Summary
אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.
Abstract
ב המיטו, כמה תעתיקים של מדינה יציבה יש 5 ' טריפוספט נגזר תעתיק שעתוק (התעתיקים העיקריים), בעוד האחרים מכילים 5 ' monophosphate שנוצרו לאחר ההמרה (תעתיקים מעובד). כדי להפלות בין שני סוגי התעתיקים, פותחו מספר אסטרטגיות, ורובן תלויות בנוכחות/העדר של 5 טריפוספט. עם זאת, טריפוספט ב 5 ' termini העיקרי הוא לא יציב, והיא מעכבת אפליה ברורה של שני סוגים של תעתיקים. כדי להבדיל באופן שיטתי ולמפות את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מספק תירס המיטו, פיתחנו מעגלי RT-PCR (cRT-PCR) מבוססי אסטרטגיה על ידי שילוב cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהופטואז טיפול, כמותי הכתם הצפוני (RT-qPCR). כשיפור, אסטרטגיה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA כדי למזער את ההשפעה של 5 ' טריפוספט לא יציב.
בפרוטוקול זה, רנ א מיטוכונדריאלי מועשר מטופל מראש על ידי RNA 5 ' פוליפהוספטאז, אשר ממיר 5 ' triphsophate נאה monophosphate. לאחר שעתוק מעגלי ותמלול הפוכה, שני הcdnas הנגזרים מ-5 ' פוליפהוספטאז ' והוא לא מטופל, הם מנורמתים על-ידי ממגורות של תירס 26S בוגרת rRNA, שהיא בעלת מעבד 5 מעובד ואינה רגישה לתוך 5 ' פוליפהוספטאז. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים מפלים בהשוואת מוצרי cRT-PCR ו-RT-qPCR המתקבלים מתוך RNAs המטופל ושאינו מטופל. התמליל נקבע על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, ולאחר מכן מאומת על ידי הכתם הצפוני.
על ידי שימוש באסטרטגיה זו, רוב התעתיקים של המצב היציב ביותר של תירס מיטוכונטרלון נקבעו. בשל דפוס התעתיק המסובך של כמה גנים מיטוכונדריאלי, לא הובחנו ו/או מופו מספר תעתיקים של מצבים יציבים, למרות שזוהו בכתם הצפוני. אנחנו לא בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה להפלות ולמפות את התעתיקים של המצב היציב במיטוהצמחים או בפלסטלינה.
Introduction
במפעל המיטומטר, rnas רבים מבוגרים ומקודחים נצברים כמו מספר isoforms, ואת התעתיקים של מצב יציב ניתן לחלק לשתי קבוצות מבוסס על ההבדל ב 5 ' הקצוות שלהם1,2,3, ד. התעתיקים העיקריים יש 5 ' טריפוספט קצוות, אשר נגזר שעתוק חניכה. לעומת זאת, לתעתיקים המעובדים יש 5 ' monophosphate שנוצרו על-ידי עיבוד פוסט-טרנססקריפט. אפליה ומיפוי של שני הסוגים של התעתיקים חשובים כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תעתיק וההבשלה של תעתיק.
כדי להבחין בין התעתיקים העיקריים והמעובדים במפעל המיטומטר, פותחו ארבע אסטרטגיות עיקריות. האסטרטגיה הראשונה היא לטפל מראש עם rnas מיטוכונדריאלי עם חומצת טבק פירופוספאטאז (ברז), אשר ממיר 5 ' טריפוספט כדי monophosphate ומאפשר התעתיקים העיקריים להיות מעגלי על ידי RNA ligase. התעתיק מריקודי ה-RNA שטופלו בסטפס ושאינם מטופלים מושווים באמצעות הגברה מהירה של קצוות cdna (מרוץ) או מעגלי RT-pcr (cRT-pcr)2,3,4. באסטרטגיה השנייה, התעתיקים המעובדים הם ראשית לרוקן rnas מיטוכונדריאלי באמצעות שליחות קטלנית 5 '-פוספט תלוי-החכירה (TEX), ואת התעתיקים העיקריים שמאל ממופים מכן על ידי פריימר הארכה ניתוח5,6 . האסטרטגיה השלישית היא טרום המכסה את התעתיקים העיקריים באמצעות guanylyl transferase, ולאחר מכן את המיקום של triphosphated 5 ' termini נקבע על ידי פריימר הארכה יחד עם ריבונוקלאז או S1 הגנה ההגנה מפני שכירות7,8 ,9. שונה מאלה בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, האסטרטגיה הרביעית משלבת בתמלול מחוץ למבחנה, מוטזיס מונחה אתרים וניתוח הארכה כדי לאפיין את היזמים ולקבוע את התמלול . מקומות החניכה8,10,11 על-ידי שימוש באסטרטגיות אלה, תעתיקים ראשוניים ומעובדים רבים נקבעו ב המיטו, הצמח.
עם זאת, מספר מחקרים דיווחו כי 5 ' הטריפוספט של התעתיקים העיקריים היו יציבים, והם הומרו בקלות monophosphate מסיבה לא ידוע2,4,12,13. בעיה זו מעכבת אפליה ברורה של שני סוגי התעתיקים באמצעות טכניקות בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט, ומאמצים קודמים להפלות באופן שיטתי בין התעתיקים הראשוניים והמעובדים במפעל מיטוכונמיטוa נכשל2,12.
בפרוטוקול זה, אנו משלבים cRT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז הטיפול, RT-qPCR, והצפוני כתם כדי להבדיל באופן שיטתי את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מאוד תירס (Zea מייז) המיטורציה (איור 1). cRT-PCR מאפשר מיפוי סימולטני של 5 ' ו-3 ' הגפיים של מולקולת RNA, והוא מותאם בדרך כלל למפות את המפה לתוך מפעלים2,12,14,15. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז יכול להסיר שני פוספטים מן triphosphated 5 ' termini, מה שהופך את התעתיקים העיקריים זמין לצורך הפצה עצמית על ידי RNA ligase. מחקרים קודמים הראו כי 26 בוגרים rrna ב תירס עיבד 5 ' הטרמינוס, וזה היה חסר רגישות RNA 5 ' פוליפהוספטאז1,16. כדי למזער את ההשפעה של טריפוספט יציב בראשית 5 ' termini, the 5 ' פוליפהוספטאז-טיפל ושאינם מטופלים rnas הם מנורמל על ידי rrna בוגרת, ואת התעתיקים העיקרי ומעובד הם הבדיל מכן על ידי השוואת ה מוצרי cRT-PCR המתקבלים משתי דגימות ה-RNA. המיפוי של ה-cRT-PCR ותוצאות האפליה מאומתים על-ידי הכתם הצפוני ו-RT-qPCR, בהתאמה. בסופו של דבר, משתמשים בצבעי יסוד חלופיים כדי להגביר את התעתיקים שאותרו באבן החשופה בצפון, אך לא באמצעות cRT-PCR. על-ידי שימוש באסטרטגיה זו מבוססת cRT-PCR, התעתיקים הקבועים ביותר במיטוכונטריום בתירס הובלו ומופו1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פריימר עיצוב
- עיצוב בצבעי יסוד ספציפיים לשימוש בתעתיק הפוך (RT) באמצעות תוכנת עיצוב PCR (טבלת חומרים) המבוססת על הכללים הכלליים של העיצוב הכללי17.
הערה: RT התחל הם ספציפיים מאוד את התעתיקים היעד, והם מעוגנים בדרך כלל על 5 ' החלק של רצפי קידוד (mRNAs מבוגרים ו RNAs מקודמן), או ~ 500 – 600 nt במורד של הצפוי 5 ' סוף (18S ו-26S rRNAs). - להגביר את התעתיקים המפוצלים. של הדגם cRT-PCR
הערה: התחל המיועד לזווג את הצומת 5 ' -3 של התעתיקים המעגליות, ומיקומם משתנה בין התעתיקים של המטרה שנותחו (איור S1). לחלק מתעתיקים יש UTRs ארוכים; לדוגמה, nad2-1 5 ' utr ו- rps4-1 3 ' utr הם 1,985 ו-1826/1834, בהתאמה1. יהיה קשה להגביר את. התעתיקים של המטרה לעומת זאת, כמה UTRs הם קצרים; לדוגמה, 3 ' UTRs של nad2-1 ו- nad4-1 הם 34/35 ו -29 – 31 nt, בהתאמה1. אם התחל הזווג ממוקם הרחק מרצפי הקידוד, ה-PCR ייכשל. באופן כללי, שני זוגות של תחל מפוצלים מיועדים עבור כל תעתיקים של יעד, בעוד זוגות מרובים עשויים להיות נחוצים כדי למפות את אלה שדפוסי התעתיק שלהם הם מסובכים ו/או UTRs הם ארוכים מאוד. - עיצוב זוגות של התחל מתכנסת כדי להכין בדים של RNA עבור הכתם הצפוני.
הערה: התחל לזווג ממוקמים על אזור קידוד של הגן היעד, ואת גודל המוצר PCR צריך להיות בטווח של 100 כדי 1,000 bp. כל פריימר קדימה צריך להכיל אתר אנזים הגבלה כדי למזער רצפים וקטוריים בבדיקות שהתקבל.
2. הכנת מיטוכונמיטו, מ תירס פיתוח גרעינים
- לחטא את הקוצים, מרגמות, זכוכית funnels, צינורות, וטיפים על ידי החיטוי, ולייבש אותם בתנור.
- בצע את כל ההליכים ב-4 ° צ' או על הקרח, ולפני הגניבה כל הפתרונות.
- להכין 100 mL של מאגר החילוץ (EB), מורכב 0.3 M סוכרוז, 5 מ"מ הטטרפוספט מילימטר, 10 מ"מ KH2PO4, 2 מ"מ edta, 1% [w/v] polyvinylפירוסיים 40, 1% [w/v] הסרום הבקר, 5 מ"מ L-cysteine, ו 20 מ"מ חומצה אסקורבית. להתאים ל-pH 7.3 עם KOH ולעקר על ידי סינון.
- להכין 100 mL של מאגר לשטוף (WB) המורכב 0.3 M סוכרוז, 1 מ"מ EGTA, ו 10 מ"מ מנקה (3-(N-שורגואולנו) חומצה propanesulfonic). להתאים ל-pH 7.2 עם NaOH ולעקר על ידי סינון.
הערה: היא הציעה להכין EB ו-WB באמצעות DEPC מטופלים התייחס H2O. - לאסוף 20 g לפתח גרעינים ב 11 – 20 ימים לאחר האבקה (DAP) כדי שפופרת 50-mL ממוקם על הקרח, ולאחר מכן להעביר את הגרעינים כדי מקורר מקורלים.
הערה: השתמש ביחס של 100 mL של EB כדי 20 גרם של גרעינים תירס. - הוסיפו 10 – 20 מ ל לחומר מליטה, וטוחנים את הגרעינים לחלוטין.
- להוסיף EB, ולסנן את רקמות הקרקע דרך שתי שכבות של בד סינון (טבלת חומרים).
- צנטריפוגה את פילטרט ב 8,000 x g עבור 10 דקות, ולמחוק את הגלולה.
- העבר את הסופרנטאנט לצינור חדש, וצנטריפוגה אותו ב 20,000 x g עבור 10 דקות.
- שפוך את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-6 מ ל WB.
- מחלקים את ההשעיה לחמש 1.5 mL RNase-שפופרות חינם, ו צנטריפוגה אותם ב 14,000 x g עבור 5 דקות.
- השמט את הסופרנטאנט, הקפא את הגלולה היטוכונדריטית בחנקן נוזלי, ואחסן ב-80 ° c.
3. הוצאת רנ א מיטוכונדריאלי
- לחלץ RNA מיטוכונדריאלי עם מגיב מסחרי (טבלת חומרים) על פי הוראות הייצור.
זהירות: מגיב זה מכיל פנול ו guanidine isothiocyanate. , תעבוד עם זה בתוך מכסה המנוע. ותלבש חלוק וכפפות מעבדה - לפזר את ה-RNA מיטוכונדריאלי מבודד ב-DEPC, שטופלו ב-H2O, ולאמוד ריכוז RNA וטוהר עם ספקטרוסקופיה (שולחן חומרים).
הערה: באופן כללי, ~ 250 μg RNA מיטוכונדריאלי מתקבל מ-20 גר' גרעינים של 15-DAP תירס. - הכינו ג'ל אחד מורכב של 1 x טה מאגר (40 mM טריס, 20 מ"מ חומצה אצטית, 1X EDTA), 1.5% agarose (טבלת חומרים), ו-1x צבע גרעיני מכתים (טבלת חומרים).
- הוסף נפח מתאים של מאגר טעינת 10x (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול), ו טען מיטוכונדרימי RNA/טעינת מאגר העמסה ב 1.5% agarose ג'ל.
- הפעל את ג'ל ב 1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 20 – 25 דקות, ולהעריך את שלמות RNA מיטוכונדריאלי על ידי דימות ג'ל עם מערכת התיעוד ג'ל (טבלת חומרים).
הערה: הנוכחות של שתי להקות נפרדות (~ 3,510 ו-~ 1,970 nt עבור תירס מיטוכונדריאלי 26S ו 18S rRNAs, בהתאמה) הוא תקן מקובל עבור RNA מיטוכונדריאלי שלם. כדי לא לכלול השפלה אפשרית, שלמות RNA יש לחקור במהלך השלבים המרובים של הכנה מעגלי RNA (איור 2).
4. רנ א 5 ' פוליפהוספטאז טיפול
- הגדר את ה-RNA 5 ' פוליפהוספטאז (טבלה וחומרים) טיפול (שולחן 1), ו דגירה ב 37 ° c עבור 30 – 60 דקות.
- לשחזר את 5 ' פוליפהוספטאז התייחסו RNA עם ערכת טיהור RNA (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
- חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.
5. רנ א הסיקולריזציה
- הכינו שתי תגובות מעגליות תוך שימוש באותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז-שטופלו ומיטוכונדריאלי שאינם מטופלים (שולחן 2), ו דגירה שתי התגובות ב 16 ° c עבור 12-16 h.
- שחזר את שתי הערכות של RNAs באופן עצמאי באמצעות אותה ערכה כמו בשלב 4.2.
הערה: יצוין כי רק חלקיק של RNA מיטוכונדריאלי יהיה עצמית ליגולי, ו-RNA התאושש יהיה תערובת של תעתיקים ליניארי ומעגליות. - חזור על שלבים 3.3 עד 3.5.
6. תמלול הפוכה
- סנתז שני סטים של cDNAs מאותם כמויות של 5 ' פוליפהוספטאז שטופלו ולא מטופלים RNAs (200 ng).
- הכינו את התערובת על ידי הוספת יחס שווה של 26S-CRT ועד 7 התחל של שונים.
הערה: הריכוז הסופי של התערובת התחל. צריך להיות 1 μM - הכינו שני תערובות מראש על ידי שילוב הריאגנטים המפורטים בטבלה 3, הדגירה ב 65 ° c עבור 5 דקות, ולאחר מכן להירגע על קרח עבור 2 דקות.
- להרכיב שתי מערכות התגובה RT (שולחן 4), ו הדגירה אותם ב 42 ° צ' עבור 50 דקות.
- החום הן תגובות RT ב 70 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן לצנן אותם על קרח.
7. נורמליזציה
- הכינו שתי תגובות PCR על ידי הוספת אותו נפח של התבנית cDNAs שנגזר 5 ' פוליפהוספטאז-מטופלים או RNAs שאינם מטופלים, מפוצלים בתוך מבנה של 5 '-3 ' הצומת של מעגלי 26S rRNA (כלומר 26S-CF1 ו-CR1), וכו ' (טבלה 5).
- הפעל את שתי התגובות בציקלנר תרמי (טבלת חומרים) בתנאים המתוארים בטבלה 6.
- הכינו ג'ל אחד שמורכב מ-1 x מאגר טה, 1.0% agarose, ו-1x צבע גרעיני מכתים.
- הוסף 2 μl 10x טעינת המאגר (0.5% ברומאופנול כחול, 0.5% קסילן FF, ו 50% גליצרול) לכל אחד משני מוצרי ה-PCR, ולטעון אותם על ג'ל.
- הפעל את ג'ל ב-1 x טה מאגר ב 5 – 6 V/cm עבור 30-40 דקות, והתמונה היא באמצעות מערכת התיעוד ג'ל אותו כמו שלב 3.5.
- השווה את השפע של שני מוצרי ה-PCR באמצעות תוכנת מחשב (טבלת חומרים, איור 4a) ומיטוב הנורמליזציה על-ידי שינוי כמויות ה-cdnas של תבניות במידת הצורך.
8. הגברה של הPCR
- הכינו זוגות של תגובות ה-PCR על-ידי הוספת נפח מתאים של cDNAs מנורמל וזוג משני האגפים המפוצלים של 5 ' -3 ' של התעתיקים של היעד (שולחן 7).
הערה: כמות התבניות של cDNAs המשמשת להגברה של ה-PCR של תעתיקים של היעד נקבעת על-ידי תוצאות הנורמליזציה של 26 rRNA. - בצע את תגובות ה-PCR לפי התוכנית המתוארת בטבלה 8.
- חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
- שנה לצבעי ההתחלה המפוצלים ואמת את התוצאות העגולות של ה-PCR על-ידי שלבים חוזרים 8.1 ו-8.2.
- חזור על שלבים 7.3 עד 7.5.
- לשחזר את הלהקות הבולטות שניתן לחזור בשני סיבובים של הגברה PCR באמצעות ערכת ה-DNA ג'ל התאוששות (לוח חומרים).
9. קביעת תעתיק טרמיני
- שיבוט מוצרי ה-PCR מטוהרים לתוך וקטור בוטה-סוף (טבלת חומרים) באמצעות טכניקות סטנדרטיות.
- לבצע את ה-PCR המושבה כדי לבחור שכפולים חיוביים המכילים את מוסיף היעד, ולסדר אותם באופן מסחרי.
הערה: שיבוטים חיוביים המכילים מוסיף עם גודל משתנה מזוהים בדרך כלל מלהקה אחת התאושש בגלל הרבה המדינה יציבה התעתיקים של מיטוכונדריאלי צמח הטרוגנית 5 ' ו/או 3 ' מסתיים1,12. - יישר את הנתונים ברצף עם גנום מיטוכונדריאלי באמצעות היישור המקומי הבסיסי כלי חיפוש (הפיצוץ) של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI). בחר אורגניזם "תירס (מטקת: 4577)", וחפש במאגר המידע "אוסף נוקלאוטיד (nr/nt)".
- מצא את הצומת 5 ' 3 ' של תעתיק מעגלי, וקבע את מיקומם של 5 ' ו-3 ' תעתיק termini.
- לחשב את הגודל של התעתיקים היעד.
10. אימות התוצאות של מיפוי ה-cRT-PCR על-ידי כתמי היברידיזציה
הערה: רנ א ג'ל אבן היברידיזציה מבוצעת באמצעות ערכה מסחרית (טבלה של חומרים), אשר מכיל את הריאגנטים עבור תמלול-תיוג של RNA עם digoxigenin (לחפור) ו T7 RNA פולימראז, היברידיזציה, וזיהוי חיסולוגי. נא עיין בפרוטוקולים המסופקים בערכה זו לקבלת פרטים נוספים. ודא שרק RNase ציוד חופשי משמש עבור ההליך כולו.
- הגבר את קטע ה-DNA המשמש להכנת בדיקה RNA, ושיבוט אותו לאותו וקטור כמו בשלב 9.1, אשר מכיל את היזם T7 17 bp במעלה הזרם של אתר הכניסה.
- Linearize המבנה באמצעות אנזים הגבלה נאותה, לשחזר את פלדמיד לינארי על ידי ערכת טיהור DNA (טבלה של חומרים), ולפזר אותו ב-depc התייחס H2O.
- תווית RNA בדים עם לחפור -11-UTP על ידי ערכת מסחרית (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
- להכין 500 mL של מאגר מגבים 10x (0.2 M מגבים, 50 mM אצטט נתרן, ו 10 מ"מ EDTA) באמצעות DEPC מטופל H2O. התאם ל-pH 7.0 על ידי naoh, ולעקר על ידי סינון.
- הוסף 2 – 3 כרכים של העמסה מאגר (50% הטופס1, 6.2% פורמלדהיד, 1x מאגרים, 10% גליצרול, ו 0.1% ברומאופנול כחול) אל RNA מיטוכונדריאלי מוכן בשלבים 3.1 – 3.3.
- הספרות הראשונה לדגם RNA/טעינת מאגר ההעמסה ב-65 ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן להירגע על הקרח במשך 1 דקות.
- הכינו ג'ל שאינו מבוקר (2% פורמלדהיד, 1.2% agarose, ו-1x מגבים), וטען את התערובת RNA לדוגמה/טעינת מאגר לג (1 – 2 μg RNA מיטוכונדריאלי לכל טוב).
- הפעל את ג'ל ב-1x מגבים ב 3 – 4 V/cm עבור ~ 4 h.
- הכינו 2 ליטר של היחידה למען המאה ה -20 (3 מ7.0 0.3). לטפל בזה עם 0.1% DEPC לילה, ולעקר על ידי החיטוי.
- לשטוף את הג פעמיים ב-20x למטה (15 דקות בכל פעם), ולהעביר ג'ל RNA לקרום ניילון (טבלה של חומרים) על ידי העברת קפילר עם 20x למעלה במשך 10 – 16 h.
- תקן את ה-RNA לממברנה על ידי אפייה ב 120 ° c עבור 30 דקות.
- בצע היברידיזציה של RNA וזיהוי אימונוולוגי עם ערכת מסחרית (טבלת חומרים) לפי הוראת היצרן.
11. אפליה של מסתיים ראשי ומעובד 5
- להפלות את הקצוות הראשוניים והמעובדים של 5 באמצעות השוואת מוצרי cRT-PCR המתקבלים מתוך המערכת המנורמלת והבלתי-מטופלת מסוג 5 המנורמל.
הערה: לתעתיקים העיקריים, השפע של מוצרי ה-PCR מתוך 5 ' פוליפהוספטאז-RNA מטופל הרבה יותר גבוה מאשר מעמיתו שאינו מטופל (איור 1, ' גן א, ' ואיור 4a). עם זאת, כדי לעבד את התעתיקים, רמה דומה של מוצרי PCR תהיה מוגברת משתי קבוצות של RNAs מיטוכונדריאלי (איור 1, ' ג'ין B '). - . מבוסס על תוצאות מיפוי ה-cRT-PCR
- בדוק את תוצאות האפליה של ה-cRT-PCR על-ידי RT-qPCR.
הערה: שני דגימות ה-Dna הנגזרות 5 ' פוליפהוספטאז, RNAs מטופלים שאינם מטופלים הם מנורמל על ידי מוצרים RT-qPCR של 26S בוגרת rRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של יעילות מיטוכונדריזה של RNA
במחקר קודם, שניהם RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי שימשו עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי termini ב arabidopsis (arabidopsis thaliana), ושני סוגים של rnas נתן תוצאות מיפוי דומה12. בתחילה, השתמשנו גם RNAs הכולל עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לאחר ניסויים רבים, מצאנו את. התעתיקים של המטרה היו קשים לזיהוי כשיפור, אנו העשירו RNA מיטוכונדריאלי מ תירס פיתוח גרעינים, וזה עשה את הגברה של התעתיקים היעד המעגל בסיבוב אחד של ה-PCR אפשרי.
כדי להסביר את הגברה קלה של תעתיקים היעד לאחר העשרה, אנו מעריכים את RNA מעגליות היעילות על ידי ביצוע RT-בדיקות על מיטוכונדריאלי גן nad5 (איור 3 ואיור S2). הג nad5 גן מכיל שני... לאחר הארכה עצמית של RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי, cDNAs first סטרנד היו באופן עצמאי מסונתז באמצעות nad5-RT1 ו-RT2 התחל. שני הצבעי היסוד יכולים להפוך להיות ליניארי ומעגליות nad5 mrnas (איור S2). ארבעה זוגות של התחל מתכנסת משמשים עבור הגברה PCR: sqF1 & sqR1 ו sqF2 & sqR2 עבור חצי כמותי RT-PCR (RT-sqPCR) ו qF1 & qR1 ו qF2 & qR2 עבור RT-qPCR. עבור cDNAs ששועתק על ידי nad5-RT1, כל ארבעת הזוגות של התחל זוהו הן מעגליות וליניארי Nad5 מבוגרים mrnas; עבור תגובת הnad5-RT2 הפוכה, SqF2 & SqR2 ו QF2 & qR2 סקר את שתי הצורות של mrna, בעוד SqF1 & SqR1 ו QF1 & qR1 PCR מוצרים נגזר ממעגל nad5 בלבד. בהתבסס על ניתוח זה, השתמשנו sqF2 & sqR2 (עבור rt-sqpcr) ו qF2 & qR2 (עבור rt-qpcr) מוצרי PCR כדי לנרמל את התגובות שעתוק nad5-RT1 ו-RT2, והעריך את היחס של nad5 מעגליות על ידי השוואת ה sqF1 & sqR1 (עבור RT-sqPCR) או qF1 & qR1 (עבור מוצרים מתוצרת RT-qPCR). לפני ההאזנות עצמית, RNAs טופלו מראש על ידי RNA 5 ' פוליפהוספטאז כדי להפוך את כל התעתיקים הזמינים עבור circularization על ידי RNA ligase. הניתוח RT-sqPCR הראה שבר קטן מאוד של nad5 mrna היה מעגלי כאשר rna הכולל שימש, אבל היחס היה גדל באופן דרמטי כאשר rna מיטוכונדריאלי מועשר שימש (איור 3b). התוצאות RT-qPCR הראו כי היחס של nad5 mrna עצמית הוגדלה מ 3.7% כדי 32% לאחר העשרה (איור 3c). ניתוח של nad1 נתן תוצאות דומות, ואת היעילות הcircularization של nad1 mrna עלה מ 0.7% כדי 30% (איור 3d-F).
בניתוחים אלה, כ-30% תירס מיטוכונדריאלי שהיו מתאבקים בעצמם לאחר השיפור, והיעילות המעגליות המוגברת מסבירה את הגילוי הקל של תעתיקים של המטרה באמצעות cRT-PCR.
קביעת התירס cox2 Mrna termini באמצעות האסטרטגיה המבוססת על cRT-PCR
השתמשנו cox2 gene כדוגמה להציג את המיפוי והאפליה של התעתיקים של מיטוכונדריאלי תירס באמצעות האסטרטגיה מבוססי CRT-PCR (איור 4).
בתחילת מיפוי cox2 mrna, שלושה הפונה כלפי חוץ CF1, CF2, ו CR1 תוכננו על אזור קידוד גנים (איור 4d). CF1 ו CF2 היו מקוננים התחל, ו CF2 היה 69 bp במורד הזרם של CF1. שימוש בתבנית cDNAs מסונתז בשלבים 6.1 – 6.5 ומנורמל בשלבים 7.1 – 7.6, CF1 & CR1 פריימר מוגבר שתי להקות בולטות, ואת תוצאות הגברה חזרו על ידי מקוננים התחל CF2 & CR1 (איור 4A). יתר על כן, שתי הלהקות היו מוגבר בחוזקה מן 5 ' polyphsophatase התייחס RNA, בעוד הם היו קשה לזהות את המקביל הלא מטופלים, מציע כי הם רגישים RNA 5 ' polyphsophatase יש הראשי 5 ' termini.
שתי להקות המועמדים נקראו cox2-1 ו-2, והם התגלו באופן עצמאי ג'ל העלה ושוכפל לתוך וקטורים. תוצאות המושבה הראו כי שיבוטים חיוביים מכילים מוסיף בגודל משתנה, רומז הטרוגנית 5 ו/או 3 ' termini של התעתיקים (איור 5). המשובטים החיוביים היו רצף מסחרי, ואת הנתונים ברצף היו מיושרים עם גנום מיטוכונדריאלי תירס כמתואר בשלב 9.3.
תוצאות הרצף והיישור הראו כי שני התעתיקים היו זהים בקצוות של 3, אבל שונים באורך של 5 UTRs (איור 4D). The 5 ' הקצוות של cox2-1 ו-2 העשירו ב 992-1030 ו 1276-1283 nt במעלה של אוג, בהתאמה, בעוד 3 ' הסוף שלהם היה 39 nt במורד הזרם של מפסק. להסיק מתוצאות ה-cRT-PCR, הגדלים המחושבים של cox2-1 ו-2 היו 1804-1832 ו-2088 – 2095 nt, בהתאמה.
כדי לאמת את התוצאות של מיפוי cRT-PCR, היברידיזציה מכתם ג'ל כתמי בוצעה על ידי שימוש במכשיר שנגזר cox2 gene קידוד אזור, ושתי להקות גדולות עם גודל דומה כמו cox2-1 ו-2 זוהו (איור 4c). בנוסף, התגלו שתי להקות גדולות יותר ב-2,500 ו-2,800 nt באבן החשופה הצפונית, אך לא הוגברה על-ידי cRT-PCR. שתי הלהקות הגדולות נקראו כ- cox2-3 ו -4, בהתאמה. כדי למפות אותם, עוד שני כלפי חוץ (כלומר CR2 ו-CF3), המעוגן ב -5 ' ו-3 ' UTRs של cox2-2, עוצבו ומיקומם היה קרוב לתעתיק הצפוי של cox2-3 ו-4. באמצעות זוג CF3 & CR2, שתי להקות גדולות היו מוגברת מאוד מ cDNAs נגזר 5 ' polyphsophatase התייחס RNA אבל לא מעמיתו לא מטופלים (איור 4A). תוצאות הרצף הראו כי יש להם זהה 5 ' termini בזמן משתנה 3 ' מסתיים. הגודל המחושב של שני התעתיקים היה 2512/2513 ו2833 – 2835 nt, בהתאמה, והם היו קרובים בגודלם עם שתי הלהקות הגדולות שזוהו באבן החשופה הצפונית. יתר על כן, התוצאות cRT-PCR הציע כי קוקס2-3 ו-4 יש הראשי 5 ' termini.
כדי לאשר את תוצאות האפליה, בהתאם לתוצאות המיפוי של ה-cRT-PCR, כלומר, qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 וqCR3, והצמדים הפריימר qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 וqCF2 & qCR3 שימשו ל הניתוח RT-qPCR של cox2-1,-2,-3, ו-4, בהתאמה. השפע היחסי של כל ארבעת RT-qPCR מוצרים ב 5 ' polyphsophatase המדגם היו גבוהים בהרבה כי אלה במקביל לא מטופלים, אשר מאשרת את תוצאות האפליה cRT-PCR.
לסיכום, דפוס התעתיק של תירס cox2 gene הוא מסובך, ואת האסטרטגיה מבוסס cRT-PCR למעשה מפלה וממפה את מספר איזופורמים של cox2 mrna.
איור 1: מבט כולל על האסטרטגיה המבוססת על cRT-PCR. איור של השלבים העיקריים של האסטרטגיה המבוססת על cRT-PCR. 5 ' + ו-5 '-= שתי דגימות RNA שטופלו ושאינן מטופלות על ידי ה-RNA 5 ' פוליפהוספטאז, בהתאמה. שני דגימות ה-Dna הנגזרות מ 5 ' פוליפהוספטאז, RNAs מטופלים שאינם מטופלים הם מנורמלים על ידי ה -26 בוגרים rRNA ב תירס, ואת התעתיקים העיקרי ומעובד הם מפלים על ידי השוואת מוצרי cRT-PCR. עבור הגן A, RNA המקביל יש 5 סוף העיקרי כי המוצר PCR שפע מתוך 5 ' פוליפהוספטאז התייחס RNA הוא גבוה הרבה יותר מאשר המקבילה הלא מטופלים; עבור גן B, מוצרי ה-PCR משני סטים של RNAs מיטוכונדריאלי מוגברת ברמה דומה, רומז 5 הטרמינוס מעובד של RNA המקביל. אזור הקידוד ו-UTRs מיוצגים באמצעות תיבה אפורה וקווים מודגשים, בהתאמה. CRT = פריימר לתמלול הפוכה; CF1, CF2, CR1, ו CR2 = PCR מאגפים את הצומת 5 ' -3 של התעתיק המעגלי; qCF ו Qcf = מפוצלים התחל עבור RT-Qcf. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכה של שלמות מיטוכונדריאלי של רנ א על ידי אגבה ג'ל אלקטרופורזה. RNAs מיטוכונדריאלי מוכן מ 15-DAP תירס גרעינים. M = מרקר מולקולרי DNA. (ב) מיטוכונדריאלי ליבה של רנ א לאחר הטיפול על ידי 5 ' פוליפהוספטאז ו/או מעגליות על ידי T4 RNA ligase. 5 ' + = רנ א מיטוכונדריאלי לאחר הטיפול על ידי 5 ' פוליפהוספטאז; T4 & 5 ' + = RNA מיטוכונדריאלי לאחר הטיפול על ידי 5 ' פוליפהוספטאז ומעגליות על ידי T4 RNA ligase; T4 & 5 '-= RNA מיטוכונדריאלי אחרי מעגליות בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יעילות מעגליות של nad5 ו- nad1 mrnas המשוער על-ידי RT-בדיקות. (א) ו-(ד) תרשים סכמטי של nad5 ו nad1 גנים, בהתאמה. לשעבר = מופעל. Exons ו-introns מוצגים כתיבות אפורות וקווים מעוקלים, בהתאמה. המיקום של שעתוק הפוכה RT1 ו RT2 מצוינים על ידי חיצים. נקודות שחורות מציינות את מיקום ה-PCR התחל, והגודל החזוי של מוצרי ה-PCR מוצג. sqF1, sqF2, sqR1, ו sqR2 הם התחל עבור RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1, ו qR2 הם התחל עבור RT-qPCR. (ב) ו-(ה) RT-sqpcr ניתוח של יעילות מעגליות של nad5 ו nad1 mrnas, בהתאמה. M = מרקר מולקולרי DNA. (ג) ו (ו) RT-qpcr ניתוח של יעילות מעגליות של nad5 ו nad1 mrnas, בהתאמה. שני דגימות cDNA הפוכה הפוך על ידי RT1 ו RT2 התחל הם מנורמל על ידי sqF2 & sqR2 (עבור RT-sqPCR) או qF2 & qR2 (עבור RT-qPCR) PCR מוצרים. היעילות הcircularization של nad5 ו- nad1 mrnas מוערך על ידי השוואת מוצרי ה-PCR של sqF1 & sqR1 (עבור rt-sqpcr) או qF1 & qR1 (עבור rt-qpcr). מעגליות/(מעגליות + ליניארי) = qF1 & qR1 מעל qF2 & qR2 ב RT2 תגובה/qF1 & qR1 על qF2 & qR2 בתגובה RT1. ערכים הם האמצעים ו-SDs של שלושה משכפל ביולוגי. כדי לא לכלול את ההשפעה הפוטנציאלית על ידי 5 ′ triphosphate, RNAs טופלו על ידי 5 ′ פוליפהוספטאז לפני הארכה עצמית. סה כ ו-Mito = סה כ RNAs ומיטוכונדריאלי, בהתאמה. RT1 ו RT2 = הפוך cDNAs הפוכה על ידי RT1 ו RT2 התחל, בהתאמה לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיפוי של cox2 בוגרים של הרכבת טרמיני באמצעות האסטרטגיה של ה-CRT-PCR. (א) הפרדת ג'ל של מוצרי cox2 cRT-PCR. + ו-= cDNAs נגזר 5 ′ של פוליפהוספטאז-מטפלים ומיטוכונדריאלי שאינם מטופלים, בהתאמה. שני דגימות cDNA היו מנורמל על ידי הגברה של 26S cDNA (26 s). חמשת התחל משמשים עבור ניתוח cRT-PCR של מעגליות cox2 mrna: CF1, CF2, ו CF3 הם התחל מקוננים, ו CF2 ו CF3 הם 69 ו 138 bp במורד הזרם של CF1, בהתאמה; CR1 ו CR2 הם התחל מקוננים, ו CR2 הוא 1,288 bp במעלה הזרם של CR1. הלהקות שצוינו על ידי ' 1 ' ו-' 2 ' היו מוגברה על-ידי CF1 & CR1 וCF2 & CR1, בעוד שהלהקות ' 3 ' ו-' 4 ' הוגברה על-ידי CF3 & CR2. כל ארבע הלהקות. הורצף ע י שיבוט לא היתה אפשרות לחזור על הלהקות שסומנו על-ידי כוכביות, והן לא נכללו בתוצאות. M = מרקר מולקולרי DNA. (ב) RT-qpcr ניתוח של השפע היחסי של מעגלי cox2 mrna אחרי 5 ' פוליפהוספטאז הטיפול. שני דגימות ה-Dna היו מסונתז על ידי תערובת פריימר המכיל 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-crt, nad9-CRT, קלח-CRT ו-cox1-CRT ביחס שווה, ו-cDNA נגזר מ -26 בוגרים rRNA שימש לנורמליזציה. +/-= cox2 מעל 26s במדגם/Cox2 מעל 26s במדגם שאינו מטופל. ערכים מייצגים אמצעים SD של שלושה משכפל ביולוגי. התחל בשימוש עבור RT-qPCR מצוינים. (ג) ניתוח מכתם צפוני של תעתיקים cox2 . 2 μg RNA מיטוכונדריאלי היה טעון. להקות המתאימות איזוצורות שונות של mRNA cox2 בוגרת מסומנים. (ד) תעתיק טרמיני של cox2 mrna להסיק מתוצאות ה-cRT-PCR. UTRs ומסגרות קריאה פתוחות מוצגות כקווים מודגשים ותיבות אפורות, בהתאמה. המיקומים של 5 ' ו-3 ' termini ביחס ל-AUG (+1) ו-UAA ( -1), ומספר שיבוטים בודדים הרצף במיקומים אלה מוצגים. המיקומים של תמלול הפוך ו-PCR הגברה מוצגים כראשי חץ סגורים ופתוחים, בהתאמה. כלפי חוץ הפנים התחל בשימוש RT-qPCR מוצגים כריבועים פתוחים, ואת המיקום של cox2 בדיקה הוא כפי שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מבחר של שיבוטים חיוביים המכילים cox2-4 מוסיף על ידי ה-PCR המושבה. (א) המושבה ה-PCR כדי להקרין שיבוטים בודדים המכילים cox2-4 מוסיף. בגודל של cox2-4 הכנס הוא על 1,165 bp, ואת זה של רצפים וקטורי הוא 100 bp. הגודל המחושב של מוצרי ה-PCR של המושבה הוא כ-1,265 bp, ואלה שיבוטים המכילים מוסיף גודל קטן לא היו ברצף, כלומר, מספרים 11, 14, 22, ו -23. (ב) רצף תוצאות של המשובטים החיוביים הוקרן ב (א). 5 '/3 ' מסתיים = 5 ' ו 3 ' מסתיים ביחס אוג (+1) ו UAA ( -1), בהתאמה. התוצאות ברצף של מספרים 12 ו -20 לא נכללו כי הם היו הרבה יותר קטן מהאחרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רכיב | אמצעי אחסון עבור תגובת 50 μL (μL) | ריכוז סופי |
| 10 x RNA 5 ' פוליפהוספטאז מאגר | מיכל 5 | 1x |
| מעכב RNase (40 U/μL) | 0.75 | 0.6 U/μL |
| רנ א מיטוכונדריאלי | x | 0.2 μg/μL |
| רנ א 5 ' פוליפהוספטאז (20 U/μL) | 2.5 | 1 U/μL |
| מטופלים מבוססי DEPC מאשר H2O | עד 50 μL | - |
טבלה 1: מרכיבי התגובה של RNA 5 ' פוליפהוספטאז הטיפול.
| רכיב | אמצעי אחסון עבור 20 היענות μL (μL) | ריכוז סופי |
| מאגר ה-RNA של 10x T4 | 2 | 1x |
| dATP (1 ממ) | 1 | 50 μM |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15 |
| מעכבי RNA (40 U/μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| 5 ' פוליפהוספטאז-שטופלו או מיטוכונדריאלי לא מטופלים | x | 0.1 ~ 0.2 μg/μL |
| T4 לליגאז I (30 U/μl) | 0.4 | 0.6 U/μL |
| שטופלו DEPC-H2O | עד 20 μL | - |
שולחן 2: מרכיבי התגובה של מעגליות RNA מיטוכונדריאלי.
| רכיב | אמצעי אחסון עבור 10 מקדם-שילוב μL (μL) |
| פריימר תערובת (1 μM בסך הכל)מ | 2 |
| שילוב dNTP (10 מ"מ לכל אחד) | 1 |
| כיתור 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול או אי-RNA מיטוכונדריאלי בלתי מטופלb | x |
| מטופלים מבוססי DEPC מאשר H2O | עד 10 μL |
שולחן 3: טרום תערובת עבור תגובת שעתוק הפוכה. מהווה התערובת הפריימר מכילה יחס שווה של 26S-CRT ועד 7 התחל הראשון של RT, והריכוז הסופי הוא 1 μM. bשני תערובות מראש מוכנות זה לצד זה, והם מכילים את אותו סכום (200 ng) של מעגליות 5 ' פוליפהוספטאז שטופלו או רנ א מיטוכונדריאלי שאינו מטופל.
| רכיב | אמצעי אחסון עבור 20 מערכת התגובה μL (μL) | ריכוז סופי |
| תבנית RNA/פריימר/dNTP * | 10 | - |
| מאגר 5x של הבורסה | 4 | 1x |
| מעכב RNase (40 U/μL) | 0.5 | 1 U/μL |
| הבורסה (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| שטופלו DEPC-H2O | עד 20 μL | - |
שולחן 4: מרכיבי התגובה של תמלול הפוכה. * התבנית RNA/פריימר/dNTP טרום תערובות מוכנות בשלב 6.3.
| רכיב | אמצעי אחסון עבור 20 מערכת התגובה μL (μL) | ריכוז סופי |
| H בדימוס2O | 7 | - |
| 2x מאגר התגובה | 10 | 1x |
| שילוב dNTP (10 מ"מ לכל אחד) | 0.4 | 0.2 מ"מ. |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0.8 | 0.4 ממ ' |
| 26S-CR1 (10 μM) | 0.8 | 0.4 ממ ' |
| תבניות cDNA שנגזרו מתוך מעגליות 5 ' פוליפהוספטאז-מטופלים או RNAs לא מטופלים * | 0.6 | - |
| דנ א פולימראז (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
טבלה 5: מרכיבי התגובה עבור הגברה של ה-PCR משנת 26S cDNA. * בתחילה, נפח שווה של cDNAs תבנית (0.6 μL) משמשים לנורמליזציה. במקרה הצורך, שנו את כמויות cDNAs של התבנית כדי להבטיח את אותו שפע של מוצרי ה-PCR של 26S בין שתי התגובות ה-PCR.
| צעד | טמפרטורה | זמן | מספר מחזור |
| דנטורציה ראשונית | 95 ° c | 3 דקות | 1 מחזור |
| דנטורציה | 95 ° c | 15 שניות | 22 – 25 מחזורים |
| פריימר ריפוי | 56 ° c | 15 שניות | |
| סיומת | 72 ° c | 30 שניות | |
| הארכה סופית | 72 ° c | 5 דקות | 1 מחזור |
| החזיק | 4 מעלות צלזיוס | ∞ | - |
שולחן 6: תנאים PCR להגביר 26S Cdna לנורמליזציה.
| רכיב | נפח עבור מערכת התגובה 20-μL (μL) | ריכוז סופי |
| מינו H2O | עד 20 μL | - |
| 2x מאגר התגובה | 10 | 1x |
| שילוב dNTP (10 מ"מ לכל אחד) | 0.4 | 0.2 מ"מ. |
| מפוצלים פריימר-קדימה (10 μM) | 0.8 | 0.4 ממ ' |
| תחל מפוצלים-הפוך (10 μM) | 0.8 | 0.4 ממ ' |
| תבנית cDNA הנגזרת ממעגל העיוותים של 5 ' פוליפהוספטאז ' או ' מטופלים ' | x | - |
| דנ א פולימראז (1 U/μL) | 0.4 | 0.02 U/μL |
שולחן 7: מרכיבי התגובה הגברה של התעתיקים של המטרה המעגליות. * כמות התבנית של cDNAs בשימוש בתגובות אלה נקבעים על ידי תוצאות הנורמליזציה של 26S rrna.
| צעד | טמפרטורה | זמן | מספר מחזור |
| דנטורציה ראשונית | 95 ° c | 3 דקות | 1 מחזור |
| דנטורציה | 95 ° c | 15 שניות | 22-40 מחזורים c |
| פריימר ריפוי מ | 50-65 ° c | 15 שניות | |
| הארכת שינה | 72 ° c | 0.5-1 דקות | |
| הארכת פינאטל | 72 ° c | 5 דקות | 1 מחזור |
| החזיק | 4 מעלות צלזיוס | ∞ | - |
שולחן 8: תנאי PCR כדי להגביר את התעתיקים של המטרה. מהווה ממוזג מתון תלוי בטמפרטורת. ההיתוך של ה-PCR ב זמן התארכות תלוי באורך היעד כדי להיות מוגבר. הזמן המומלץ הוא 1 דקות לכל 1 kb של מקטע ה-PCR. ג באופן כללי, 30 ~ 35 מחזורים מספיקים כדי לייצר כמות נאותה של מוצר PCR. עבור התעתיקים שופע נמוך, להגדיל את מספר מחזורי עד 40 מחזורים.
איור S1: מיקום התחל לצורך ייצוג מיטוכונדריאלי של תירס. CRT = שעתוק הפוך; CF1, CF2, CR1 ו-CR2 = מפוצלים לצורך הגברה של ה-PCR; qCF ו Qcf = מפוצלים התחל עבור RT-Qcf. התעתיק טרמיני של תירס nad2-1, rps4-1, ו nad4-1 נקבע בעבר (ג'אנג ואח ', 20191). המיקומים של 5 '-ו-3 '-מסתיים ביחס ל-AUG (+1) והנוקלאוטיד האחרון של העצירה קודון ( -1) מוצגים. אזורי הקידוד ו-UTRs מצוינים כתיבות אפורות וקווים מודגשים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור S2: עיקרון לאמוד יעילות מעגליות של nad5 mrna בשנת תירס. בתגובה עצמית, רק חלקיק מיטוכונדריאלי הוא מעגלי. כדי לחשב את היחס של מעגליות nad5 mrna, שתי התחל הספציפי גנטית משמשות כדי לסנתז את cdnas הראשון, כלומר, nad5-RT1 ו-RT2. ב nad5-RT2 הפוכה התגובה (RT), מוצרי ה-PCR מוגבר על ידי SqF2 & sqR2 (עבור Rt-sqpcr) ו QF2 & qR2 (עבור Rt-qpcr) נגזרות הן ליניארי והן מעגליות nad5, בעוד sqF1 & sqR1 (עבור rt-Sqpcr) ו qF1 & qR1 (עבור RT-qPCR) מוצרי PCR נגזרים ממעגל nad5 בלבד; בתגובה nad5-RT1, כל ארבעת זוגות היסוד של ה-PCR יכולים להגביר את שתי הצורות של nad5. כדי לחשב את היחס של מעגלי nad5 mrna, שתי התגובות מנורמלות על-ידי SqF2 & SqR2 או QF2 & qR2 מוצרי PCR. על-ידי השוואת השפע של sqF1 & sqR1 או qF1 & qR1 PCR מוצרים בין שתי תגובות RT, היעילות המעגליות של nad5 mrna מוערך בערך. לשעבר = exon. Exons ו-introns מוצגים כתיבות אפורות וקווים מעוקלים, בהתאמה. המיקומים של nad5-RT1 ו-RT2 התחל מצביעים על ידי חיצים. נקודות שחורות מציינות את מיקומם של ה-PCR, והגודל החזוי של מוצרי ה-PCR מוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלת S1: פריימר מידע. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר קודם, RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי מתרבות ההשעיה של התאים של Arabidopsis שימשו כדי למפות תעתיק מיטוכונדריאלי termini על ידי CRT-PCR, ותוצאות דומות הושגו12. עם זאת, רק RNA מיטוכונדריאלי מועשר שימש למיפוי תעתיק מיטוכונדריאלי טרמיני במחקרים רבים אחרים1,2,3,9. מצאנו כי העשרה של RNA מיטוכונדריאלי הוא צעד חשוב עבור מיפוי cRT-PCR של תעתיק מיטוכונדריאלי בשנת תירס. לאחר העשרה זו, היחס של רנ א מיטוכונדריאלי מעגלי הוא הוגדלה באופן דרמטי מ-0.3% – 3.7% כדי ~ 30% (איור 3 ו- S2 איור), מה שהופך את הגברה של התעתיקים היעד מעגליות אפשרי בסיבוב אחד של ה-PCR.
היעילות המעגליות של רנ א מיטוכונדריאלי הוערך על ידי הניתוח RT-PCR על תירס nad1 ו nad5, שניהם מחולקים מראש בלתי תלוי על ידי שחבור introns העמים. בגלל ההשפעה הפוטנציאלית מן הנוכחות של RNAs מקודמת, כמו גם את הווריאציה של יעילות RT לא ניתן לשלול, זוהי רק הערכה גסה של יעילות מיטוכונדריאני אמיתי RNA מעגליות.
שינו את התנאים העצמאיים על ידי שינוי הריכוז של RNA מיטוכונדריאלי ו PEG8000, כמו גם על ידי להאריך זמן הדגירה, אבל השינויים האלה לא נראה להשפיע על יעילות הcircularization מיטוכונדריאני. למרות שאיננו בטוחים אם טיהור נוסף של חלחול הדרגתי יכול להגביר את היעילות המעגליות, האיכות של המיטו, שהוכנו בסעיף 2 מספיקה למיפוי ה-cRT-PCR של התעתיק המיטוכונדריאלי בשנת תירס. מאז סיבובים מרובים של בדיקות עלול לגרום תוצאות חיוביות שווא, הגברה של תעתיקים היעד ב-PCR סיבוב אחד הופך את תוצאות המיפוי אמין יותר.
5 ' טריפוספט של התעתיקים העיקריים הוא לא יציב, וזה יכול להיות מומר ל 5 ' monophosphate מסיבות לא ידועות. בעיה זו מעכבת בידול ברור בין התעתיקים העיקריים והמעובדים באמצעות גישות בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ' טריפוספט1,2,4. הטופס הבוגר של תירס 26S rRNA יש monophosphated 5 ' סוף, וזה חסר רגישות ל-RNA 5 ' פוליפהוספטאז. כדי למזער את ההשפעה של הבלתי יציב 5 ' triphospahte, מבוגרים 26S rRNA משמש לנרמל את שני דגימות RNA, מטופלים ולא מטופלים על ידי 5 ' פוליפהוספטאז, והוא מוצג צעד חשוב כדי להבדיל בין שני סוגים של תעתיקים בתירס מיטוכונדריון. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים יכולים להיות מופלים על ידי השוואת cRT-PCR ו-RT-qPCR תוצאות שהתקבלו מ-5 ' פוליפהוספטאז שטופלו בדגימות RNA שאינן מטופלות. התעתיקים העיקריים רגישים ל 5 ' פוליפהוספטאז, והם מוקצב מאוד מן 5 ' פוליפהוספטאז מטופל לדוגמה אבל לא (או ברמה נמוכה מאוד בשל חוסר יציב 5 ' triphosphate) מעמיתו לא מטופלים. לעומת זאת, התעתיקים המעובדים מזוהים ברמות דומות בין שתי הדגימות.
בצמחים, תבניות התעתיק של גנים מיטוכונדריאלי רבים מסובכות למדי1,2. לדוגמה, nad6 תירס ו atp6 גנים מבוטא הן monocistrons ו dicistrons, ו nad6, atp6, ו atp6-na6 בוגרים mrnas יש שניים, שלושה, ושני isoforms, בהתאמה. יתר על כן, אוכלוסיית התעתיק של גן מיטוכונדריאלי אחד היא למעשה תערובת של RNAs מקודמת, בוגר והשפלה. בדיקות נוטים להגביר מולקולות בגודל קטן, וקשה לזהות את כל התמליל באמצעות זוג אחד של התחל. לכן, היברידיזציה מאבן ה-RNA נדרשת כדי לאמת את תוצאות המיפוי של cRT-PCR, וייתכן שיהיה צורך בצבעי יסוד חלופיים כדי להגביר את התעתיקים שאותרו באבן החשופה הצפונית, אך לא בפעם הראשונה ב-cRT-PCR.
פרוטוקול זה כולל שלב RT-qPCR כדי לאמת את תוצאות האפליה מסוג cRT-PCR. מכיוון שמספר האיזוטפסים של מספר מסוים של mRNAs קרוב מאוד לגודל1, אי אפשר לאשר את כל תוצאות האפליה של RT-qpcr, וחלק מהתעתיקים של המצב הקבוע נקבעו על ידי השוואת התוצאות CRT-pcr בין הטיפול ו-RNAs שאינם מטופלים בלבד.
בפרוטוקול זה, the 5 ' ו-3 ' termini של התעתיקים היעד מופו על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, והוא מגביל את מספר שיבוטים בודד להיות רצף. כשיטה חלופית, ניתן לקבוע את מוצרי ה-cRT-PCR ברצף הדור הבא, הרצפים אלפי מולקולות עבור ערכה אחת של תעתיקים של מצב יציב, ותוצאות המיפוי יהיו מדויקות יותר.
מלבד האפליה של הראשי מעובד 5 ' termini על ידי cRT-PCR ו RT-qpcr, monophosphate 5 ' termini יכול להיקבע על ידי זיהוי של המבנים המקיפים RNA משני1,12. זה ידוע היטב כי מבנים משניים RNA כגון trna ו-t-אלמנט יכול לתווך תעתיק מיטוכונדריאלי היווצרות על ידי בימוי end, נוגד חרדה של rnase P ו/או rnase Z12,18,19, . עשריםדולר לכן, אלה 5 ' termini סמוך tRNA או t-אלמנט צריך להיות נגזר מעיבוד לאחר הטרנססקריפט ולהכיל monophosphates.
על-ידי שימוש בפרוטוקול זה, חלק גדול של תעתיקים של מצב יציב נקבע בבית תירס המיטו,1. עם זאת, מעטים לא הובלו ו/או ממופים מסיבה לא ידועה1. יתר על כן, אנחנו חושבים את המיקום של 5 ' תעתיק טרמיני עדיף להיות מאושר על ידי ניתוח מאריך הארכה, למרות שהוא נכלל בפרוטוקול זה. בשל חוסר נתונים ניסיוניים, איננו בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה למינים צמחיים אחרים, כגון אורז (Oryza סאטיבה) ו Arabidopsis. מלבד צמח המיטוגיה, התעתיקים העיקריים ומעובד הם שהצטברו באופן מצער ב-פלסטלינה21, וזה לא ברור אם אסטרטגיה זו ניתן להשתמש כדי למפות ולהפלות תעתיקים פלסטלינה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (להעניק no. 31600250, Y.Z.), פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג'ואו (להעניק no. 201804020015, ח), ואת מערכת המחקר החקלאי סין (להעניק לא. מכוניות-04-PS09, ח).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R.
