphate의 존재/부재에 따라 기술을 사용하여 두 가지 유형의 성적 증명서의 명확한 차별을 방해하고, 공장에서 기본 및 처리 된 성적 증명서 를 체계적으로 구별하기위한 이전의 노력 미토콘드리아실패 2,12.
본 프로토콜에서, 우리는 옥수수에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 체계적으로 구별하기 위해 cRT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제처리, RT-qPCR 및 노던 블롯을 결합한다(그림 1). cRT-PCR은 RNA 분자의 5' 및 3'사지의 동시 매핑을 허용하며, 일반적으로 식물 2,12,14,15에서전사체 termini를 매핑하도록 조정된다. RNA 5' 폴리포스파타제는 트리포스피페테5' 테르미니에서 2개의 인산염을 제거할 수 있으며, 이는 RNA 리가제에 의한 자가 결찰을 위해 1차 전사체를 사용할 수 있게 한다. 이전 연구는 옥수수에서 성숙한 26S rRNA가 5'종기를 처리했다는 것을 보여주었고, RNA 5'polyphosphatase1,16에민감하지 않았습니다. 1차 5'termini에서 불안정한 삼인산염의 영향을 최소화하기 위해, 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA는 성숙한 26S rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 다음을 비교하여 분화됩니다. 2개의 RNA 샘플로부터 수득된 cRT-PCR 제품. cRT-PCR 매핑 및 판별 결과는 각각 노던 블롯과 RT-qPCR에 의해 검증됩니다. 마지막으로, 대체 프라이머는 cRT-PCR에 의해서가 아니라 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키는 데 사용된다. 이 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여, 옥수수 미토콘드리아에서 가장 꾸준한 상태 성적 증명서는 차별화되고 매핑된1.
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Protocol
1. 프라이머 디자인
- PCR 프라이머 설계 소프트웨어(표오브 머티리얼)를이용하여 역전사(RT)를 위한 유전자 특이적 프라이머를 프라이머설계(17)의일반적인 규칙에 기초한다.
참고: RT 프라이머는 표적 전사체에 매우 특이적이며, 이들은 일반적으로 5' 코딩 서열(성숙한 mRNA 및 전구체 RNA) 또는 예상된 5' 말단(18S 및 26S rRNA)의 ~500-600 nt 다운스트림에 고정된다. - cRT-PCR에 의해 원형 전사체를 증폭하기 위해 서로 다른 프라이머 쌍을 설계합니다.
참고: 쌍이 짝이 된 발산 프라이머는 원형 전사체의 5'-3' 접합을 측면에 있으며, 그들의 위치는 분석된 표적 전사체들 사이에서 다양합니다(그림 S1). 일부 성적 증명서에는 긴 UTR이 있습니다. 예를 들어 nad2 -1 5' UTR 및 rps4-1 3' UTR은 각각 1,985 및 1,826/1,834 nt입니다. 두 프라이머가 코딩 영역에 고정되어 있는 경우 대상 전사체를 증폭하기가 어렵습니다. 대조적으로, 일부 UTR은 짧습니다; 예를 들어 nad2-1 및 nad4-1의3' UTR은 각각 34/35 및29-31 nt입니다. 페어링된 프라이머가 코딩 시퀀스에서 멀리 떨어져 있으면 PCR이 실패합니다. 일반적으로, 발산 프라이머의 두 쌍은 각 표적 전사체를 위해 설계되고, 여러 쌍은 성적 증명서 패턴이 복잡하고/또는 UTR이 매우 긴 사람들을 매핑하는 데 필요할 수 있습니다. - 수렴 프라이머 쌍을 설계하여 북부 블롯에 대한 RNA 프로브를 준비합니다.
참고: 쌍프라이머는 표적 유전자의 코딩 영역에 위치하며, PCR 생성물의 크기는 100~ 1,000 bp의 범위여야 한다. 각 순방향 프라이머는 생성된 프로브에서 벡터 서열을 최소화하기 위해 제한 효소 부위를 포함해야 한다.
2. 옥수수 개발 커널에서 조잡한 미토콘드리온의 준비
- 오토클레이브로 유봉, 박격포, 유리 깔때기, 튜브 및 팁을 살균하고 오븐에서 건조시면 됩니다.
- 4°C 또는 얼음에서 모든 절차를 수행하고 모든 용액을 미리 식힙니다.
- 0.3 M 수크로오스, 5 mM 테트라나트륨 파이로포스페이트, 10 mM KH2PO 4,2 mM EDTA, 1% [w/v] 폴리비닐피롤리돈 40, 1% [w/v] 소 혈청 알부민, 5 mM L-se. KOH로 pH 7.3으로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.
- 0.3 M 수크로오스, 1 mM EGTA 및 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) 프로판설포닉 산으로 구성된 세척 완충제(WB)의 100 mL를 준비합니다. NaOH로 pH 7.2로 조정하고 여과에 의해 살균하십시오.
참고: DEPC 처리된 탈이온화된 H2 O를 사용하여EB 및 WB를 준비하는 것이 좋습니다. - 수분(DAP) 후 11-20일 후에 20g의 커널을 얼음 위에 놓은 50mL 튜브에 넣고 미리 냉각된 모르타르로 커널을 옮니다.
참고: EB 100 mL에서 옥수수 커널 20g의 비율을 사용합니다. - 각 박격포에 10-20 mL의 얼음 차가운 EB를 추가하고 커널을 완전히 갈아냅니다.
- EB를 더 추가하고 두 층의 필터 천(재료표)을 통해 접지 조직을 필터링합니다.
- 10 분 동안 8,000 x g의 여과액을 원심 분리하고 펠릿을 버립니다.
- 상급을 새 튜브로 옮기고 원심분리기를 20,000 x g에서 10분 동안 합니다.
- 상급체를 붓고 6 mL WB에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
- 5 개의 1.5 mL RNase 없는 튜브에 현탁액을 알리쿼트하고 5 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리합니다.
- 상류액을 버리고, 미토콘드리아 펠릿을 액체 질소에 얼린 다음 -80°C에서 보관합니다.
3. 미토콘드리아 RNA 추출
- 제조의 지시에 따라 상업용 시약(재료표)으로 미토콘드리아 RNA를 추출하십시오.
주의 사항: 이 시약에는 페놀과 구아니딘 이소티오차네이트가 함유되어 있습니다. 연기 후드에 함께 작업하고 실험실 코트와 장갑을 착용하십시오. - DEPC 처리된 탈이온화 H2O에서 단리된미토콘드리아 RNA를 용해시키고, 분광광도계(표오브물질)로 RNA 농도 및 순도를 추정한다.
참고: 일반적으로~ ~250 μg 미토콘드리아 RNA는 15-DAP 옥수수 커널 20 g으로부터 수득된다. - 1x TAE 버퍼(40 mM Tris, 20 mM 아세트산, 1mM EDTA), 1.5% 아가로즈(재료표) 및 1x 핵 염색 염료(재료표)로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.
- 10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안노 FF 및 50% 글리세롤)의 적절한 부피를 추가하고 1.5% 아가로즈 겔에 미토콘드리아 RNA/로딩 버퍼 혼합물을 로드합니다.
- 겔을 5-6 V/cm에서 20-25분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고, 겔 문서화 시스템(재료 표)으로 겔을 이미징하여 미토콘드리아 RNA 무결성을 평가합니다.
참고: 2개의 별개의 밴드 (~3,510 및 ~1,970 nt옥수수 미토콘드리아 26S 및 18S rRNAs에 대한)의 존재는 손상되지 않은 미토콘드리아 RNA에 대한 허용 가능한 표준이다. 가능한 분해를 배제하기 위해, RNA 무결성은 순환화된 RNA 제제의 여러 단계 동안 조사되어야 한다(그림 2).
4. RNA 5' 폴리포스파타제 치료
- RNA 5' 폴리포스파타제(표및재료) 처리(표 1)를 설정하고 37°C에서 30-60분 동안 배양한다.
- 제조사의 지시에 따라 RNA 정제 키트(재료 표)로 5' 폴리포스파타제 처리 RNA를 회수합니다.
- 3.3단계에서 3.5단계반복합니다.
5. RNA 순환화
- 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 미토콘드리아 RNA(표 2)의 동일한 양을사용하여 두 개의 원형 반응을 준비하고, 12-16시간 동안 16°C에서 두 반응을 배양한다.
- 4.2단계에서와 동일한 키트를 사용하여 두 세트의 자가 결찰 RNA를 복구합니다.
참고: 미토콘드리아 RNA의 일부만이 자가 결찰되고, 회수된 RNA는 선형 및 순환화된 전사체의 혼합물일 것이라는 점에 유의해야 한다. - 3.3단계에서 3.5단계반복합니다.
6. 역전사
- 동일한 양의 원형화된 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA(200 ng)에서 2세트의 cdNAs를 합성합니다.
- 26S-CRT와 최대 7개의 다른 RT 프라이머의 동일한 비율을 추가하여 프라이머 혼합물을 준비합니다.
참고: 프라이머 혼합물의 최종 농도는 1 μM이어야 한다. - 표3에 열거된 시약을 조합하여 2개의 프리믹스를 준비하고, 65°C에서 5분 동안 배양한 다음, 2분 동안 얼음에 식힌다.
- 두 개의 RT 반응시스템(표 4)을 조립하고 42°C에서 50분 동안 배양합니다.
- 두 RT 반응을 70°C에서 5분 간 가열한 다음 얼음에서 식힙니다.
7. 정상화
- 5' 폴리포스파타스 처리 또는 비처리 RNA로부터 유래된 템플릿 cDNA의 동일한 부피를 추가하여 두 개의 PCR 반응을 준비하였고, 5'-3' 원형26S rRNA의 접합부(즉, 26S-CF1및 -CR1) 등을 측면에 있는 발산 프라이머를 나타낸다(표 5).
- 표6에 설명된 조건하에서 열 사이클러(재료 표)에서 두 반응을 실행합니다.
- 1x TAE 완충제, 1.0% 아가로즈 및 1x 핵 염색 염료로 구성된 아가로즈 젤 1개를 준비합니다.
- 2 μL 10x 로딩 버퍼(0.5% 브로모페놀 블루, 0.5% 자일렌 시안액 FF 및 50% 글리세롤)를 두 PCR 제품 각각에 넣고 젤에 로드합니다.
- 젤을 5-6V/cm에서 30-40분 동안 1x TAE 버퍼로 실행하고 3.5단계와 동일한 젤 문서 시스템을 사용하여 이미지화합니다.
- 컴퓨터 소프트웨어(재료표,그림 4A)를 사용하여 두 PCR 제품의 풍부도를 비교하고 필요한 경우 템플릿 cdnAs의 양을 변경하여 정규화를 최적화합니다.
8. PCR 증폭
- 정규화된 cdNAs의 적절한 부피와 표적 전사체의 5'-3' 접합을 측면으로 하는 한 쌍의 발산 프라이머를 추가하여 PCR 반응 쌍을 준비한다(표 7).
참고: 표적 전사체의 PCR 증폭에 사용되는 템플릿 cDNAs의 양은 26S rRNA 정규화 결과에 의해 결정된다. - 표8에 기재된 프로그램에 따라 PCR 반응을 수행한다.
- 7.3단계에서 7.5단계반복합니다.
- 중첩된 분산 프라이머로 변경하고 8.1 단계와 8.2 단계를 반복하여 첫 번째 라운드 PCR 결과를 확인합니다.
- 7.3단계에서 7.5단계반복합니다.
- 겔 DNA 회수 키트(물자 표)를 이용하여 2회 PCR증폭을 반복할 수 있는 저명밴드를 회수한다.
9. 성적 증명서 테르미니의 결정
- 표준 기술을 사용하여 젤 정제 된 PCR 제품을무딘 엔드 벡터 (재료 표)로 복제하십시오.
- 콜로니 PCR을 수행하여 대상 인서트를 포함하는 포지티브 클론을 선택하고 상업적으로 시퀀싱합니다.
참고: 가변 크기의 인서트를 함유하는 포지티브 클론은 일반적으로 식물 미토콘드리아의 많은 정상 상태 전사체가 이기종 5' 및/또는 3'끝1,12를갖기 때문에 단일 회수 대역에서 검출된다. - 미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)의 기본 로컬 정렬 검색 도구(BLAST)를 사용하여 시퀀싱 데이터를 옥수수 미토콘드리아 게놈과 정렬합니다. 유기체 "옥수수 (taxid:4577)"를 선택하고 데이터베이스 "뉴클레오티드 수집 (nr / nt)"을 검색합니다.
- 원형 전사체의 5'-3' 접합을 찾아, 5' 및 3' 전사체 termini의 위치를 결정한다.
- 대상 성적표의 크기를 계산합니다.
10. RNA 젤 블롯 혼성화에 의한 cRT-PCR 매핑 결과 검증
참고: RNA 겔 블롯 혼성화는 디곡시게닌(DIG) 및 T7 RNA 폴리머라제, 혼성화 및 면역학적 검출을 이용한 RNA의 전사 라벨링을 위한 시약을 포함하는 상용 키트(TableofMaterials)를 이용하여 수행된다. 자세한 내용은 이 키트에 제공된 프로토콜을 참조하십시오. RNase 무료 장비만 전체 절차에 사용되었는지 확인하십시오.
- RNA 프로브를 준비하는 데 사용되는 DNA 단편을 증폭시키고, 삽입 부위의 T7 프로모터 17 bp 상류를 포함하는 단계 9.1에서와 동일한 벡터로 복제한다.
- 적절한 제한 효소를 사용하여 구성을 선형화하고, DNA 정제 키트(TableofMaterials)에 의해 선형화된 플라스미드를 회수하고, DEPC 처리된 탈이온화H2O에용해시켰다.
- 제조업체의 지침에 따라 상용 키트(재료 표)에의해 DIG-11-UTP가 있는 라벨 RNA 프로브.
- DEPC 처리된 탈이온화 H2O.를 사용하여 10x MOPS 완충액(0.2M MOPS, 50 mM 아세테이트 및 10 mM EDTA)의 500 mL를 준비하고, NaOH에 의해 pH 7.0으로 조정하고, 여과에 의해 살균한다.
- 단계 3.1-3.3에서 제조된 미토콘드리아 RNA에 2-3부량의 로딩 버퍼(포름아마미드 50%, 포름알데히드 6.2%, MOPS 10%, 글리세롤 10%, 브로모페놀 블루 0.1%)를 추가합니다.
- RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 65°C에서 10분 동안 변성한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다.
- 변성 아가로즈 겔(포름알데히드 2%, 아가로즈 1.2%, MOPS 1회)을 준비하고 RNA 샘플/로딩 버퍼 혼합물을 젤(잘 당 1-2 μg 미토콘드리아 RNA)에 로드합니다.
- ~ 4 시간 동안 3-4 V / cm에서 1 x MOPS에서 젤을 실행합니다.
- 20x SSC 2 L (3 M NaCl, 0.3 M 구연산나트륨, pH 7.0)을 준비합니다. 하룻밤 동안 0.1 % DEPC로 처리하고 오토 클레이브로 살균하십시오.
- 젤을 20x SSC(매회 15분)로 2회 헹구고, 젤 RNA를 나일론 멤브레인(재료 표)으로 10-16시간 동안 20x SSC로 모세관 이송하여 옮기세요.
- 30 분 동안 120 °C에서 베이킹하여 멤브레인에 RNA를 고정시킵니다.
- 제조사의 지시에 따라 상용 키트(재료표)로 RNA 혼성화 및 면역학적 검출을 수행합니다.
11. 1차 및 처리된 5' 종료의 차별
- 정규화된 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 RNA로부터 얻어진 cRT-PCR 제품을 비교하여 1차 및 처리된 5' 말단을 구별한다.
참고: 1차 전사체에, 5' 폴리포스파타제 처리 RNA로부터의 PCR 생성물의 풍부성은 비처리대응물로부터보다 훨씬 높다(도 1, 'Gene A' 및 도 4A). 그러나, 처리된 전사체에, 유사한 수준의 PCR 생성물은 미토콘드리아 RNA의 두 세트로부터 증폭될 것이다(도1,'유전자 B'). - cRT-PCR 매핑 결과를 기반으로 RT-qPCR 프라이머를 설계합니다.
- RT-qPCR에 의한 cRT-PCR 판별 결과를 확인합니다.
참고: 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA 샘플은 26S 성숙한 rRNA의 RT-qPCR 제품에 의해 정규화된다.
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Representative Results
미토콘드리아 RNA 원형화 효율 추정
이전 연구에서, 총 및 미토콘드리아 RNA는 모두 애기장대에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑에 사용되었고(애기장대탈리아나),두 가지 유형의 RNA는 유사한 매핑 결과를12로주었다. 처음에, 우리는 또한 옥수수에 있는 미토콘드리아 전사체 termini의 cRT-PCR 매핑을 위한 총 RNA를 이용했습니다. 많은 시험 후에, 우리는 표적 성적 증명서가 검출하기 어렵다는 것을 것을을 발견했습니다. 개선으로, 우리는 옥수수 개발 커널에서 미토콘드리아 RNA를 풍부하게하고, 그것은 가능한 PCR의 한 라운드에서 원형 대상 전사체의 증폭을 했다.
농축 후 표적 전사체의 용이한 증폭을 설명하기 위해, 대표적인 미토콘드리아 유전자 nad5(도 3 및 도 S2)에서RT-PCRs를 수행함으로써 RNA 원형화 효율을 추정하였다. 옥수수 nad5 유전자는 2개의 트랜스를 포함합니다 - 2개의 시스-splicing 인트론. 총 및 미토콘드리아 RNA의 자가 결찰 후, 제1 가닥 cDNA는 nad5-RT1 및 -RT2 프라이머를 사용하여 독립적으로 합성되었다. 두 프라이머는 선형 및 순환 nad5 mRNAs (그림S2)를모두 전사 할 수 있습니다. PCR 증폭에는 4쌍의 컨버젠트 프라이머가 사용됩니다: sqF1&sqR1 및 sqF2&sqR2 반정적 RT-PCR(RT-sqPCR) 및 qF1&qR1 및 RT-qPCR용 qF2&qR2. nad5-RT1에 의해 전사된 cDNA의 경우, 프라이머의 네 쌍모두 원형 및 선형 nad5 성숙한 mRNAs를 모두 검출했습니다. nad5-RT2 역전사 반응의 경우, sqF2&sqR2 및 qF2&qR2는 두 가지 형태의 mRNA를 조사한 반면, sqF1&sqR1 및 qF1&qR1 PCR 제품은 순환형 nad5에서만 파생되었습니다. 이 분석을 바탕으로 sqF2&sqR2(RT-sqPCR용) 및 qF2&qR2(RT-qPCR용) PCR 제품을 사용하여 nad5-RT1 및 -RT2 역전사 반응을 정상화하고, 원형 nad5의 비율을 비교하여 추정했습니다. sqF1&sqR1(RT-sqPCR용) 또는 qF1&qR1(RT-qPCR용) PCR 제품. 자가 결찰에 앞서, RNA는 RNA 5' 폴리포스파타제에 의해 전처리되어 모든 전사체를 RNA 리가제에 의해 순환화할 수 있도록 하였다. RT-sqPCR 분석은 총 RNA가 사용될 때 nad5 mRNA의 아주 작은 분획이 원형화되었지만, 농축된 미토콘드리아 RNA를 사용했을 때 비율이 극적으로 증가하였다(도3B). RT-qPCR 결과는 농축 후 자가 결찰nad5 mRNA의 비율이 3.7%에서 32%로 증가하였다(도3C). nad1의 분석은 유사한 결과를 주었고, nad1 mRNA의 원형화 효율은 0.7%에서 30%로 증가하였다(도 3D-F).
이러한 분석에 따르면, 약 30% 옥수수 미토콘드리아 RNA는 개선 후 자가 결찰되었고, 증가된 원형화 효율은 cRT-PCR에 의한 표적 전사체의 용이한 검출을 설명한다.
옥수수의 결정 콕스2 cRT-PCR 기반 전략을 사용하는 mRNA 테르미니
우리는 cRT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아 전사체의 매핑 및 차별을 소개하는 예로 cox2 유전자를 사용하였다(그림 4).
cox2 mRNA 매핑의 시작 부분에서, 3개의 바깥쪽을 향한 프라이머 CF1, CF2 및 CR1은 유전자 코딩 영역에 설계되었다(도4D). CF1과 CF2는 프라이머중첩되었고 CF2는 CF1의 69bp 다운스트림이었습니다. 6.1-6.5단계로 합성된 템플릿 cDNA를 사용하여 7.1-7.6 단계에서 정규화하고, CF1&CR1 프라이머 쌍은 두 개의 눈에 띄는 대역을 증폭시키고, 증폭 결과는 중첩된 프라이머 CF2&CR1(그림4A)에의해 반복되었다. 더욱이, 두 밴드는 5' 폴리프식파타제 처리 RNA로부터 강하게 증폭되었고, 비처리된 대조물에서 검출하기 어려웠으며, 이는 RNA 5' 폴리프소파타제에 민감하고 1차 5'테르미니를 가지고 있음을 시사한다.
두 후보 대역은 cox2-1및 -2로 명명되었고, 이들은 아가로즈 겔로부터 독립적으로 회수되고 벡터로 복제되었다. 콜로니 PCR 결과는 양성 클론이 가변 적인 크기의 삽입을 함유하고 있음을 보여주었으며, 이는 전사체의이기종 5' 및/또는 3' 테르미니를 암시한다(그림 5). 양성 클론은 상업적으로 서열화되었고, 시퀀싱 데이터는 단계 9.3에 기재된 바와 같이 옥수수 미토콘드리아 게놈과 정렬되었다.
시퀀싱 및 정렬 결과는 2개의 전사체가 3' 끝에서 동일하지만 5' UTR의 길이에서 상이한 것으로 나타났다(도4D). cox2-1 및 -2의 5' 끝은 각각 8월의 992-1,030 및 1,276-1,283 nt 상류에서 농축되었고, 반면 그들의 3'끝은 정지 코돈의 39 nt 다운스트림이었다. cRT-PCR 결과에서 추론된 cox2-1 및 -2의 계산된 크기는 각각 1,804-1,832 및 2,088-2,095 nt였다.
cRT-PCR 매핑 결과를 확인하기 위해, RNA 겔 블롯 혼성화는 cox2 유전자 코딩 영역에서 유래된 프로브를 사용하여 수행하였고, cox2-1및 -2와 유사한 크기의 2개의 주요 대역을 검출하였다(도4C). 추가적으로, 2,500및 2,800 nt에 관하여 2개의 더 큰 밴드는 북부 얼룩에서 검출되었습니다, 그러나 cRT-PCR에 의해 증폭되지 않았습니다. 두 개의 큰 밴드는 각각 cox2-3과 -4로 명명되었습니다. 그들을 매핑하기 위해 cox2-2의 5'및 3'UTR에 고정 된 다른 두 개의 바깥쪽을 향한 프라이머 (즉, CR2 및 CF3)가 설계되었으며, 그들의 위치는 cox2-3 및 -4의 예상 성적 표적 끝에 가깝습니다. 프라이머 쌍 CF3&CR2를 사용하여, 2개의 주요 대역은 5' 폴리프식파타제 처리 RNA로부터 유래된 cDNAs로부터강하게 증폭되었지만, 비처리된 대조물로부터는 그렇지 않았다(도 4A). 시퀀싱 결과는 변수 3'이 끝나는 동안 동일한 5'termini를 가졌다는 것을 보여주었습니다. 두 전사체의 계산된 크기는 각각 2,512/2,513 및 2,833-2,835 nt였으며, 북부 블롯에서 검출된 두 개의 더 큰 대역과 가까운 크기였다. 더욱이, cRT-PCR 결과는 cox2-3 및 -4가 1차 5' 테르미니를 가지고 있음을 시사했다.
차별 결과를 확인하기 위해 cRT-PCR 매핑 결과(예: qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 및 qCR3) 및 프라이머 쌍 qCF1&qCR1, qCF1&qCR2, qCF1&qCR3 및 q&qCR3에 사용된 프라이머 쌍에 따라 5개의 외부 를 향한 프라이머가 사용되었습니다. 각각cox2-1, -2, -3 및 -4의 RT-qPCR 분석. 5' 폴리프식파타제 처리 샘플에서 4개의 RT-qPCR 제품 모두의 상대적 풍부도는 cRT-PCR 차별 결과를 확인하는 비처리 대응물에서보다 훨씬 높았다.
요약하자면, 옥수수 cox2 유전자의 전사체 패턴은 복잡하고, cRT-PCR 기반 전략은 cox2 mRNA의 다중 이소폼을 효과적으로 구별하고 매핑한다.
그림 1: cRT-PCR 기반 전략 개요. cRT-PCR 기반 전략의 주요 단계 그림. 5'+ 및 5'-= 각각 RNA 5' 폴리포스파타제에 의해 처리및 처리되지 않은 2개의 RNA 샘플을. 5' 폴리포스파타스 처리 및 비처리 RNA로부터 유래된 2개의 cDNA 샘플은 옥수수에서 26S 성숙한 rRNA에 의해 정규화되고, 1차 및 처리된 전사체는 cRT-PCR 제품을 비교하여 구별된다. 유전자 A의 경우, 상응하는 RNA는 5' 폴리인스파타스 처리 RNA로부터 PCR 생성물이 풍부하기 때문에 1차 5' 말단을 갖는다; 유전자 B의 경우, 미토콘드리아 RNA의 두 세트에서 PCR 제품은 해당 RNA의 처리 된 5 '종단을 암시, 유사한 수준에서 증폭된다. 코딩 영역과 UTR은 각각 회색 상자와 굵은 줄로 표시됩니다. CRT= 역전사용 프라이머; CF1, CF2, CR1, 및 CR2 = 원형 화된 전사체의 5'-3' 접합부 측면에 있는 PCR 프라이머; qCF 및 qCR = RT-qPCR에 대한 발산 프라이머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아가로즈 겔 전기동에 의한 미토콘드리아 RNA 무결성 평가. (A) 15-DAP 옥수수 커널에서 제조된 미토콘드리아 RNA. M = DNA 분자 마커. (B) 5' 폴리포스파타제 및/또는 T4 RNA 리가제에 의한 순환화에 의한 처리 후 커널 미토콘드리아 RNA. 5'+ = 5' 치인산염에 의한 처리 후 미토콘드리아 RNA; T4&5'+ = 5' 폴리포스파타제에 의한 치료 후 미토콘드리아 RNA 및 T4 RNA 리가제에 의한 순환화; T4&5'- 순환화 후 미토콘드리아 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RT-PCR에 의해 추정된 nad5 및 nad1 mRNAs의 순환화 효율. (A) 및 (D) nad5 및 nad1 유전자의 도식 도면. Ex = 엑시온. 엑손과 인트론은 각각 회색 상자와 곡선으로 표시됩니다. 역전사 프라이머 RT1 및 RT2의 위치는 화살표로 표시됩니다. 검은 색 점은 PCR 프라이머의 위치를 나타내며 PCR 제품의 예상 크기가 표시됩니다. sqF1, sqF2, sqR1 및 sqR2는 RT-sqPCR용 프라이머입니다. qF1, qF2, qR1 및 qR2는 RT-qPCR용 프라이머입니다. (B) 및 (E) RT-sqPCR 분석은 각각 nad5 및 nad1 mRNAs의 원형화 효율이다. M = DNA 분자 마커. (C) 및 (F) RT-qPCR 분석은 각각 nad5 및 nad1 mRNAs의 원형화 효율이다. RT1 및 RT2 프라이머에 의해 역으로 전사된 두 개의 cDNA 샘플은 sqF2&sqR2(RT-sqPCR용) 또는 qF2&qR2(RT-qPCR용) PCR 제품으로 정규화됩니다. nad5 및 nad1 mRNAs의 순환 효율은 sqF1&sqR1(RT-sqPCR용) 또는 qF1&qR1(RT-qPCR용)의 PCR 제품을 비교하여 추정됩니다. RT1 반응에서 qF2 및 qR2에 대한 RT2 반응/qF1 및 qR1에서 qF2 및 qR2에 대한 qF1 및 qR1에 대한 순환/(순환형+선형) = qF1&qR1. 값은 세 가지 생물학적 복제의 수단 및 SD입니다. 에 의해 잠재적인 영향을 제외 하기 위해 5′ 트리포스페이트, RNA에 의해 처리 되었다 5′ 자기 결찰 하기 전에 polyphosphatase. 합계 및 미토= 총 및 미토콘드리아 RNA는 각각. RT1 및 RT2 = cDNA역RT1 및 RT2 프라이머에 의해 기록, 각각이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: cRT-PCR-케이스 전략을 사용하여 cox2 성숙한 mRNA 테르미니의 매핑. (A) cox2 cRT-PCR 제품의 젤 분리. + - = 5° 폴리포스파타스 처리 및 비처리 미토콘드리아 RNA로부터 유래된 cDNAs각각. 2개의 cDNA 샘플은 26S cDNA(26S)의 증폭에 의해 정규화되었다. 순환형 cox2 mRNA의 cRT-PCR 분석에 사용되는 5개의 프라이머: CF1, CF2 및 CF3는 중첩 프라이머이고, CF2 및 CF3는 각각 CF1의 69 및 138 bp 다운스트림; CR1 및 CR2는 중첩 프라이머이고 CR2는 CR1의 1,288 bp 상류입니다. '1'과 '2'로 표시된 밴드는 CF1&CR1과 CF2&CR1에 의해 증폭되었고, '3'과 '4' 밴드는 CF3&CR2로 증폭되었다. 네 개의 밴드는 모두 복제에 의해 시퀀싱되었다. 별표로 표시된 밴드는 반복할 수 없으며 결과에서 제외되었습니다. M = DNA 분자 마커. (B) 5' 폴리포스파타제 처리 후 순환형 cox2 mRNA의 상대적 풍부도에 대한 RT-qPCR 분석. 2개의 cDNA 샘플을 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT 및 cox1-CRT를 동등한 비율로 함유하는 프라이머 혼합물에 의해 합성되었고, 26S 성숙한 rRNA로부터 유래된 cDNA를 정상화용으로 사용하였다. 처리된 샘플/cox2에서 26S 이상 +/- = cox2 를 처리되지 않은 샘플에서 26S 이상. 값은 세 가지 생물학적 복제의 수단 및 SD를 나타낸다. RT-qPCR에 사용되는 프라이머가 표시됩니다. (C) cox2 전사체의 북부 얼룩 분석. 2 μg미토콘드리아 RNA를 적재하였다. cox2 성숙한 mRNA의 상이한 이소폼에 대응하는 밴드는 표시된다. (D) cRT-PCR 결과로부터 추론된 cox2 mRNA의 전사체 테르미니. UTR 및 열린 판독 프레임은 각각 굵은 선과 회색 상자로 표시됩니다. 8월(+1) 및 UAA(-1)에 상대적인 5' 및 3' 테르미니의 위치와 해당 위치에서 시퀀스된 단일 클론의 수가 표시됩니다. 역전사 및 PCR 증폭 프라이머의 위치는 각각 폐쇄 및 열린 화살표 헤드로 표시됩니다. RT-qPCR에 사용되는 바깥쪽을 향한 프라이머는 개방된 사각형으로 표시되며 cox2 프로브의 위치는 표시된 대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 콜로니 PCR에 의한 cox2-4인서트를 포함하는 양수 클론의 선택. (A)cox2-4 인서트를 포함하는 단일 클론을 스크리닝하는 콜로니 PCR. cox2-4인서트가 약 1,165 bp이고 벡터 서열의 크기는 100 bp입니다. 콜로니 PCR 제품의 계산된 크기는 약 1,265 bp이고, 작은 크기의 삽입을 포함하는 그 클론은 순서가 정해지지 않았다, 즉, 숫자 11, 14, 22, 및 23. (B) (A)에서 스크리닝된 양수 클론의 시퀀싱 결과. 5'/3' 끝 = 5' 및 3' 8월(+1) 및 UAA(-1)를 기준으로 각각 끝입니다. 숫자 12와 20의 시퀀싱 결과는 다른 숫자보다 훨씬 작기 때문에 제외되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 50 μL 반응용 부피(μL) | 최종 농도 |
| 10x RNA 5' 폴리포스파타제 완충제 | 5개 | 1x |
| RNase 억제제 (40 U /μL) | 0.75 | 0.6 U/μL |
| 미토콘드리아 RNA | Ⅹ | 0.2 μg/μL |
| RNA 5' 폴리포스파타제 (20 U/μL) | 2.5 | 1 U/μL |
| DEPC 처리 된 탈이온화 된 H2O | ~ 50 μL | - |
표 1: RNA 5' 폴리포스파타제 치료의 반응 성분.
| 구성 요소 | 20 μL 반응용 부피(μL) | 최종 농도 |
| 10x T4 RNA 리가제 I 버퍼 | 2개 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1개 | 50 μM |
| PEG8000 (50%) | 6개 | 15% |
| RNA 억제제 (40 U /μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| 5' 다인산염 처리 또는 비처리 미토콘드리아 RNA | Ⅹ | 0.1~0.2 μg/μL |
| T4 RNA 리가제 I (30 U/μL) | 0.4 | 0.6 U/μL |
| DEPC 처리 된 탈이온화 H2O | 20 μL | - |
표 2: 미토콘드리아 RNA 순환의 반응 성분.
| 구성 요소 | 10 μL 프리 믹스용 부피(μL) |
| 프라이머 혼합물 (1 μM 총)a | 2개 |
| dNTP 혼합물 (각 10 mM) | 1개 |
| 원형화된 5' 다형성 피이상처리 또는 비처리 미토콘드리아 RNAb | Ⅹ |
| DEPC 처리 된 탈이온화 된 H2O | 10 μL |
표 3: 역전사 반응을 위한 사전 혼합물. a. 프라이머 혼합물은 26S-CRT 및 최대 7개의 다른 RT 프라이머의 동일한 비율을 포함하고, 최종 농도는 1 μM. b두 개의 사전 혼합물이 나란히 제조되고, 원형화된 5' 폴리포스파타제 처리 또는 미토콘드리아 RNA.
| 구성 요소 | 20 μL 반응 시스템 용 부피 (μL) | 최종 농도 |
| 템플릿 RNA/프라이머/dNTP* | 10개 | - |
| 5x RTase 버퍼 | 4개 | 1x |
| RNase 억제제 (40 U /μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1개 | 10 U/μL |
| DEPC 처리 된 탈이온화 H2O | 20 μL | - |
표 4: 역전사의 반응 성분. *6.3단계에서 제조된 템플릿 RNA/프라이머/dNTP 프리믹스.
| 구성 요소 | 20 μL 반응 시스템 용 부피 (μL) | 최종 농도 |
| 디이온화 H2O | 7명 | - |
| 2x 반응 버퍼 | 10개 | 1x |
| dNTP 혼합물 (각 10 mM) | 0.4 | 각 0.2mM |
| 26S-CF1(10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 26S-CR1(10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 원형화된 5' 폴리포스파타스 처리 또는 비처리 RNA에서 파생된 템플릿 cDNA * | 0.6 | - |
| DNA 폴리머라제 (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
표 5: 26S cDNA의 PCR 증폭을 위한 반응 성분. *처음에는 동일한 볼륨의 템플릿 cDNA(0.6 μL)가 정규화에 사용됩니다. 필요한 경우 템플릿 cdNAs의 양을 변경하여 두 PCR 반응 간에 동일한 26S PCR 제품을 보장합니다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 번호 |
| 초기 변성 | 95 °C | 약 3분 | 1사이클 |
| 변성 | 95 °C | 15초 | 22-25 사이클 |
| 프라이머 어닐링 | 56 °C | 15초 | |
| 확장 | 72 °C | 30초 | |
| 최종 확장 | 72 °C | 약 5분 | 1사이클 |
| 개최 | 4 °C | ∞ | - |
표 6: 증폭할 PCR 조건 26S 정상화를 위한 cDNA.
| 구성 요소 | 20μL 반응 시스템 용 부피 (μL) | 최종 농도 |
| 디이온화 H2O | 20 μL | - |
| 2x 반응 버퍼 | 10개 | 1x |
| dNTP 혼합물 (각 10 mM) | 0.4 | 각 0.2mM |
| 발산 프라이머 전진 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 발산 프라이머 리버스 (10 μM) | 0.8 | 0.4 mM |
| 원형화된 5' 폴리포스파타제 처리 또는 비처리 RNA로부터 유래된 템플릿 cDNA * | Ⅹ | - |
| DNA 폴리머라제 (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
표 7: 순환화된 표적 전사체의 PCR 증폭을 위한 반응 성분. *이러한 반응에 사용되는 템플릿 cDNA의 부피는 26S rRNA 정규화 결과에 의해 결정됩니다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 번호 |
| 초기 변성 | 95 °C | 약 3분 | 1사이클 |
| 변성 | 95 °C | 15초 | 22-40 사이클 c |
| 프라이머 어닐링 a | 50-65 °C | 15초 | |
| 확장 b | 72 °C | 0.5-1분 | |
| 피나틀 확장 | 72 °C | 약 5분 | 1사이클 |
| 개최 | 4 °C | ∞ | - |
표 8: 대상 전사체를 증폭시키는 PCR 조건. a. 정확한 어닐링 온대는 PCR 프라이머의 용융 온도에 따라 달라집니다. b 연신 시간은 증폭될 대상의 길이에 따라 달라집니다. 권장 시간은 PCR 조각의 1kb당 1분입니다. c 일반적으로, 30~35 사이클은 PCR 제품의 적당한 양을 생성하기에 충분하다. 낮은 풍부한 성적 증명서에 대 한, 최대 사이클의 수를 증가 40 사이클.
그림 S1: 대표적인 옥수수 미토콘드리아 전사체에 대한 프라이머의 위치. CRT= 역전사 프라이머; CF1, CF2, CR1, 및 CR2 = PCR 증폭을 위한 다양한 프라이머; qCF 및 qCR = RT-qPCR에 대한 발산 프라이머. 옥수수 nad2-1, rps4-1및 nad4-1의 전사체 테르미니는 이전에 결정되었다(Zhang et al., 2019 1). 8월(+1)과 정지 코돈(-1)의 마지막 뉴클레오티드에 상대적인 5'----말단의 위치가 도시된다. 코딩 영역과 UTR은 각각 회색 상자와 굵은 줄로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
도 S2: 옥수수에서 nad5 mRNA의 원형화 효율을 추정하는 원리. 자가 결찰 반응에서 미토콘드리아 RNA의 일부만 원형화됩니다. 순환된 nad5 mRNA의 비율을 계산하기 위해, 2개의 유전자 특이적 프라이머는 제1 가닥 cDNA, 즉 nad5-RT1 및 -RT2를 합성하는데 사용된다. nad5-RT2 역전사(RT) 반응에서 pcR 제품은 sqF2&sqR2(RT-sqPCR용) 및 qF2&qR2(RT-qPCR용)로 증폭되며, sqF1&sqR1(RT-sqPc1)은 선형 및 순환형 nad5에서 파생됩니다. &qR1 (RT-qPCR용) PCR 제품은 순환형 nad5에서만 파생됩니다. nad5-RT1 반응에서, PCR 프라이머의 모든 네 쌍nad5의두 형태를 증폭 할 수 있습니다 . 순환 nad5 mRNA의 비율을 계산하기 위해, 두 반응은 sqF2&sqR2 또는 qF2&qR2 PCR 제품에 의해 정규화된다. 두 RT 반응 사이의 sqF1&sqR1 또는 qF1&qR1 PCR 제품의 풍부함을 비교함으로써 nad5 mRNA의 원형화 효율은 대략 추정됩니다. ex = 엑시온. 엑손과 인트론은 각각 회색 상자와 곡선으로 표시됩니다. nad5-RT1 및 -RT2 프라이머의 위치는 화살표로 표시됩니다. 검은 색 점은 PCR 프라이머의 위치를 나타내며 PCR 제품의 예상 크기가 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 S1: 프라이머 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이전 연구에서, 애기장대의 세포 현탁물 배양으로부터의 총 및 미토콘드리아 RNA는 cRT-PCR에 의해 미토콘드리아 전사체 종기를 매핑하는데 사용되었고, 유사한 결과를12로얻었다. 그러나, 농축된 미토콘드리아 RNA만이 많은 다른 연구에서 미토콘드리아 전사체 termini를 맵메이상으로 사용하였으며 1, 2,3,9. 우리는 미토콘드리아 RNA의 농축이 옥수수에서 미토콘드리아 전사체 종단의 cRT-PCR 매핑을 위한 중요한 단계라는 것을 것을을 발견했습니다. 이 농축 후, 원형화된 미토콘드리아 RNA의 비율은 0.3%에서 3.7%에서 ~30%로 극적으로 증가한다(도3 및 도 형 S2)이는 한 라운드의 PCR에서 원형화된 표적 전사체의 증폭을 가능하게 한다.
미토콘드리아 RNA의 원형화 효율은 옥수수 nad1및 nad5에대한 RT-PCR 분석에 의해 추정되었으며, 둘 다 시스-스플리싱 인트론에 의해 독립적 인 전구체로 나뉩니다. RT 효율의 변이뿐만 아니라 전구체 RNA의 존재로부터의 잠재적 영향은 배제될 수 없기 때문에, 이것은 단지 실제 미토콘드리아 RNA 순환화 효율의 대략적인 추정일 뿐이다.
우리는 미토콘드리아 RNA와 PEG8000의 농도를 변경하고, 인큐베이션 시간을 연장시킴으로써 자기 결찰 조건을 변경했지만, 이러한 변화는 미토콘드리아 RNA 순환 화 효율에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. Percoll 그라데이션 정제가 순환 효율을 증가시킬 수 있는지 확실하지는 않지만, 섹션 2에서 제조된 조미토콘드리아의 품질은 옥수수에서 미토콘드리아 전사체 termini의 cRT-PCR 매핑에 충분합니다. 여러 라운드의 PCR이 거짓 양성 결과를 일으킬 수 있으므로 한 라운드 PCR에서 대상 전사체의 증폭은 매핑 결과를 보다 안정적으로 만듭니다.
1 차 적인 전사체의 5' triphosphate는 불안정하고, 알 수 없는 이유로 5'모노포스페이트로 변환될 수 있었습니다. 이 문제는 5' 삼인산염 1,2,4의유무에 따라 접근법을 사용하여 1차 및 처리된 전사체 간의 명확한 분화를 방해한다. 옥수수 26S rRNA의 성숙한 형태는 단인산염 5' 말단을 가지며, RNA 5' 폴리포스파타제에 민감하지 않다. 불안정한 5' 트리포스페이드의 영향을 최소화하기 위해, 성숙한 26S rRNA는 2개의 RNA 샘플을 정규화하는데 사용되며, 5' 폴리포스파타제에 의해 처리 및 처리되지 않고, 옥수수에서 두 가지 유형의 전사체를 분화하는 중요한 단계로 나타난다. 미토콘드리아. 정규화 후, 1차 및 처리된 전사체는 5' 폴리포스파타제 처리 및 비처리 RNA 샘플로부터 얻어진 cRT-PCR 및 RT-qPCR 결과를 비교하여 차별될 수 있었다. 1차 전사체는 5' 폴리포스파타제에 민감하며, 5' 폴리포스파타제 처리 샘플로부터 강하게 증폭되지만(또는 불안정한 5' 삼인산염으로 인해 매우 낮은 수준)에서 비처리대응체로부터 증폭된다. 대조적으로, 처리된 전사체는 두 샘플 사이의 비교 가능한 수준에서 검출된다.
식물에서, 많은 미토콘드리아 유전자의 전사체패턴은 다소 복잡하다 1,2. 예를 들어, 옥수수 nad6 및 atp6 유전자는 각각 2, 3 및 2개의 이소폼을 가지며, na6 성숙한 mRNAs는 각각 단핵트론및 디시스트론, 및 nad6, atp6및 atp6로발현된다. 더욱이, 하나의 미토콘드리아 유전자의 전사체 집단은 실제로 전구체, 성숙, 및 분해 RNA의 혼합물이다. PCR은 작은 크기의 분자를 증폭하는 경향이 있으며, 프라이머 한 쌍을 사용하여 모든 전사체 이소폼을 검출하기가 어렵습니다. 따라서, RNA 겔 블롯 혼성화는 cRT-PCR 매핑 결과를 검증하는 데 필요하며, 대체 프라이머는 처음 cRT-PCR에 의해 검출되지 않고 북부 블롯에서 검출된 전사체를 증폭시키기 위해 필요할 수 있다.
이 프로토콜에는 cRT-PCR 판별 결과를 확인하는 RT-qPCR 단계가 포함되어 있습니다. 일부 성숙한 mRNAs의 다중 이소폼은크기 1에서 매우 가깝기 때문에 RT-qPCR에 의한 모든 차별 결과를 확인하는 것은 불가능하며, 일부 정상 상태 전사체는 처리된 mRN 간의 cRT-PCR 결과를 비교하여 결정되었습니다. 및 처리되지 않은 RNA만.
이 프로토콜에서, 표적 전사체의 5' 및 3' 테르미니는 cRT-PCR 제품의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 매핑되었고, 단일 클론의 개수를 시퀀싱하는 것을 제한한다. 대안으로, cRT-PCR 제품은 한 세트의 정상 상태 전사체에 대해 수천 개의 분자를 서열화하는 차세대 염기서열 분석으로 시퀀싱될 수 있으며 매핑 결과가 더 정확할 것입니다.
cRT-PCR 및 RT-qPCR에 의해 1차 및 처리된 5' 테르미니의 차별 외에, 모노포스페이트 5' 테르미니는주변 RNA 보조 구조물의 식별에 의해 결정될 수 있었다 1,12. tRNA 및 t 요소와 같은 RNA 이차 구조가 RNase P 및/또는 RNase Z12,18,19,12의 내핵성 분열을 지시하여 미토콘드리아 전사체 말단 형성을 중재할 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 20. 따라서, tRNA 또는 t-요소에 인접한 이들 5' 테르미니는 전사 후 처리로부터 유래되어야 하며 모노포스페이트들을 함유한다.
이 프로토콜을 사용 하 여, 정상 상태 성적 증명서의 큰 부분은 옥수수 미토 콘 드리 아에서 결정 되었습니다1. 그러나, 몇몇은 알 수없는 이유로 차별화 및 / 또는 매핑되지 않았다1. 더욱이, 우리는 5' 전사체 termini의 위치가 이 프로토콜에 포함되어 있더라도 프라이머 확장 분석에 의해 확인되는 것이 낫다고 생각합니다. 실험 자료가 부족하기 때문에쌀(Oryza sativa)및 애기장대와같은 다른 식물 종에 적합한지 확실하지 않습니다. 식물 미토콘드리아 외에, 1 차 및 가공된 전사체는 모두 석고21에안정적으로 축적되고, 이 전략이 석고 전사체를 지도화하고 구별하기 위하여 이용될 수 있는지 불확실합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (교부금 번호 31600250, Y.Z.), 광저우 시의 과학 기술 프로젝트 (보조금 번호 201804020015, H.N.), 중국 농업 연구 시스템 (보조금 없음)에 의해 지원되었다. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
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