Summary
Nous présentons une stratégie circulaire basée sur RT-PCR en combinant la RT-PCR circulaire, la RT-PCR quantitative, le traitement polyphosphatase d'ARN 5' et la tache nordique. Ce protocole comprend une étape de normalisation pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5' et il convient de discriminer et de cartographier les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs.
Abstract
Dans les mitochondries végétales, certaines transcriptions à état stable contiennent un triphosphate de 5' dérivé de l'initiation à la transcription (transcriptions primaires), tandis que les autres contiennent 5' monophosphate généré sapostolassme post-transcriptionnelle (transcriptions traitées). Pour faire la distinction entre les deux types de transcriptions, plusieurs stratégies ont été élaborées, et la plupart d'entre elles dépendent de la présence ou de l'absence de triphosphate de 5'. Cependant, le triphosphate au termini primaire de 5' est instable, et il entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions. Pour différencier et cartographier systématiquement les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs, nous avons développé une stratégie circulaire basée sur la RT-PCR (cRT-PCR) en combinant cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphoshpatase, quantitatif RT-PCR (RT-qPCR), et Northern blot. À titre d'amélioration, cette stratégie comprend une étape de normalisation de l'ARN pour minimiser l'influence du triphosphate instable de 5'.
Dans ce protocole, l'ARN mitochondrial enrichi est pré-traité par l'ARN 5' polyphosphatase, qui convertit 5' triphsophate en monophosphate. Après la circularisation et la transcription inverse, les deux CDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par le maïs 26S rRNA mature, qui a une extrémité traitée de 5' et est insensible à 5' polyphosphatase. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées sont discriminées en comparant les produits cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des ARN traités et non traités. Les termini de transcription sont déterminés par le clonage et le séquençage des produits cRT-PCR, puis vérifiés par la tache nordique.
En utilisant cette stratégie, la plupart des transcriptions à l'état stable dans la mitochondrie du maïs ont été déterminées. En raison du modèle compliqué de transcription de quelques gènes mitochondriques, quelques transcriptions stables-état n'ont pas été différenciées et/ou cartographiées, bien qu'elles aient été détectées dans une tache nordique. Nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie est appropriée pour discriminer et cartographier les transcriptions à état stable dans d'autres mitochondries végétales ou dans les plastides.
Introduction
Dans les mitochondries végétales, de nombreux ARN matures et précurseurs sont accumulés sous forme d'isoformes multiples, et les transcriptions à état stable peuvent être divisées en deux groupes en fonction de la différence à leurs 5' extrémités1,2,3, 4. Les transcriptions primaires ont des extrémités triphosphate de 5' qui sont dérivées de l'initiation de transcription. En revanche, les transcriptions traitées ont 5' monophosphate généré par le traitement post-transcriptionnel. La discrimination et la cartographie des deux types de transcriptions sont importantes pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcription et à la maturation de fin de transcription.
Pour faire la distinction entre les transcriptions primaires et traitées dans la mitochondrie végétale, quatre stratégies majeures ont été élaborées. La première stratégie consiste à prétraiter les ARN mitochondriaux avec de la pyrophosphatase (TAP) à l'acide du tabac, qui convertit le triphosphate de 5 po en monophosphate et permet de circulariser les transcriptions primaires par la ligase d'ARN. Les abondances de transcription des échantillons d'ARN TAP-traités et non-traités sont alors comparées par l'amplification rapide des extrémités de cDNA (RACE) ou circulaires RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Dans la deuxième stratégie, les transcriptions traitées sont d'abord épuisées des ARN mitochondriaux à l'aide de l'exonuclease (TEX) de terminator 5'-phosphate-dépendant, et les transcriptions primaires restantes sont ensuite cartographiées par l'analyse d'extension d'amorce5,6 . La troisième stratégie consiste à précaper les transcriptions primaires à l'aide de la gouanylyl transferase, puis la position du termini triphosphated 5' est déterminée par extension d'amorce avec l'analyse de protection de nucléane de ribonuclease ou de S17,8 ,9. Différente de celles selon la présence/absence du triphosphate de 5', la quatrième stratégie combine la transcription in vitro, la mutagénèse dirigée par le site, et l'analyse d'extension d'amorce pour caractériser les promoteurs putatifs et déterminer la transcription sites d'initiation8,10,11. En utilisant ces stratégies, de nombreuses transcriptions primaires et traitées ont été déterminées dans les mitochondries végétales.
Cependant, plusieurs études ont rapporté que le triphosphate de 5' des transcriptions primaires étaient instables, et ils ont été facilement convertis en monophosphate pour la raison inconnue2,4,12,13. Ce problème entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions en utilisant des techniques en fonction de la présence/absence de triphosphate de 5', et les efforts antérieurs pour discriminer systématiquement entre les transcriptions primaires et traitées dans les usines mitochondries a échoué2,12.
Dans ce protocole, nous combinons cRT-PCR, RNA 5' traitement polyphosphatase, RT-qPCR, et la tache du Nord pour distinguer systématiquement les transcriptions primaires et traitées stablement accumulées dans le maïs (Zea mays) mitochondndrion (Figure 1). cRT-PCR permet la cartographie simultanée des extrémités de 5' et 3' d'une molécule d'ARN, et il est généralement adapté pour cartographier les termini de transcription dans les plantes2,12,14,15. La polyphosphatase de l'ARN 5' pourrait enlever deux phosphates du termini triphosphated 5', qui rend les transcriptions primaires disponibles pour l'auto-ligaation par ligase d'ARN. Des études antérieures ont montré que l'ARNr 26S mature dans le maïs avait traité le terminus de 5' et qu'il était insensible à la polyphosphatase1,16. Afin de minimiser l'influence du triphosphate instable au termini primaire de 5', les ARN de 5' traités par polyphosphatase et non traités sont normalisés par l'ARNr 26S mature, et les transcriptions primaires et traitées sont ensuite différenciées en comparant le cRT-PCR provenant des deux échantillons d'ARN. Les résultats de la cartographie et de la discrimination cRT-PCR sont vérifiés par Northern blot et RT-qPCR, respectivement. Enfin, d'autres amorces sont utilisées pour amplifier les transcriptions détectées dans Northern blot, mais pas par cRT-PCR. En utilisant cette stratégie basée sur le cRT-PCR, la plupart des transcriptions à état stable dans la mitochondrie du maïs ont été différenciées et cartographiées1.
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Protocol
1. Conception d'apprêt
- Concevoir des amorces spécifiques aux gènes pour la transcription inversée (RT) à l'aide d'un logiciel de conception d'amorce PCR (Table of Materials) basé sur les règles générales de conception d'amorce17.
REMARQUE: Les amorces DE sont très spécifiques aux transcriptions cibles, et elles sont généralement ancrées sur la partie 5' des séquences de codage (ARNm matures et ARN précurseurs), ou 500 à 600 nt en aval de l'extrémité prévue de 5' (18S et 26S rARN). - Concevoir des paires d'amorces divergentes pour amplifier les transcriptions circulaires par cRT-PCR.
REMARQUE : Les amorces divergentes jumelées flanquent la jonction de 5'-3' des transcriptions circulaires, et leurs positions varient entre les transcriptions cibles analysées (Figure S1). Certaines transcriptions ont de longs URs; par exemple, nad2-1 5' UTR et rps4-1 3' UTR sont 1.985 et 1.826/1,834 nt, respectivement1. Si les deux amorces sont ancrées sur la région de codage, il sera difficile d'amplifier les transcriptions cibles. En revanche, certains UR sont courts; par exemple, les 3' UTRs de nad2-1 et nad4-1 sont 34/35 et 29-31 nt, respectivement1. Si les amorces appariées sont situées loin des séquences de codage, le PCR échouera. En général, deux paires d'amorces divergentes sont conçues pour chaque transcription cible, tandis que plusieurs paires peuvent être nécessaires pour cartographier ceux dont les modèles de transcription sont compliqués et/ou les ORC sont très longs. - Concevoir des paires d'amorces convergentes pour préparer des sondes d'ARN pour la tache nordique.
REMARQUE: Les amorces appariées sont situées sur la région de codage du gène cible, et la taille du produit PCR devrait être de l'ordre de 100 à 1 000 pb. Chaque apprêt avant doit contenir un site enzymatique de restriction pour minimiser les séquences vectorielles dans les sondes qui en résultent.
2. Préparation de mitochondrie brute à partir de grains en développement de maïs
- Stériliser les pilons, les mortiers, les entonnoirs en verre, les tubes et les pointes par autoclave, et les sécher au four.
- Effectuer toutes les procédures à 4 oC ou sur glace, et pré-refroidir toutes les solutions.
- Préparer 100 ml de tampon d'extraction (EB), composé de 0,3 M de saccharose, 5 mM de pyrophosphate tétrasodium, 10 mM KH2PO4, 2 mM EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidone 40, 1% [w/v] albumin etolitique de sérum bovin, 5 mM L-cystéine, et 20 mM d'acide ascorbique. Ajuster au pH 7.3 avec KOH et stériliser par filtration.
- Préparer 100 ml de tampon de lavage (WB) composé de 0,3 M de saccharose, 1 mM EGTA et 10 mM moPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid). Ajuster au pH 7.2 avec NaOH et stériliser par filtration.
REMARQUE: Il est suggéré de préparer EB et WB en utilisant DEPC-traité déionized H2O. - Recueillir 20 g de grains en développement à 11 à 20 jours après la pollinisation (DAP) dans un tube de 50 ml placé sur la glace, puis transférer les grains dans des mortiers pré-refroidis.
REMARQUE: Utiliser un rapport de 100 ml d'EB à 20 g de grains de maïs. - Ajouter 10 à 20 ml d'EB glacé à chaque mortier et moudre complètement les grains.
- Ajouter plus d'EB, et filtrer les tissus du sol à travers deux couches de tissu filtre (Table des matériaux).
- Centrifuger le filtrate à 8 000 x g pendant 10 min, et jeter la pastille.
- Transférer le supernatant dans un nouveau tube et le centrifuger à 20 000 x g pendant 10 min.
- Verser le supernatant, et resuspendre la boulette dans 6 mL WB.
- Aliquot la suspension à cinq tubes sans RNase de 1,5 mL, et les centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min.
- Jeter le supernatant, congeler le granule mitochondrial dans de l'azote liquide et le stocker à -80 oC.
3. Extraction de l'ARN mitochondrial
- Extraire l'ARN mitochondrial avec un réactif commercial (Table of Materials) selon les instructions de la manufacture.
MISE EN GARDE: Ce réactif contient du phénol et de l'isothiocyanate de guanidine. Travaillez avec elle dans une hotte de fumée, et portez le manteau et les gants de laboratoire. - Dissoudre l'ARN mitochondrial isolé dans le H2O déionisé traité par DEPC et estimer la concentration et la pureté de l'ARN à l'égard d'un spectrophotomètre (tableaudes matériaux).
REMARQUE: En général, l'ARN mitochondrial de 250 g est obtenu à partir de 20 g de grains de maïs 15-DAP. - Préparer un gel d'agarose composé de 1x tampon TAE (40 mM Tris, 20 mM d'acide acétique, 1mM EDTA), 1,5% agarose (Table of Materials), et 1x colorant nucléaire ( Table ofMaterials).
- Ajouter un volume approprié de tampon de chargement 10x (0,5 % bleu bromophénol, 0,5 % de xylène cyanol FF et 50 % de glycérol), et charger le mélange tampon d'ARN/chargement mitochondrial sur le gel agarose de 1,5 %.
- Exécuter le gel en tampon 1x TAE à 5 à 6 V/cm pendant 20 à 25 min, et évaluer l'intégrité de l'ARN mitochondrial en imagerie du gel avec un système de documentation gel (Tableau des matériaux).
REMARQUE: La présence de deux bandes distinctes (3 510 et 1 970 nt pour le maïs mitochondrial 26S et 18S, respectivement) est une norme acceptable pour l'ARN mitochondrial intact. Pour exclure une dégradation possible, l'intégrité de l'ARN doit être étudiée au cours des multiples étapes de la préparation circulaire de l'ARN (figure 2).
4. RNA 5' Traitement de polyphosphatase
- Mettre en place le traitement de l'ARN 5' polyphosphatase (Table et Matériaux)(tableau 1), et incuber à 37 oC pendant 30 à 60 min.
- Récupérer l'ARN traité à la polyphosphatase de 5' avec un kit de purification de l'ARN (Tableau des Matériaux) selon les instructions du fabricant.
- Répétez les étapes 3.3 à 3.5.
5. Circularisation de l'ARN
- Préparer deux réactions de circularisation en utilisant les mêmes quantités de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNA mitochondriaux (tableau 2), et couver les deux réactions à 16 oC pour 12-16 h.
- Récupérez les deux séries d'ARN auto-ligated en utilisant le même kit que dans l'étape 4.2.
REMARQUE: Il convient de noter que seule une fraction de l'ARN mitochondrial sera auto-ligated, et l'ARN récupéré sera un mélange de transcriptions linéaires et circulaires. - Répétez les étapes 3.3 à 3.5.
6. Transcription inversée
- Synthétiser deux ensembles de CDNA à partir des mêmes quantités d'ARN circulaires de 5' traités par polyphosphatase et non traités (200 ng).
- Préparer un mélange d'amorce en ajoutant un rapport égal de 26S-CRT et jusqu'à 7 autres amorces RT.
REMARQUE: La concentration finale du mélange d'amorce doit être de 1 M. - Préparer deux pré-mélanges en combinant les réactifs énumérés dans le tableau3, incuber à 65 oC pendant 5 min, puis réfrigérer sur la glace pendant 2 min.
- Assembler deux systèmes de réaction RT (tableau4) et les incuber à 42 oC pendant 50 min.
- Chauffer les deux réactions de RT à 70 oC pendant 5 min, puis les refroidir sur la glace.
7. Normalisation
- Préparer deux réactions PCR en ajoutant le même volume de modèles cDNA dérivés de 5' polyphosphatase-traités ou non traités RNAs, amorces divergentes flanquant la jonction 5'-3' de circulaire 26S rRNA (c.-à-26S-CF1 et -CR1), etc (tableau 5).
- Exécuter les deux réactions dans un cycleur thermique (Tableau des matériaux) dans des conditions décrites dans le tableau 6.
- Préparer un gel d'agarose composé de 1x tampon TAE, 1,0% d'agarose et 1x colorant nucléaire.
- Ajouter un tampon de chargement de 2 l1x (0,5 % bleu bromophénol, 0,5 % de cyylène xylène FF et 50 % de glycérol) à chacun des deux produits PCR, et les charger sur le gel.
- Faites fonctionner le gel dans un tampon TAE 1x à 5 à 6 V/cm pendant 30 à 40 minutes, et imagez-le en utilisant le même système de documentation de gel que l'étape 3.5.
- Comparez l'abondance des deux produits PCR à l'aide d'un logiciel informatique (Tableaudes matériaux, Figure 4A), et optimisez la normalisation en modifiant les quantités de modèles cDNA si nécessaire.
8. Amplification DE PCR
- Préparer des paires de réactions PCR en ajoutant un volume approprié des CDNA normalisés et une paire d'amorces divergentes flanquant la jonction de 5'-3' des transcriptions cibles (tableau 7).
REMARQUE: La quantité de cDNA de modèle utilisé pour l'amplification de PCR des transcriptions cibles est déterminée par les résultats de normalisation 26S rRNA. - Effectuer les réactions PCR selon le programme décrit dans le tableau 8.
- Répétez les étapes 7.3 à 7.5.
- Changer les amorces divergentes imparables et vérifier les résultats du PCR du premier tour en répétant les étapes 8.1 et 8.2.
- Répétez les étapes 7.3 à 7.5.
- Récupérer les bandes proéminentes qui pourraient être répétées en deux séries d'amplification PCR à l'aide d'un kit de récupération d'ADN gel (Tableau des matériaux).
9. Détermination de Transcript Termini
- Clonez les produits PCR purifiés en gel dans un vecteur émoussé (Tableau des matériaux) en utilisant des techniques standard.
- Effectuer la pcR de la colonie pour sélectionner les clones positifs contenant les inserts cibles, et les séquencer commercialement.
REMARQUE: Les clones positifs contenant des inserts de taille variable sont généralement détectés à partir d'une seule bande récupérée parce que de nombreuses transcriptions à l'état stable dans les mitochondries végétales ont des extrémités hétérogènes de 5' et/ou 3'1,12. - Harmoniser les données de séquençage avec le génome mitochondrial du maïs à l'aide de l'outil local de base de recherche sur l'alignement (BLAST) du Centre national d'information sur la biotechnologie (NCBI). Choisissez l'organisme "maïs (taxid:4577)", et la base de données de recherche "Collection de nucléotides (nr/nt)".
- Trouvez la jonction 5'-3' de la transcription circulaire, et déterminez les positions de 5' et 3' termini de transcription.
- Calculez la taille des transcriptions cibles.
10. Vérification des résultats de cartographie cRT-PCR par hybridation de blot de gel d'ARN
REMARQUE: L'hybridation de tache de gel d'ARN est exécutée en utilisant un kit commercial (tableau des matériaux), qui contient les réactifs pour la transcription-étiquetage de l'ARN avec la digoxinine (DIG) et la polymérase d'ARN T7, l'hybridation, et la détection immunologique. Veuillez consulter les protocoles fournis dans ce kit pour plus de détails. Assurez-vous que seul l'équipement sans RNase est utilisé pour l'ensemble de la procédure.
- Amplifiez le fragment d'ADN utilisé pour préparer la sonde d'ARN, et clonez-le au même vecteur que dans l'étape 9.1, qui contient un promoteur T7 17 bp en amont du site d'insertion.
- Linéarisez la construction à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, récupérez le plasmide linéaire par un kit de purification de l'ADN (Table of Materials), et dissoutez-le dans le H2O déionisé traité par DEPC.
- Étiquette sondes d'ARN avec DIG-11-UTP par un kit commercial (Table of Materials) selon les instructions du fabricant.
- Préparer 500 ml de tampon MOPS 10x (0,2 M MOPS, 50 mm d'acétate de sodium et 10 mM EDTA) à l'aide de H2O. déionisé traités par DEPC et de le pH 7,0 par NaOH, et stériliser par filtration.
- Ajoutez 2 à 3 volumes de tampon de chargement (50 % de formamide, 6,2 % de formaldéhyde, 1x MOPS, 10 % de glycérol et 0,1 % de bleu bromophénol) à l'ARN mitochondrial préparé à l'étape 3.1-3.3.
- Dénaturer l'échantillon d'ARN/Charger le mélange tampon à 65 oC pendant 10 min, puis refroidir sur la glace pendant 1 min.
- Préparer un gel d'agarose dénaturé (2 % de formaldéhyde, 1,2 % d'agarose et 1x MOPS) et charger l'échantillon d'ARN/mélange tampon de chargement au gel (1 à 2 g d'ARN mitochondrial par puits).
- Exécuter le gel en 1x MOPS à 3 x 4 V/cm pour 4 h.
- Préparer 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M de citrate de sodium, pH 7,0). Traitez-le avec 0,1% DEPC pendant la nuit, et stérilisez par autoclave.
- Rincer le gel deux fois en 20x SSC (15 min à chaque fois), et transférer l'ARN gel à une membrane de nylon (Table of Materials) par transfert capillaire avec 20x SSC pour 10 à 16 h.
- Fixer l'ARN à la membrane en faisant cuire à 120 oC pendant 30 min.
- Effectuer l'hybridation de l'ARN et la détection immunologique avec un kit commercial (Table of Materials) selon les instructions du fabricant.
11. Discrimination des fins primaires et traitées de 5'
- Distinguer les extrémités primaires et traitées de 5' en comparant les produits cRT-PCR obtenus à partir des ARN normalisés de 5' polyphosphatase-traités et non traités.
REMARQUE: Pour les transcriptions primaires, l'abondance des produits PCR à partir de 5' polyphosphatase-traité ARN est beaucoup plus élevé que celle de la contrepartie non traitée (Figure 1, «Gène A, » et Figure 4A). Toutefois, pour les transcriptions traitées, un niveau comparable de produits PCR serait amplifié à partir des deux ensembles d'ARN mitochondriaux (figure1, « gène B »). - Concevoir des amorces RT-qPCR basées sur les résultats cartographiques cRT-PCR.
- Vérifier les résultats de discrimination cRT-PCR par RT-qPCR.
REMARQUE: Les deux échantillons d'ADNc dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par les produits RT-qPCR de 26S rRNA mature.
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Representative Results
Estimation de l'efficacité de la circularisation de l'ARN mitochondrial
Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux ont été utilisés pour la cartographie cRT-PCR de termini de transcription mitochondriale dans Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), et les deux types d'ARN ont donné des résultats de cartographie similaires12. Au départ, nous avons également utilisé des ARN totaux pour la cartographie cRT-PCR des termini de transcription mitochondriale dans le maïs. Après de nombreux essais, nous avons constaté que les transcriptions cibles étaient difficiles à détecter. Comme amélioration, nous avons enrichi l'ARN mitochondrial des grains en développement de maïs, et il a rendu possible l'amplification des transcriptions de cible circularisées dans une série de PCR.
Pour expliquer l'amplification facile des transcriptions cibles après l'enrichissement, nous avons estimé l'efficacité de la circularisation de l'ARN en effectuant des RT-PCR sur le gène mitochondrial représentatif nad5 (figure3 et figure S2). Le gène nad5 du maïs contient deux introns trans- et deux introns épissés. Après l'auto-ligation des ARN totaux et mitochondriaux, les premiers ARN ont été synthétisés indépendamment à l'aide d'amorces nad5-RT1 et -RT2. Les deux amorces pourraient inverser la transcrit à la fois linéaire et circulaire nad5 mRNAs (Figure S2). Quatre paires d'amorces convergentes sont utilisées pour l'amplification de PCR : sqF1 et sqR1 et sqF2 et sqR2 pour rt-PCR semi-quantitatif (RT-sqPCR) et qF1 et qFR1 et qF2 et qR2 pour RT-qPCR. Pour les cDNA transcrits par nad5-RT1, les quatre paires d'amorces ont détecté des ARNc matures nad5 circulaires et linéaires; pour la réaction de transcription inversée nad5-RT2, sqF2 et sqR2 et qF2 et qR2 ont examiné les deux formes d'ARNm, tandis que les produits sqF1 et sqR1 et qF1 et qR1 PCR ont été dérivés de nad5 circulaire seulement. Sur la base de cette analyse, nous avons utilisé les produits PCR sqF2 et sqR2 (pour RT-sqPCR) et qF2 et qR2 (pour RT-qPCR) pour normaliser les réactions de transcription inversée nad5 -RT1 et -RT2, et avons estimé le rapport de nad5 circulaire en comparant le nad5 circulaire en comparant le nad5 sqF1 et sqR1 (pour RT-sqPCR) ou qF1 et qR1 (pour RT-qPCR) produits PCR. Avant l'auto-ligation, les ARN ont été pré-traités par l'ARN 5' polyphosphatase pour rendre tous les transcriptions disponibles pour la circularisation par ligase d'ARN. L'analyse RT-sqPCR a montré qu'une très petite fraction de l'ARNm nad5 a été circularisée lorsque l'ARN total a été utilisé, mais le rapport a été considérablement augmenté lorsque l'ARN mitochondrial enrichi a été utilisé (Figure 3B). Les résultats de RT-qPCR ont montré que le ratio d'ARNm nad5 auto-ligated est passé de 3,7 % à 32 % après l'enrichissement (figure 3C). L'analyse de nad1 a donné des résultats similaires, et l'efficacité de la circularisation de l'ARNm nad1 est passée de 0,7 % à 30 % (figure3D-F).
Selon ces analyses, environ 30 % des ARN mitochondriaux de maïs ont été auto-ligated après l'amélioration, et l'efficacité accrue de circularisation explique la détection facile des transcriptions cibles par cRT-PCR.
Détermination du maïs cox2 termini mRNA en utilisant la stratégie cRT-PCR
Nous avons utilisé le gène cox2 comme exemple pour introduire la cartographie et la discrimination des transcriptions mitochondriales du maïs en utilisant la stratégie cRT-PCR (figure4).
Au début de la cartographie de l'ARNm cox2, trois amorces orientées vers l'extérieur CF1, CF2 et CR1 ont été conçues sur la région de codage génétique (figure4D). CF1 et CF2 étaient des amorces nichées, et CF2 était 69 b en aval de CF1. À l'aide du modèle cDNA synthétisé à l'étape 6.1-6.5 et normalisé à des étapes 7.1-7.6, la paire d'amorce CF1 et CR1 a amplifié deux bandes proéminentes, et les résultats d'amplification ont été répétés par les amorces non-parsemées CF2 et CR1 (figure4A). En outre, les deux bandes ont été fortement amplifiées à partir de l'ARN 5' polyphsophatase-traité, tandis qu'ils étaient difficiles à détecter dans la contrepartie non-traitée, suggérant qu'ils sont sensibles à l'ARN 5' polyphsophatase et ont le termini primaire de 5'.
Les deux bandes candidates ont été nommées cox2-1 et -2, et elles ont été récupérées indépendamment du gel d'agarose et clonées en vecteurs. Les résultats de la PCR de la colonie ont montré que les clones positifs contiennent des inserts de taille variable, ce qui implique des termini hétérogènes de 5' et/ou 3' des transcriptions (figure 5). Les clones positifs ont été séquencés commercialement, et les données de séquençage ont été alignées avec le génome mitochondrial de maïs tel que décrit à l'étape 9.3.
Les résultats du séquençage et de l'alignement ont montré que les deux transcriptions étaient identiques à 3' extrémités, mais différentes dans la longueur de 5' UTRs (Figure 4D). Les extrémités de 5' de cox2-1 et -2 ont été enrichies à 992-1,030 et 1.276-1.283 nt en amont de L'AUG, respectivement, tandis que leur extrémité 3' était 39 nt en aval du codon d'arrêt. Déduits des résultats cRT-PCR, les tailles calculées de cox2-1 et -2 étaient respectivement de 1 804 à 1 832 et de 2 088 à 2 095 nt.
Pour vérifier les résultats cartographiques cRT-PCR, l'hybridation de la tache de gel d'ARN a été effectuée en utilisant la sonde dérivée de la région de codage de gène cox2, et deux bandes principales avec la taille semblable que cox2-1 et -2 ont été détectées (figure 4C). De plus, deux bandes plus grandes, soit environ 2 500 et 2 800 nt, ont été détectées dans la tache nordique, mais elles n'ont pas été amplifiées par le cRT-PCR. Les deux plus grandes bandes ont été nommées cox2-3 et -4, respectivement. Pour les cartographier, deux autres amorces orientées vers l'extérieur (c.-à-d. CR2 et CF3), ancrées sur les UR 5 et 3' de la barre2-2, ont été conçues, et leurs positions étaient proches des extrémités de transcription attendues de la barre 2-3 et -4. À l'aide de la paire d'amorce CF3 et CR2, deux bandes principales ont été fortement amplifiées à partir de cDNA dérivés de l'ARN traité à la polyphophatase de 5' mais pas de la contrepartie non traitée (figure 4A). Les résultats du séquençage ont montré qu'ils avaient identique 5' termini tandis que variable 3' se termine. La taille calculée des deux transcriptions était de 2 512/2 513 et de 2 833 à 2 835 nt, respectivement, et elles étaient de taille étroite avec les deux plus grandes bandes détectées dans la tache nordique. En outre, les résultats cRT-PCR ont suggéré que le cox2-3 et -4 ont le termini primaire de 5'.
Pour confirmer les résultats de discrimination, cinq amorces orientées vers l'extérieur ont été conçues en fonction des résultats cartographiques cRT-PCR, c'est-à-dire qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 et qCR3, et les paires d'amorces qCF1 et qCR1, qCF1 et qCR2, qCF1 et qCR3, et qCF2 et qCR3 Analyse RT-qPCR de la barre2-1, -2, -3 et -4, respectivement. L'abondance relative des quatre produits RT-qPCR dans l'échantillon de 5' polyphsophatase-traité était beaucoup plus élevée que ceux de la contrepartie non traitée, ce qui confirme les résultats de discrimination cRT-PCR.
En résumé, le modèle de transcription du gène de cox2 de maïs est compliqué, et la stratégie cRT-PCR-basée discrimine effectivement et cartographie les isoformes multiples de l'ARNm de cox2.
Figure 1 : Aperçu de la stratégie cRT-PCR. Illustration des principales étapes de la stratégie cRT-PCR. 5'et 5'- - les deux échantillons d'ARN traités et non traités par l'ARN 5' polyphosphatase, respectivement. Les deux échantillons d'ADNc dérivés de 5' polyphosphatase-traités et non-traités ARN sont normalisés par 26S rRNA mature dans le maïs, et les transcriptions primaires et traitées sont discriminés en comparant les produits cRT-PCR. Pour le gène A, l'ARN correspondant a une extrémité primaire de 5' parce que l'abondance de produit de PCR de l'ARN polyphosphatase-traité de 5' est beaucoup plus haute que celle de l'homologue non-traité ; pour le gène B, les produits PCR des deux ensembles d'ARN mitochondriaux sont amplifiés à un niveau comparable, ce qui implique un terminus traité de 5' de l'ARN correspondant. La région de codage et les UTR sont représentés par la boîte grise et les lignes audacieuses, respectivement. CRT et apprêt pour la transcription inversée; Les amorces CF1, CF2, CR1 et CR2 et PCR flanquant la jonction de 5'-3' de la transcription circulaire; qCF et qCR - amorces divergentes pour RT-qPCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Évaluation de l'intégrité de l'ARN mitochondrial par électrophoresis de gel d'agarose. (A) Les ARN mitochondriales préparés à partir de grains de maïs 15-DAP. M marqueur moléculaire de l'ADN. (B) ARN mitochondrial de noyau après le traitement par 5' polyphosphatase et/ou circularisation par ligase d'ARN De T4. 5''' 'ARN mitochondrial après le traitement par 5' polyphosphatase; T4 et 5'MD, ARN mitochondrial après le traitement par polyphosphatase de 5' et circularisation par ligase d'ARN T4; T4 et 5'- ' ARN mitochondrial après la circularisation seulement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Efficacité de circularisation des nad5 et nad1 mRNAs estimées par RT-PCR. (A) et (D) Diagramme schématique des gènes nad5 et nad1, respectivement. Ex et exon. Les exons et les introns sont représentés sous forme de boîtes grises et de lignes courbes, respectivement. La position des amorces de transcription inversée RT1 et RT2 sont indiquées par des flèches. Les points noirs indiquent la position des amorces PCR, et la taille prévue des produits PCR est indiquée. sqF1, sqF2, sqR1, et sqR2 sont des amorces pour RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 et qR2 sont des amorces pour RT-qPCR. (B) et (E) RT-sqPCR analyse de l'efficacité de circularisation des mARN nad5 et nad1, respectivement. M marqueur moléculaire de l'ADN. (C) et (F) RT-qPCR analyse de l'efficacité de circularisation des mARN nad5 et nad1, respectivement. Les deux échantillons d'ADNc inversés transcrits par les amorces RT1 et RT2 sont normalisés par les produits PCR SQF2 et sqR2 (pour RT-sqPCR) ou qF2 et qR2 (pour RT-qPCR). L'efficacité de la circularisation des mARN nad5 et nad1 est estimée en comparant les produits PCR de sqF1 et sqR1 (pour RT-sqPCR) ou qF1 et qR1 (pour RT-qPCR). circularisé/(circularisé-linéaire) - qF1 et qR1 au-dessus de qF2 et qR2 dans la réaction de RT2/ qF1 et qR1 au-dessus de qF2 et qR2 dans la réaction de RT1. Les valeurs sont des moyens et des DD de trois répliques biologiques. Afin d'exclure l'influence potentielle de 5 triphosphates, les ARN ont été traités par 5 polyphosphatase avant l'auto-ligation. Total et Mito - ARN total et mitochondrial, respectivement. RT1 et RT2 - cDNAs inversé transcrit par RT1 et RT2 amorces, respectivement S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Cartographie des termini d'ARNm matures cox2 à l'aide de la stratégie cRT-PCR-cased. (A) Séparation des gels des produits cox2 cRT-PCR. et - cDNAs dérivés de 5 'polyphosphatase-traité et non-traité RNA mitochondrial, respectivement. Les deux échantillons d'ADNc ont été normalisés par amplification de 26S cDNA (26S). Cinq amorces sont utilisées pour l'analyse cRT-PCR de l'ARNm circulaire de cox2 : CF1, CF2 et CF3 sont des amorces non-paroissées, et CF2 et CF3 sont 69 et 138 pb en aval de CF1, respectivement; CR1 et CR2 sont des amorces nichées, et CR2 est 1.288 bp en amont de CR1. Les bandes indiquées par « 1 » et « 2 » ont été amplifiées par CF1 et CR1 et CF2 et CR1, tandis que les bandes « 3 » et « 4 » ont été amplifiées par CF3 et CR2. Les quatre groupes ont été séquencés par clonage. Les bandes marquées par des astérisques ne pouvaient pas être répétées, et elles ont été exclues des résultats. M marqueur moléculaire de l'ADN. (B) RT-qPCR analyse de l'abondance relative de l'ARNm circulaire de barre2 après le traitement de polyphosphatase de 5'. Les deux échantillons d'ADNc ont été synthétisés par un mélange d'amorce contenant 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT, et cox1-CRT à ratio égal, et l'ADNc dérivé de l'ARNr mature 26S a été utilisé pour la normalisation. Barreur2 de plus de 26S dans l'échantillon traité/barre2 au-dessus de 26S dans l'échantillon non traité. Les valeurs représentent les moyens et le SD de trois répliques biologiques. Les amorces utilisées pour RT-qPCR sont indiquées. (C) Analyse de tache nordique des transcriptions de cox2. L'ARN mitochondrial de 2 g a été chargé. Les bandes correspondant à différents isoformes de l'ARNm mature cox2 sont marquées. (D) Transcript termini of cox2 mRNA déduit des résultats cRT-PCR. Les URC et les cadres de lecture ouverts sont représentés sous forme de lignes audacieuses et de boîtes grises, respectivement. Les positions de 5' et 3' termini par rapport à AUG (no 1) et UAA (-1), et les nombres de clones uniques séquencés à ces positions sont indiqués. Les positions des amorces de transcription inversée et d'amplification PCR sont représentées sous forme de têtes de flèchefermées fermées et ouvertes, respectivement. Les amorces orientées vers l'extérieur utilisées pour RT-qPCR sont indiquées sous forme de carrés ouverts, et la position de la sonde cox2 est comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Sélection de clones positifs contenant des inserts de cox2-4 par colonie PCR. (A) Colony PCR pour filtrer les clones simples contenant des inserts de barre2-4. La taille de la barre2-4 insert est d'environ 1 165 pb, et celle des séquences vectorielles est de 100 pb. La taille calculée des produits PCR de la colonie est d'environ 1 265 pb, et les clones contenant des inserts de petite taille n'ont pas été séquencés, c'est-à-à-d. les numéros 11, 14, 22 et 23. (B) Résultats de séquençage des clones positifs examinés en (A). 5'/3' se termine par les extrémités de 5' et 3' par rapport à aug (no 1) et UAA (-1), respectivement. Les résultats de séquençage des numéros 12 et 20 ont été exclus parce qu'ils étaient beaucoup plus petits que les autres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| composant | Volume pour 50 l réaction (L) | Concentration finale |
| 10x ARN 5' polyphosphatase tampon | 5 Annonces | 1x 1x |
| Inhibiteur de la NAse (40 U/L) | 0,75 | 0,6 U/L |
| ARN mitochondrial | X | 0,2 g/L |
| RNA 5' polyphosphatase (20 U/L) | 2,5 Annonces | 1 U/L |
| H2O déionisé traité par DEPC | à 50 l | - |
Tableau 1 : Composants de réaction du traitement polyphosphatase de l'ARN 5.
| composant | Volume pour 20 l réaction (L) | Concentration finale |
| 10x T4 ARN ligase I tampon | 2 (en) | 1x 1x |
| dATP (1 mM) | 1 Fois | 50 M |
| PEG8000 (50%) | 6 Annonces | 15% |
| Inhibiteur de l'ARN (40 U/L) | 0,5 | 1 U/L |
| 5' polyphosphatase-traité ou non-traité ARN mitochondrial | X | 0,1 à 0,2 g/L |
| T4 RNA ligase I (30 U/L) | 0,4 | 0,6 U/L |
| DePC-traité déionisé H2O | à 20 l | - |
Tableau 2 : Composants de réaction de la circularisation de l'ARN mitochondrial.
| composant | Volume pour 10 l pré-mélange (L) |
| Mélange d'apprêt (1 m au total)a | 2 (en) |
| mélange dNTP (10 mm chacun) | 1 Fois |
| Arn mitochondrial circularisé de 5' polyphosphatase ou non traitéb | X |
| H2O déionisé traité par DEPC | à 10 l |
Tableau 3 : Pré-mélange pour la réaction de transcription inversée. a (en) Le mélange d'amorce contient un rapport égal de 26S-CRT et jusqu'à 7 autres amorces RT, et la concentration finale est de 1 M. bDeux pré-mélanges sont préparés côte à côte, et ils contiennent la même quantité (200 ng) de 5' circulaire polyphosphatase-traité ou ARN mitochondrial non traité.
| composant | Volume pour un système de réaction de 20 l (L) | Concentration finale |
| Template ARN/primer/dNTP | 10 Ans et plus | - |
| 5x tampon RTase | 4 ( en plus) | 1x 1x |
| Inhibiteur de la NAse (40 U/L) | 0,5 | 1 U/L |
| RTase (200 U/L) | 1 Fois | 10 U/L |
| DePC-traité déionisé H2O | à 20 l | - |
Tableau 4 : Composants de réaction de la transcription inversée. Le modèle DE pré-mélanges ARN/primer/dNTP préparé à l'étape 6.3.
| composant | Volume pour un système de réaction de 20 l (L) | Concentration finale |
| Déionisé H2O | 7 Annonces | - |
| 2x tampon de réaction | 10 Ans et plus | 1x 1x |
| mélange dNTP (10 mm chacun) | 0,4 | 0,2 mM chacun |
| 26S-CF1 (10 M) | 0,8 | 0,4 mm |
| 26S-CR1 (10 M) | 0,8 | 0,4 mm |
| Modèles cDNA dérivé de 5' circulaire sapolysphatase-traités ou non traités RNA | 0,6 | - |
| Polymérase d'ADN (1 U/L) | 0,4 | 0,02 U/L |
Tableau 5 : Composants de réaction pour l'amplification de PCR de 26S cDNA. Au départ, un volume égal de cDNA de modèle (0,6 L) est utilisé pour la normalisation. Si nécessaire, modifiez les quantités de cDNA de modèle pour assurer la même abondance de produits PCR 26S entre les deux réactions PCR.
| pas | température | temps | Numéro de cycle |
| Dénaturation initiale | 95 oC | 3 min | 1 cycle |
| Dénaturation | 95 oC | 15 sec | 22 à 25 cycles |
| Annexe d'apprêt | 56 oC | 15 sec | |
| prolongation | 72 oC | 30 sec | |
| Prolongation finale | 72 oC | 5 min | 1 cycle |
| tenir | 4 oC | ∞ | - |
Tableau 6 : Conditions de PCR à amplifier 26S (en) cDNA pour la normalisation.
| composant | Volume pour le système de réaction de 20 l (L) | Concentration finale |
| H2O déionisé | à 20 l | - |
| 2x tampon de réaction | 10 Ans et plus | 1x 1x |
| mélange dNTP (10 mm chacun) | 0,4 | 0,2 mM chacun |
| Apprêt divergent (10 M) | 0,8 | 0,4 mm |
| Divergentane inverse (10 m) | 0,8 | 0,4 mm |
| Template cDNA dérivé de la circulaire 5' polyphosphatase-traité ou non-traité ARN | X | - |
| Polymérase d'ADN (1 U/L) | 0,4 | 0,02 U/L |
Tableau 7 : Composants de réaction pour l'amplification du PCR des transcriptions cibles circulaires. Le volume des cDNA de modèle utilisés dans ces réactions est déterminé par les résultats de normalisation 26S rRNA.
| pas | température | temps | Numéro de cycle |
| Dénaturation initiale | 95 oC | 3 min | 1 cycle |
| Dénaturation | 95 oC | 15 sec | 22-40 cycles c |
| Primer annealing a | 50-65 oC | 15 sec | |
| Extenstion b | 72 oC | 0.5-1 min | |
| Extension Finatl | 72 oC | 5 min | 1 cycle |
| tenir | 4 oC | ∞ | - |
Tableau 8 : Conditions de PCR pour amplifier les transcriptions cibles. a (en) L'annealing exact tempéré dépend de la température de fusion des amorces PCR. b (en) Le temps d'allongement dépend de la longueur de la cible à amplifier. Le temps recommandé est de 1 min par 1 kb du fragment de PCR. c En général, les cycles de 30 à 35 sont suffisants pour produire une quantité suffisante de produit PCR. Pour les transcriptions peu abondantes, augmentez le nombre de cycles jusqu'à 40 cycles.
Figure S1 : Position des amorces pour les transcriptions mitochondriales représentatives du maïs. CRT - amorce de transcription inversée; CF1, CF2, CR1 et CR2 - amorces divergentes pour l'amplification du PCR; qCF et qCR - amorces divergentes pour RT-qPCR. La transcription termini de maïs nad2-1, rps4-1, et nad4-1 ont été déterminées précédemment (Zhang et al., 20191). Les positions de 5'- et 3'-extrémités par rapport à AUG (no 1) et le dernier nucléotide de codon d'arrêt (-1) sont indiqués. Les régions de codage et les URT sont indiquées comme des boîtes grises et des lignes audacieuses, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S2 : Principe d'estimation de l'efficacité de la circularisation de l'ARNm nad5 dans le maïs. Dans une réaction d'auto-ligation, seule une fraction des ARN mitochondriaux est circularisée. Pour calculer le rapport de l'ARNm nad5 circulaire, deux amorces spécifiques aux gènes sont utilisées pour synthétiser les premiers arnacaux, c'est-à-dire nad5-RT1 et -RT2. Dans la réaction de transcription inversée nad5-RT2 (RT), les produits PCR amplifiés par sqF2 et sqR2 (pour RT-sqPCR) et qF2 et qR2 (pour RT-qPCR) sont dérivés du nad5 linéaire et circulaire, tandis que les sqF1 et sqR1 (pour RT-sqPCR) et qFPCR) et qFPCR les produits PCR sont dérivés du nad5 circulaire 5 seulement; dans nad5-RT1 réaction, les quatre paires d'amorces PCR pourrait amplifier les deux formes de nad5. Pour calculer le rapport de l'ARNm nad5 circulaire, les deux réactions sont normalisées par les produits PCR sqF2 et sqR2 ou qF2 et qR2. En comparant l'abondance des produits PCR sqF1 et sqR1 ou qF1 et qR1 entre les deux réactions RT, l'efficacité de la circularisation de l'ARNm nad5 est à peu près estimée. ex -exon. Les exons et les introns sont représentés sous forme de boîtes grises et de lignes courbes, respectivement. Les positions des amorces nad5-RT1 et -RT2 sont indiquées par des flèches. Les points noirs indiquent les positions des amorces PCR, et la taille prévue des produits PCR est affichée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau S1 : Informations d'apprêt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux de la culture de suspension cellulaire d'Arabidopsis ont été employés pour cartographier le termini mitochondrial de transcription par cRT-PCR, et des résultats semblables ont été obtenus12. Cependant, seulement l'ARN mitochondrial enrichi a été employé pour cartographier le termini de transcription mitochondrial dans beaucoup d'autres études1,2,3,9. Nous avons constaté que l'enrichissement de l'ARN mitochondrial est une étape importante pour la cartographie cRT-PCR des termini de transcription mitochondriale dans le maïs. Après cet enrichissement, le rapport de l'ARN mitochondrial circulaire est considérablement augmenté de 0,3 % à 30 % (figure3 et figure S2),ce qui rend possible l'amplification des transcriptions cibles circulaires dans un cycle de PCR.
L'efficacité de circularisation de l'ARN mitochondrial a été estimée par l'analyse RT-PCR sur le maïs nad1 et nad5,qui sont tous deux divisés en précurseurs indépendants par cis-épissage introns. Étant donné que l'influence potentielle de la présence d'ARN précurseurs ainsi que la variation de l'efficacité de la RT ne pouvait pas être exclue, ce n'est qu'une estimation approximative de l'efficacité réelle de la circularisation de l'ARN mitochondrial.
Nous avons modifié les conditions d'auto-ligation en modifiant la concentration de l'ARN mitochondrial et de PEG8000, ainsi qu'en allongeant le temps d'incubation, mais ces changements ne semblent pas affecter l'efficacité de la circularisation de l'ARN mitochondrial. Bien que nous ne soyons pas sûrs si une autre purification du gradient Percoll pourrait augmenter l'efficacité de la circularisation, la qualité de la mitochondrie brute préparée à la section 2 est suffisante pour la cartographie cRT-PCR des termini de transcription mitochondriale dans le maïs. Étant donné que plusieurs séries de PCR peuvent causer de faux résultats positifs, l'amplification des transcriptions cibles en un seul PCR rond rend les résultats de cartographie plus fiables.
Le triphosphate de 5' des transcriptions primaires est instable, et il pourrait être converti en monophosphate de 5' pour des raisons inconnues. Ce problème entrave une différenciation claire entre les transcriptions primaires et traitées en utilisant des approches en fonction de la présence/absence de triphosphate de 5'1,2,4. La forme mature du maïs 26S rRNA a une extrémité monophosphated 5', et il est insensible à l'ARN 5' polyphosphatase. Pour minimiser l'influence de l'instable 5' triphospahte, mature 26S rRNA est utilisé pour normaliser les deux échantillons d'ARN, traités et non traités par 5' polyphosphatase, et il est montré être une étape importante pour différencier les deux types de transcriptions dans le maïs Mitochondrie. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées pourraient être discriminées en comparant les résultats cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des échantillons d'ARN polyphosphatase-traités et non traités de 5'. Les transcriptions primaires sont sensibles à la polyphosphatase de 5' et sont fortement amplifiées à partir de l'échantillon de 5' traité à la polyphosphatase, mais pas (ou à un niveau très bas en raison de l'instable triphosphate de 5') de l'échantillon non traité. En revanche, les transcriptions traitées sont détectées à des niveaux comparables entre les deux échantillons.
Chez les plantes, les modèles de transcription de nombreux gènes mitochondriaux sont assez compliqués1,2. Par exemple, les gènes nad6 et atp6 du maïs sont exprimés à la fois comme monocistrons et dicistrons, et nad6, atp6, et atp6-na6 na6 nARA matures ont deux, trois, et deux isoformes, respectivement. En outre, la population de transcription d'un gène mitochondrial est réellement un mélange de précurseur, mûr, et LA dégradation RNAs. Les PCR sont enclins à amplifier les molécules de petite taille, et il est difficile de détecter tous les isoformes de transcription à l'aide d'une paire d'amorces. Par conséquent, l'hybridation de tache de gel d'ARN est exigée pour vérifier les résultats de cartographie de cRT-PCR, et les amorces alternatives peuvent être nécessaires pour amplifier ces transcriptions détectées dans le nord de tache mais pas par la première fois cRT-PCR.
Ce protocole comprend une étape RT-qPCR pour vérifier les résultats de discrimination cRT-PCR. Étant donné que les isoformes multiples de certainsARNm matures sont très proches de la taille 1, il est impossible de confirmer tous les résultats de discrimination par RT-qPCR, et certaines transcriptions à état stable ont été déterminées en comparant les résultats cRT-PCR entre les traités et les ARN non traités seulement.
Dans ce protocole, les termini de 5' et 3' des transcriptions cibles ont été cartographiés par clonage et séquençage des produits cRT-PCR, et il limite le nombre de clones uniques à séquencer. Comme méthode alternative, les produits cRT-PCR pourraient être séquencés par le séquençage de prochaine génération, qui séquence des milliers de molécules pour un ensemble de transcriptions à état stable, et les résultats de cartographie seraient plus précis.
Outre la discrimination des termini primaires et traités de 5' par cRT-PCR et RT-qPCR, le monophosphate 5' termini pourrait être déterminé par l'identification des structures secondaires d'ARN environnantes1,12. Il est bien connu que les structures secondaires d'ARN telles que tRNA et t-élément pourraient médiatiser la formation de fin de transcription mitochondriale en dirigeant des clivages endonucleolytiques de RNase P et/ou RNase Z12,18,19, 20. Par conséquent, ces termini de 5' adjacents à l'ARNt ou à l'élément t devraient être dérivés du traitement post-transcriptionnel et contenir des monophosphates.
En utilisant ce protocole, une grande partie des transcriptions à l'état stable ont été déterminées dans les mitochondries de maïs1. Cependant, quelques-uns n'ont pas été différenciés et/ou cartographiés pour des raisons inconnues1. En outre, nous pensons que la position de 5' transcript termini est préférable d'être confirmée par l'analyse d'extension d'amorce, bien qu'il soit inclus dans ce protocole. En raison du manque de données expérimentales, nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie convient à d'autres espèces végétales, comme le riz (Oryza sativa) et Arabidopsis. Outre les mitochondries végétales, les transcriptions primaires et traitées sont accumulées de façon stable dans les plastides21, et il n'est pas certain que cette stratégie pourrait être utilisée pour cartographier et discriminer les transcriptions plastides.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 31600250, Y.Z.), les projets scientifiques et technologiques de la ville de Guangzhou (subvention no 201804020015, H.N.), et le China Agricultural Research System (subvention no. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
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