Summary
Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot 'u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.
Abstract
Bitki mitokondri içinde, bazı sabit-devlet transkriptler 5 ' trifosfat transkripsiyon başlatma (primer transkript) türetilmiştir, diğerleri içeren ise 5 ' monofosfat Post-transcrip, oluşturulan (işlenmiş transkriptler). İki tür transkripti arasında ayrımcılık yapmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir ve çoğu 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlıdır. Ancak, primer 5 ' Termini 'de trifosfat kararsız, ve iki tür transkriptlerin net bir ayrımcılığı engelliyor. Mısır mitochondrion 'da stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek ve eşlemek için, CRT-PCR, RNA 5 ' polyphoshpatase tedavisi, nicel RT-PCR (RT-qPCR) ve Kuzey Blot. Bir gelişme olarak, bu strateji dengesiz 5 ' trifosfat etkisini en aza indirmek için bir RNA normalleştirme adımı içerir.
Bu protokolde, zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA RNA 5 ' poliphosphataz tarafından önceden tedavi edilir, bu da 5 ' triphsophate 'yi monofosfata dönüştürür. Devre sonrası ve ters transkripsiyondan sonra, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen Rnas 'dan türetilen iki cdnas, işlenmiş 5 ' uçtan ve 5 ' polyphosphataz 'a duyarsız olan, Mısır 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilmiştir. Normalleştirme işleminden sonra, tedavi edilen ve işlenmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenen transkriptler ayrımcılık yapmaktadır. Transkripti Termini, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile belirlenir ve daha sonra Kuzey Blot tarafından doğrulanır.
Bu stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondrion 'daki en kararlı durum transkriptleri belirlenmiştir. Bazı mitokondriyal genlerin karmaşık transkripti deseni nedeniyle, birkaç sabit devlet transkriptleri farklılaşmadı ve/veya eşleştirilmedi, ancak Kuzey Blot 'da tespit edildi. Biz bu stratejinin ayrımcılık ve diğer bitki mitokondri veya plastids sabit devlet transkriptler harita uygun olup olmadığından emin değiliz.
Introduction
Bitki mitokondri, birçok olgun ve habercisi Rnas birden fazla isoformlar olarak birikir ve sabit devlet transkriptler onların 5 ' uçları1,2,3farkı dayalı iki gruba bölünebilir, 4' ü yapın. Primer transkriptlerin 5 ' trifosfat sonu vardır, bu da transkripsiyon başlamasında elde edilir. Buna karşılık, işlenmiş transkriptler Post-transcriptional işleme tarafından oluşturulan 5 ' monofosfat var. İki tür transkripti ayrımcılık ve haritalama, arka plandaki moleküler mekanizmaların ortaya çıkarmak için önemlidir.
Plant mitochondrion 'daki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrım yapmak için dört büyük strateji geliştirilmiştir. İlk strateji mitokondriyal RNAs 'ı tütün asidi pirofosfataz (TAP) ile ön tedavi etmektir, bu da 5 ' trifosfat 'i monofosoza dönüştüren ve primer transkriptlerin RNA ligaz ile devre altında olmasını sağlar. Musluk tedavisi ve tedavi edilmeyen RNA örneklerinin transkript fazlalıkları daha sonra cDNA bitleri (yarış) veya dairesel RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4hızlı amplifikasyon ile karşılaştırılır. İkinci stratejide, işlenen transkriptler öncelikle Terminator 5 '-fosfat bağımlı eksonükleaz (Tex) kullanarak mitokondriyal Rnas 'dan tükeniyor ve sol primer transkriptler daha sonra primer uzatma Analizi5,6 ile eşleştirilir . Üçüncü strateji Guanil transferase kullanarak birincil transkriptler ön Cap için, ve daha sonra trifosfatla 5 ' Termini konumu ile birlikte ribonükleaz veya S1 nükleaz koruma analizi ile primer uzatma tarafından belirlenir7,8 ,9. 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı olandan farklı, dördüncü strateji içinde vitro transkripsiyon birleştirir, site-yönlendirilmiş mutagenesis, ve primer uzatma Analizi sözde Rehberleri karakterize ve transkripsiyon belirlemek başlatma siteleri8,10,11. Bu stratejileri kullanarak, bitki mitokondri içinde birçok primer ve işlenmiş transkriptler belirlendi.
Ancak, birkaç çalışmada birincil transkriptlerin 5 ' trifosfat kararsız olduğunu bildirdi ve kolayca bilinmeyen nedeni2,4,12,13için monofosfat dönüştürülmüştür. Bu sorun, 5 ' trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı teknikleri kullanarak transkriptler iki tür net bir ayrımcılık engeller ve önceki çabaları sistematik olarak bitki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrımcılık için Mitochondri2,12başarısız oldu.
Bu protokolde, cRT-PCR, RNA 5 ' polyphosphatase tedavisi, RT-qPCR ve Kuzey leke 'ı, Mısır (Zea mays) mitokondrion (Şekil 1) ' de stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek için birleştiriyoruz. cRT-PCR RNA molekülü 5 ' ve 3 ' ekstremite eşzamanlı haritalama sağlar ve genellikle bitkiler2,12,14,15harita transkript Termini adapte edilir. RNA 5 ' polyphosphataz, trifosfatlar 5 ' Termini 'den iki fosfatı kaldırabilir ve bu da birincil transkriptlerin RNA ligaz tarafından Self-ligasyon için kullanılabilir olmasını sağlar. Önceki çalışmalar, Mısır 'da olgun 26S rRNA 5 ' Terminus işlenmiş olduğunu gösterdi ve RNA 5 ' polyphosphatase1,16duyarsız oldu. Primer 5 ' Termini 'de kararsız trifosfat etkisini en aza indirmek için, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs olgun 26S rRNA tarafından normalleştirilmiş, ve birincil ve işlenmiş transkriptler daha sonra karşılaştırarak farklılaşmış iki RNA örneğinden elde edilen cRT-PCR ürünleri. CRT-PCR haritalama ve ayrımcılık sonuçları Kuzey leke ve RT-qPCR tarafından sırasıyla doğrulanır. Son olarak, alternatif astar Kuzey leke ancak cRT-PCR tarafından algılanan Bu transkriptler yükseltmek için kullanılır. Bu cRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondri en kararlı durum transkriptler ayırt edilmiş ve1eşleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer tasarım
- Astar tasarım17genel kurallarına dayalı PCR primer tasarım yazılımı (malzeme tablosu) kullanarak ters TRANSKRIPSIYON (RT) için gen-özel astar tasarımı.
Not: RT astarlar hedef transkriptler için son derece özeldir, ve genellikle 5 ' (olgun mrnas ve habercisi Rnas), ya da ~ 500 – 600 NT beklenen 5 ' End (18s ve 26S rrnas) kodlama dizileri bir parçası üzerinde demirlemiş. - CRT-PCR tarafından döngüsel transkriptleri yükseltmek için farklı astar çiftleri tasarım.
Not: eşleştirilmiş farklı astarlar, döngüsel transkriptlerin 5 '-3 ' kavşağının üzerine gelmiştir ve pozisyonları analiz edilen hedef transkriptler arasında farklılık gösterir (Şekil S1). Bazı transkriptler uzun UTRs vardır; Örneğin, nad2-1 5 ' UTR ve rps4-1 3 ' UTR, sırasıyla1, 1.985 ve 1826/1834 NT 'dir. Her iki astarlar kodlama bölgesinde bağlantılı ise, hedef transkriptleri yükseltmek zor olacaktır. Buna karşılık, bazı UTRs kısa; Örneğin, 3 ' UTRs nad2-1 ve nad4-1 34/35 ve 29 – 31 NT, sırasıyla1' dir. Eşleştirilmiş astar kodlama dizilerinden uzakta bulunuyorsa, PCR başarısız olur. Genellikle, iki çift farklı astar her hedef transkripti için tasarlanmıştır, birden fazla çifti olan transkript desenleri karmaşık ve/veya utrs çok uzun olduğunu eşlemek için gerekli olabilir. - Kuzey Blot için RNA probları hazırlamak için yakınsak astar çiftleri tasarım.
Not: Eşleştirilmiş astarlar hedef genin kodlama bölgesinde yer alır ve PCR ürününün büyüklüğü 100 ila 1.000 BP aralığında olmalıdır. Her ileri astar elde edilen problar vektör dizileri en aza indirmek için bir kısıtlama enzim sitesi içermelidir.
2. Mısır 'dan ham Mitokondrion hazırlanması çekirdekleri geliştirme
- Dezenfekte, havan topları, cam hunileri, tüpler ve otoklav ile ipuçları sterilize ve fırında kurutun.
- 4 °C ' de veya buzda tüm prosedürleri gerçekleştirin ve tüm çözümleri önceden soğutun.
- Hazırlamak 100 mL ekstraksiyon tampon (EB), 0,3 M sucrose, 5 mM Tetrasodyum pirofosfat, 10 mM KH2Po4, 2 mm EDTA,% 1 [w/v] polyvinylpyrrolidone 40,% 1 [w/v] Sığır serum albumin, 5 mm L-sistein ve 20 mm askorbik asit oluşur. KOH ile pH 7,3 ayarlayın ve filtrasyon ile sterilize.
- Hazırlamak 100 mL yıkama tampon (WB) oluşan 0,3 M sakaroz, 1 mM EGTA, ve 10 mM MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonik asit). NaOH ile pH 7,2 ayarlayın ve filtrasyon ile sterilize.
Not: Bu EB ve WB hazırlamak için tavsiye edilir DEPC-tedavi deiyonize H2O kullanarak. - 20 g gelişmekte olan çekirdekleri 11 – 20 gün sonra pollinasyon (DAP) bir 50-mL tüp buzun üzerine yerleştirilir ve daha sonra önceden soğutmalı havan topları için çekirdekler transfer toplayın.
Not: Bir oranı kullanın 100 mL EB için 20 g mısır çekirdekleri. - Her harç için 10 – 20 mL buz soğuk EB ekleyin ve çekirdekleri tamamen öğütün.
- Daha fazla EB ekleyin ve iki katman filtre bezi (malzeme tablosu) ile zemin dokularına filtre uygulayın.
- Süzgeci 8.000 x g 'de 10 dakika Santrifüjden çıkarın ve Pelet atın.
- Yeni bir tüp için süpernatant transfer ve 10 dakika için 20.000 x g santrifüj.
- Supernatant dökmek ve 6 ml içinde Pelet pelletini WB.
- Beş 1,5 mL RNase-Free borular için süspansiyon aliquot ve 5 dakika için 14.000 x g onları santrifüjler.
- Supernatant atın, sıvı azot mitokondriyal peleti dondurmak, ve mağaza-80 °C.
3. mitokondriyal RNA ekstraksiyonu
- İmalatın talimatlarına göre bir ticari reaktif (malzeme tablosu) ile mitokondriyal RNA ayıklayın.
Dikkat: Bu reaktif fenol ve guanidin isothiocyanate içerir. Bir duman kaputu ile çalışmak ve laboratuar ceket ve eldiven giymek. - Yalıtılmış mitokondriyal RNA 'nın DEPC-tedavi edilmiş deiyonize H2O 'da çözülür ve RNA konsantrasyonu ve saflığını spektrofotometre (malzeme tablosu) ile tahmin edin.
Not: Genellikle, ~ 250 μg mitokondrial RNA 20 g 15-DAP mısır çekirdekleri elde edilir. - 1 adet Tae tampondan oluşan bir agaroz jel hazırlayın (40 mm Tris, 20 mm asetik asit, 1mm EDTA), 1,5% agaroz (malzeme tablosu) ve 1x nükleer boyama boyası (malzeme tablosu).
- Uygun bir hacim eklemek 10X yükleme tampon (0,5% bromophenol mavi, 0,5% ksilen cyanol FF, ve 50% gliserol), ve yük mitokondrial RNA/yükleme tampon karışımı% 1,5 agaroz jel.
- Jeli 20 – 25 dakika boyunca 5 – 6 V/cm olarak 1x TAE tampon olarak çalıştırın ve jel dokümantasyon sistemi (malzeme tablosu) ile jelin görüntülenmesi ile mitokondriyal RNA bütünlüğünü değerlendir.
Not: İki ayrı bandın varlığı (~ 3.510 ve ~ 1.970 NT Mısır mitokondrial 26S ve 18s rrnas için, sırasıyla) bozulmamış mitokondriyal RNA için kabul edilebilir bir standarttır. Olası bozulması dışlamak için, RNA bütünlüğü (Şekil 2) ' nin birden çok basamakları sırasında incelenmelidir.
4. RNA 5 ' Polyphosphatase tedavisi
- RNA 5 ' poliphosphataz (masa ve malzeme) tedavisi (Tablo 1) ayarlayın ve 37 °c ' de 30 – 60 dakika boyunca inküye yapın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA arıtma kiti (malzeme tablosu) ile 5 ' poliphosphataz tedavi RNA kurtar.
- 3,3 ile 3,5 arasındaki adımları yineleyin.
5. RNA Döngülerleştirme
- Aynı miktarlarda 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen mitokondriyal RNAs (Tablo 2) kullanarak iki adet döngüye reaksiyon hazırlayın ve 16 °c ' de her iki reaksiyonu 12 – 16 h için kuluçk.
- 4,2 adımda olduğu gibi aynı kiti kullanarak Self-birleştirilmiş RNAs iki kümesini kurtarın.
Not: Mitokondriyal RNA 'nın sadece bir kısmını kendinden bağlanacak ve kurtarılan RNA 'nın doğrusal ve dairesel transkriptlerin karışımı olacağını unutulmamalıdır. - 3,3 ile 3,5 arasındaki adımları yineleyin.
6. Ters transkripsiyon
- İki adet cDNAs kümesini, aynı miktardaki 5 ' poliphosphataz tedavi edilmiş ve tedavi edilmeyen RNAs (200 ng) ile sentezler.
- 26S-CRT ve 7 diğer RT astar eşit oranı ekleyerek bir astar karışımı hazırlayın.
Not: Primer karışımı son konsantrasyon 1 μM olmalıdır. - Tablo 3' te listelenen reaktifleri birleştirerek iki ön karışımı hazırlayın, 65 °c ' de 5 dakika boyunca Inküye yapın ve ardından 2 dakika boyunca buzda rahatlayın.
- İki RT reaksiyon sistemini (Tablo 4) birleştirin ve 42 °c ' de 50 dk. boyunca onları inkübe edin.
- 5 dakika için 70 °C ' de RT reaksiyonları ısı, ve sonra buzda onları Chill.
7. normalleştirme
- 5 ' poliphosphataz tedavi edilen veya tedavi edilmeyen RNAs 'dan türetilen şablon cDNAs 'ın aynı hacmini ekleyerek iki PCR reaksiyonu hazırlayın (örneğin, 26S-CF1 ve-CR1), vb. (Tablo 5), 5 '-3 ' ' ten oluşan 2,5 ' '-üç ' Kavşağı çevreliyor.
- Tablo 6' da açıklanan koşullar altında bir termal bisikletçi (malzeme tablosu) iki reaksiyon çalıştırın.
- 1 adet Tae tampondan oluşan bir agaroz jel,% 1,0 agaroz ve 1x nükleer boyama boyası hazırlayın.
- İki PCR ürünlerinin her biri için 2 μL 10X yükleme tamponu (% 0,5 bromophenol mavisi,% 0,5 ksilen cyanol FF ve% 50 gliserol) ekleyin ve jel üzerine yükleyin.
- 5 – 6 V/cm, 30 – 40 dakika için 1x TAE tampon olarak jel çalıştırın ve adım 3,5 olarak aynı jel dokümantasyon sistemi kullanarak görüntü.
- Bilgisayar yazılımı (malzeme tablosu, Şekil 4A) kullanarak iki PCR ürünlerinin bolluk karşılaştırın ve gerekirse şablon cdnas tutarları değiştirerek normalleştirme optimize.
8. PCR amplifikasyon
- Normalleştirilmiş cDNAs 'ın uygun hacmini ve hedef transkriptların 5 '-3 ' kavşağının (Tablo 7) çevrelerine göre bir çift farklı astar ekleyerek PCR reaksiyonları çiftleri hazırlayın.
Not: Hedef transkriptlerin PCR amplifikasyonu için kullanılan şablon cDNAs miktarı, 26S rRNA normalleştirme sonuçları tarafından belirlenir. - Tablo 8' de açıklanan programa göre PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
- 7,3 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
- İç içe geçmiş farklı astarlara değiştirin ve 8,1 ve 8,2 adımları yineleyerek ilk yuvarlak PCR sonuçlarını doğrulayın.
- 7,3 ile 7,5 arasındaki adımları yineleyin.
- Bir jel DNA kurtarma kiti (malzeme tablosu) kullanılarak ıkı Tur PCR amplifikasyonunda tekrarlanabilebilen belirgin bantları kurtarın.
9. transkript Termini 'nin belirlenmesi
- Jel-saflaştırılmış PCR ürünlerini standart teknikleri kullanarak bir künt-End vektörüne (malzeme tablosu) klonlayın.
- Hedef ekler içeren pozitif klonlar seçmek için koloni PCR gerçekleştirin ve bunları ticari olarak sıralı.
Not: Değişken büyüklükte ekler içeren pozitif klonlar genellikle tek bir kurtarılmış bant tespit edilir, çünkü bitki mitokondrial birçok istikrarlı durum transkriptler heterojen vardır 5 ' ve/veya 3 ' Ends1,12. - Biyoteknoloji bilgileri (NCBı) için ulusal merkezin temel yerel hizalama arama aracını (BLAST) kullanarak sıralama verilerini Mısır mitokondriyal genomla hizalayın. Organizma "Mısır (TaxID: 4577)" ve arama veritabanı "Nüklotid koleksiyonu (NR/NT)" seçin.
- , 5 '-3 ' kavşağının döngüsel transkript bulmak ve 5 ' ve 3 ' transkript Termini konumlarını belirlemek.
- Hedef transkriptleri boyutunu hesaplayın.
10. RNA jel Blot hybridization tarafından cRT-PCR haritalama sonuçlarının doğrulanması
Not: RNA jel leke hibridizasyon, digoxigenin (DIG) ve T7 RNA polimeraz, hybridizasyon ve immünolojik algılama ile RNA 'nın transkripsiyon-etiketleme için reaktifleri içeren ticari bir Kit (malzeme tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir. Daha fazla ayrıntı için lütfen bu kit 'te sağlanan protokollere bakın. Tüm prosedür için sadece RNase ücretsiz ekipmanların kullanıldığını emin olun.
- RNA prob hazırlamak için kullanılan DNA parçasını yükseltmek ve adım 9,1 gibi aynı vektör klonlama, bir T7 Organizatör içerir 17 BP ekleme sitenin upstream.
- Doğru kısıtlama enzim kullanarak yapı Linearize, bir DNA arıtma kiti (malzeme tablosu) ile doğrılaşmış Plasmid kurtarmak ve depc-tedavi deiyonize H2o çözülür.
- Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir Kit (malzeme tablosu) ile DIG-11-UTP ' ı Ile etiket RNA probları.
- Hazırlamak 500 mL 10X MOPS tampon (0,2 M MOPS, 50 mM sodyum asetat, ve 10 mM EDTA) kullanarak DEPC-deiyonize H27,0 O
- 3.1 – 3.3 adımda hazırlanan mitokondriyal RNA 'ya 2 – 3 hacim yükleme tamponu (50% Formamid,% 6,2 formaldehit, 1x MOPS,% 10 gliserol ve% 0,1 bromophenol Mavisi) ekleyin.
- RNA örnek/yükleme tampon karışımını 65 °C ' de 10 dakika boyunca deninin ve sonra buz üzerinde 1 dakika dinlenin.
- Denatüre agaroz jel hazırlayın (% 2 formaldehit, 1,2% agaroz ve 1x Mops) ve RNA numune/yükleme tampon karışımından jel (1 – 2 μg mitokondriyal RNA başına) yükleyin.
- Jel 1x MOPS içinde 3 – 4 V/cm ~ 4 h için çalıştırın.
- Hazırlamak 2 L 20X SSC (3 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat, pH 7,0). Bir gecede% 0,1 DEPC ile Treat ve otoklav ile sterilize.
- Jeli 20X SSC 'de iki kez durulayın (her seferinde 15 dk) ve jel RNA 'sını, 10 – 16 h için 20 x SSC ile kapiller transferiyle bir naylon membranda (malzeme tablosu) aktarın.
- 120 °C ' de 30 dakika pişirerek RNA 'ya membran düzelt.
- Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir Kit (malzeme tablosu) ile RNA hybridizasyon ve immünolojik algılama gerçekleştirin.
11. Primer ve Işlenmiş 5 ' sonların ayrımcılık
- Normalleştirilmiş 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs 'dan elde edilen cRT-PCR ürünlerini karşılaştırarak primer ve işlenmiş 5 ' uçları ayrımcılık yapın.
Not: Primer transkriptler için, 5 ' poliphosphataz tedavi RNA 'dan gelen PCR ürünlerinin bolluğu, tedavi edilmemiş mevkidaşından çok daha yüksektir (Şekil 1, ' Gen A, ' ve Şekil 4A). Ancak, işlenmiş transkriptler için, benzer bir düzeyde PCR ürünleri mitokondriyal RNAs iki kümelerinden amplifikasyonu olacaktır (Şekil 1, ' gene B '). - CRT-PCR eşleme sonuçlarına dayalı RT-qPCR astar tasarımları.
- CRT-PCR ayrımcılık sonuçlarını RT-qPCR tarafından doğrulayın.
Not: 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs 'dan türetilen iki cDNA örneği, 26S olgun rRNA 'nın RT-qPCR ürünleri tarafından normalleştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitokondriyal RNA döngülerleştirme verimliliğinin tahmini
Önceki bir çalışmada, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) mitokondriyal transkript termını cRT-PCR haritalama için toplam ve mitokondriyal RNAs kullanılmıştır ve Rnas iki tür benzer haritalama sonuçları12verdi. Başlangıçta, aynı zamanda Mısır 'da mitokondriyal transkript Termini cRT-PCR haritalama için toplam RNAs kullandık. Birçok denemelerin ardından, hedef transkriptinin tespit edilmesi zor olduğunu bulduk. Bir gelişme olarak, mitokondriyal RNA 'nın gelişmekte olan çekirdekleri Mısır 'dan zenginleştirdik ve bir PCR turunda olan, döngüsel hedef transkriptlerin amplifikasyonu mümkün hale gelmiştir.
Zenginleştirme işleminden sonra hedef transkriptlerin kolay amplifikasyonunu açıklamak için, temsilci mitokondriyal gen nad5 (Şekil 3 ve Şekil S2) üzerinde RT-PCRs gerçekleştirerek RNA döngüsüdür verimliliğini tahmin ettik. Mısır nad5 geni iki Trans-ve iki BDT-splicing introns içerir. Total ve mitokondriyal RNAs 'ın Self-ligasyon sonra, ilk Strand cDNAs bağımsız olarak nad5-Rt1 ve-RT2 astar kullanılarak sentezlenmiş. İki astar, hem doğrusal hem de dairesel nad5 mrnas 'ı (Şekil S2) ters çevirebilir. PCR amplifikasyonu için dört çift yakınsak astar kullanılır: sqF1 & sqR1 ve sqF2 & sqR2 yarı nicel RT-PCR (RT-sqPCR) ve qF1 & qR1 ve qF2 & qR2 RT-qPCR için. Nad5-Rt1 tarafından yazılan cdnas 'lar için dört çift astar her iki döngüsel ve doğrusal Nad5 olgun mrnas tespit edilmiştir; nad5-RT2 Ters transkripsiyon reaksiyonu Için, SqF2 & SqR2 ve QF2 &Amp; QR2 mRNA 'nın her iki formunu da incelenirken, SqF1 & SqR1 ve QF1 & qR1 PCR ürünleri sadece döngüsel nad5 türetilmiştir. Bu analizine dayanarak, sqF2 & sqR2 (RT-sqPCR için) ve qF2 & qR2 (RT-qPCR için) PCR ürünleri nad5-Rt1 ve-RT2 Ters transkripsiyon reaksiyonları normalleştirmek için kullanılan ve karşılaştırarak circularized nad5 oranı tahmin sqF1 & sqR1 (RT-sqPCR için) veya qF1 & qR1 (RT-qPCR için) PCR ürünleri. Self-ligasyon öncesi, RNAs RNA 5 ' poliphosphataz tarafından önceden tedavi edildi ve tüm transkriptlerin RNA ligaz tarafından devreden çıkılması için kullanılabilir hale gelmiştir. RT-sqPCR analizinde, toplam RNA kullanıldığında nad5 mRNA 'nın çok küçük bir kısmı devre edildi, ancak zenginleştirilmiş MITOKONDRIYAL RNA kullanıldığında oran büyük ölçüde arttı (Şekil 3B). RT-qPCR sonuçları, kendiliğinden bağlandı nad5 mRNA oranının zenginleştirme işleminden sonra% 3,7 ' den% 32 ' e yükselmesini göstermiştir (Şekil 3c). Nad1 Analizi benzer sonuçlar verdi ve nad1 mRNA 'nın döngü verimliliği% 0,7 ' den% 30 ' a çıkarıldı (şekil 3D-F).
Bu analizlere göre, yaklaşık% 30 Mısır mitokondriyal RNAs iyileştikten sonra kendinden bağlandı ve artan döngü verimliliği cRT-PCR tarafından hedef transkriptlerin kolay algılanmasını açıklar.
Mısır belirlenmesi COX2 cRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak mRNA Termini
COX2 geni 'Ni, CRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak Mısır mitokondriyal transkriptlerin haritalaması ve ayrımcılığını tanıtmak için örnek olarak kullandık (Şekil 4).
COX2 mRNA eşlemesinin başlangıcında, üç dışa dönük astar CF1, CF2 ve cr1 gen kodlama bölgesi (Şekil 4d) üzerinde tasarlanmıştır. CF1 ve CF2 iç içe Primers ve CF2 69 BP aşağı CF1 oldu. 6.1 – 6.5 adımlarında sentezlenen ve 7.1 – 7.6 adımda normalleştirilmiş cDNAs şablonunu kullanarak, CF1 & CR1 primer çifti iki belirgin bandı güçlendirdi ve amplifikasyon sonuçları iç içe geçmiş astar CF2 & CR1 (Şekil 4A) ile tekrarlanmıştır. Dahası, iki bant güçlü 5 ' polyphsophatase-tedavi RNA, onlar RNA 5 ' polyphsophatase duyarlı olduğunu ve birincil 5 ' Termini var olduğunu düşündürerek, tedavi edilmemiş mevkidaşı tespit etmek zor iken güçlendirilmiş edildi.
İki aday bandında COX2-1 ve-2 seçildi ve agaroz jeli bağımsız olarak kurtarıldı ve vektörler halinde klonlanmış. Koloni PCR sonuçları, pozitif klonların değişken büyüklükte ekler içerdiğini, transkriptlerin heterojen 5 ' ve/veya 3 ' Termini 'i ima ettiğini gösterdi (Şekil 5). Pozitif klonlar ticari olarak sıralanmış ve sıralama verileri, 9,3 adımda açıklandığı gibi Mısır mitokondriyal genomu ile hizalanmıştır.
Sıralama ve hizalama sonuçları, iki transkriptlerin 3 ' sonlarda aynı olduğunu, ancak 5 ' UTRs (Şekil 4d) uzunluğundaki farklı olduğunu gösterdi. COX2-1 ve-2 ' nin 5 ' uçları 992-1030 ve 1276-1283 NT 'de sırasıyla Aug 'a kadar zenginleştirilmiştir, bunların 3 ' End ise stop codon 39 NT aşağı aşağı oldu. CRT-PCR sonuçlarından indirilmiş, hesaplanan COX2-1 ve-2 boyutları sırasıyla 1804 – 1832 ve 2088 – 2095 NT 'dir.
CRT-PCR eşleme sonuçlarını doğrulamak için, RNA jel leke hibridizasyon COX2 gen kodlama bölgesinden türetilen prob kullanılarak yapıldı ve COX2-1 ve-2 gibi benzer boyutta iki büyük bant algılandı (Şekil 4c). Ayrıca, Kuzey Blot 2.500 ve 2.800 NT hakkında iki büyük bantları algılandı, ancak cRT-PCR tarafından amplifikatörleşmiş değildi. İki büyük bant sırasıyla COX2-3 ve-4 olarak seçildi. Onları eşlemek için, başka bir iki dışa dönük astar (yani CR2 ve CF3), 5 ' ve 3 ' UTRs COX2-2 üzerinde demirlemiş, tasarlanmış ve pozisyonları COX2-3 ve-4 beklenen transkript uçları yakın oldu. Primer çifti CF3 & CR2 kullanarak, iki büyük bant güçlü cDNAs itibaren 5 ' polyphsophatase-tedavi RNA türetilmiş ancak tedavi edilmemiş mevkidaşı (Şekil 4A) tarafından güçlendirilmiştir. Sıralama sonuçları aynı 5 ' Termini ise değişken 3 ' biter gösterdi. İki transkriptların hesaplanan boyutu 2512/2513 ve 2833 – 2835 NT, sırasıyla, ve Kuzey Blot tespit iki büyük bantları ile boyutu yakın idi. Ayrıca, cRT-PCR sonuçları cox2-3 ve-4 birincil 5 ' Termini var önerdi.
Ayrımcılık sonuçlarını onaylamak için, cRT-PCR haritalama sonuçlarına göre beş dışa dönük astar tasarlanmıştı, i.e. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 ve qCR3, ve primer çiftleri qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3, ve qCF2 & qCR3 için kullanıldı COX2-1,-2,-3 ve-4 ' ü sırasıyla RT-qPCR analizi. Beş ' polyphsophatase-tedavi örnek tüm dört RT-qPCR ürünlerin göreli bolluk çok daha yüksek olduğunu, hangi cRT-PCR ayrımcılık sonuçları doğrular tedavi edilmemiş meslektaşı.
Özetle, Mısır COX2 geni transkript deseni karmaşık ve cRT-PCR tabanlı strateji etkili ayrımcılık ve haritalar COX2 mRNA birden fazla izoformlarının.
Şekil 1: cRT-PCR tabanlı stratejiye genel bakış. CRT-PCR tabanlı stratejinin ana adımlarının çizimi. 5 ' + ve 5 '-= RNA 5 ' poliphosphataz tarafından tedavi edilen ve tedavi edilmeyen iki RNA örneği. Beş ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs 'dan türetilen iki cDNA örneği, Mısır 'da 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilir ve birincil ve işlenmiş transkriptler cRT-PCR ürünlerini karşılaştırarak ayrımcılık yapmaktadır. Gen A için, ilgili RNA 'nın birincil 5 ' ucu vardır, çünkü 5 ' poliphosphataz tedavi edilen RNA 'dan gelen PCR ürün bolluğu, tedavi edilmemiş mevkidaşından çok daha yüksektir; Gen B için, iki mitokondriyal RNAs setinden gelen PCR ürünleri, ilgili RNA 'nın işlenen 5 ' terminalini ima ederek karşılaştırılabilir bir seviyede amplifikatörlerdir. Kodlama bölgesi ve UTRs sırasıyla gri kutu ve kalın çizgilerle temsil edilir. CRT = Ters transkripsiyon için astar; CF1, CF2, CR1 ve CR2 = PCR astarları, 5 '-3 ' ' in dairesel transkript kavşağının kesiştiği; QCF ve qcr = RT-qPCR için farklı astar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: mitokondriyal RNA bütünlüğünü agaroz jel elektroforezi ile değerlendirin. (A) 15-DAP mısır çekirdekleri hazırlanan mitochondrial Rnas. M = DNA Moleküler Marker. (B) T4 RNA ligaz tarafından 5 ' poliphosphataz ve/veya döngüden sonra tedavi edildikten sonra çekirdek mitokondriyal RNA. 5 ' + = mitokondrial RNA tedavi sonrası 5 ' poliphosphataz; T4 & 5 ' + =, T4 RNA ligaz tarafından 5 ' poliphosphataz ve daireselleşmesi ile tedavi sonrası mitokondriyal RNA; T4 & 5 '-= sadece döngüden sonra mitokondriyal RNA. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: RT-PCRs tarafından tahmin edilen nad5 ve nad1 mrnas 'ın döngü verimliliği. (A) ve (D) nad5 ve nad1 genlerin şematik şeması sırasıyla. EX = eXoN. Exons ve intronlar sırasıyla gri kutular ve eğri çizgiler olarak gösterilir. Ters transkripsiyon astar RT1 ve RT2 pozisyonu oklar ile belirtilir. Siyah noktalar PCR astarların konumunu gösterir ve PCR ürünlerinin tahmin edilen boyutu gösterilir. sqF1, sqF2, sqR1 ve sqR2, RT-sqpcr için astarlar; qF1, qF2, qR1 ve qR2, RT-qPCR için astar vardır. (B) ve (E) RT-sqpcr nad5 ve nad1 mrnas 'ın döngü verimliliğini sırasıyla analiz ederler. M = DNA Moleküler Marker. (C) ve (F) nad5 ve nad1 mrnas 'ın döngü verimliliğinin sırasıyla, RT-qPCR analizi. RT1 ve RT2 astar tarafından transkripsiyonu ters iki cDNA örnekleri sqF2 & sqR2 (RT-sqPCR için) veya qF2 & qR2 (RT-qPCR) PCR ürünleri ile normalleştirilir. Nad5 ve nad1 mrnas 'ın döngü verimliliği, SQF1 & SqR1 (RT-sqpcr için) veya QF1 & QR1 (RT-QPCR için) PCR ürünlerini karşılaştırarak tahmin edilmektedir. & qF1 & qR2 RT2 reaksiyon/qF1 & qR1 üzerinde qF2 & qR2 üzerinde Rt1 reaksiyonu üzerinde qR1 qF2 üzerinde/ Değerler, üç biyolojik çoğaltır ve SDs 'dir. 5 ' trifosfat tarafından potansiyel etkisini dışlamak için, RNAs tarafından tedavi edildi 5 ' önce kendinden ligasyon polyphosphatase. Toplam ve Mito = toplam ve mitokondriyal RNAs, sırasıyla. RT1 ve RT2 = cDNAs ters RT1 ve RT2 astar tarafından transkripsiyonu, sırasıyla lütfen buraya tıklayın Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 4: cRT-PCR-cased stratejisini kullanarak COX2 olgun mRNA Termini haritalama. (A) COX2 cRT-PCR ürünlerinin jel ayrımı. + ve-= cDNAs 5 ′ den türetilmiştir ' poliphosphataz-tedavi ve non-tedavi mitokondriyal RNAs, sırasıyla. İki cDNA numunesi 26S cDNA (26S) amplifikasyonu ile normale döndü. Beş astar için kullanılır cRT-PCR analizinde COX2 mRNA: CF1, CF2, ve CF3 iç içe astar ve CF2 ve CF3 69 ve 138 BP aşağı aşağı CF1, sırasıyla; CR1 ve CR2 iç içe Primers ve CR2 1.288 BP upstream CR1 olduğunu. ' 1 ' ve ' 2 ' tarafından gösterilen bantlar hem CF1 & CR1 hem de CF2 & CR1 tarafından yükseltilirken, ' 3 ' ve ' 4 ' bantları CF3 & CR2 tarafından güçlendirilmiş. Dört bandın hepsi klonlayarak sıralanmış. Yıldız işaretleri tarafından işaretlenmiş gruplar tekrarlanamadı ve sonuçlardan dışlandı. M = DNA Moleküler Marker. (B) 5 ' poliphosphataz tedavisinden sonra COX2 mRNA 'nın göreli bolluğunun RT-qPCR analizi. İki cDNA numuneleri, 26S-CRT, Cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, COB-CRT ve COX1-CRT içeren bir primer karışım ile eşit oranda sentezlenmiş ve 26S olgun rRNA 'dan türetilen cDNA normalleştirme için kullanıldı. +/-= COX2 üzerinde 26S tedavi numunesi/COX2 üzerinde 26S üzerinde tedavi edilmemiş örnek. Değerler, üç biyolojik çoğaltır ve SD gösterir. RT-qPCR için kullanılan astarlar belirtilir. (C) COX2 transkriptleri Kuzey leke analizi. 2 μg mitokondriyal RNA yüklendi. COX2 olgun mRNA farklı izoformlarının karşılık gelen bantları işaretlenir. (D) COX2 mRNA 'nın transkript termını cRT-PCR sonuçlarından düşülür. UTRs ve açık okuma çerçeveleri sırasıyla kalın çizgiler ve gri kutular olarak gösterilir. 5 ' ve 3 ' Termini 'nin AUG (+ 1) ve UAA (-1) ile göreli pozisyonları ve bu pozisyonlarda sıralanmış tek klonların sayısı gösterilir. Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyon astar pozisyonları sırasıyla kapalı ve açık ok başlıkları olarak gösterilir. RT-qPCR için kullanılan dışa dönük astarlar açık kareler olarak gösterilir ve COX2 sondasının konumu belirtilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: koloni PCR tarafından COX2-4 ekler içeren pozitif klonlar seçimi. (A) COX2-4 ekler içeren tek klonlar ekrana Colony PCR. COX2-4 Ekle boyutu yaklaşık 1.165 BP, ve vektör dizileri 100 BP olduğunu. Koloni PCR ürünlerinin hesaplanan boyutu hakkında 1.265 BP, ve küçük boyut ekler içeren bu klonlar sıralı değil, yani, sayılar 11, 14, 22, ve 23. (B) (A) içinde ekran olan pozitif klonların sıralama sonuçları. 5 '/3 ' biter = 5 ' ve 3 ' AUG (+ 1) ve UAA (-1), sırasıyla göreli olarak biter. 12 ve 20 numaraların sıralama sonuçları diğerlerinden çok daha küçük olduğu için dışlandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Bileşen | 50 μL reaksiyonu için hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| 10X RNA 5 ' poliphosphataz tampon | 5 | 1x |
| RNase inhibitörü (40 U/μL) | 0,75 | 0,6 U/μL |
| Mitokondriyal RNA | X | 0,2 μg/μL |
| RNA 5 ' poliphosphataz (20 U/μL) | 2,5 | 1 U/μL |
| DEPC-deiyonize H2O tedavi | μL 50 için | - |
Tablo 1: RNA 5 ' poliphosphataz tedavisinin reaksiyon bileşenleri.
| Bileşen | 20 μL reaksiyonu için hacim (μL) | Son konsantrasyon |
| 10X T4 RNA ligaz ı tampon | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 μM |
| PEG8000 (% 50) | 6 | 15 |
| RNA inhibitörü (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| 5 ' poliphosphataz tedavi edilen veya tedavi edilmeyen mitokondriyal RNA | X | 0.1 ~ 0.2 μg/μL |
| T4 RNA ligaz ı (30 U/μL) | 0,4 | 0,6 U/μL |
| DEPC-tedavi edilmiş deiyonize H2O | 20 μL 'ye | - |
Tablo 2: mitokondriyal RNA döngülerinde reaksiyon bileşenleri.
| Bileşen | 10 μL ön karışımı (μL) için hacim |
| Primer karışımı (1 μM toplam)a | 2 |
| dNTP karışımı (her biri 10 mM) | 1 |
| Dairesel 5 ' poliphosphataz-tedavi edilmiş veya tedavi edilmeyen mitokondriyal RNAb | X |
| DEPC-deiyonize H2O tedavi | 10 μL 'ye |
Tablo 3: Ters transkripsiyon reaksiyonu Için ön karışım. bir Astar karışımı 26S-CRT ve 7 diğer RT astar eşit oranı içerir, ve son konsantrasyon 1 μM. biki ön karışımları yan yana hazırlanır, ve aynı miktarda içerir (200 ng) içinde circularized 5 ' polyphosphatase-tedavi veya tedavi edilmeyen mitokondriyal RNA.
| Bileşen | 20 μL reaksiyon sistemi (μL) için hacim | Son konsantrasyon |
| Şablon RNA/primer/dNTP * | 10 | - |
| 5x RTase tampon | 4 | 1x |
| RNase inhibitörü (40 U/μL) | 0,5 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| DEPC-tedavi edilmiş deiyonize H2O | 20 μL 'ye | - |
Tablo 4: Ters transkripsiyon reaksiyonları bileşenleri. * 6,3 adımda hazırlanan RNA/primer/dNTP ön karışımları şablonu.
| Bileşen | 20 μL reaksiyon sistemi (μL) için hacim | Son konsantrasyon |
| Deiyonize H2O | 7 | - |
| 2x reaksiyon tamponu | 10 | 1x |
| dNTP karışımı (her biri 10 mM) | 0,4 | 0,2 mM her biri |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| 26S-CR1 (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Şablonlar cDNA, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen veya tedavi edilmemiş RNAs * circularized türetilen | 0,6 | - |
| DNA polimeraz (1 U/μL) | 0,4 | 0,02 U/μL |
Tablo 5:26S cDNA PCR amplifikasyon Için reaksiyon bileşenleri. * Başlangıçta, şablon cDNAs (0,6 μL) eşit hacim normalleştirme için kullanılır. Gerekirse, iki PCR reaksiyonu arasında aynı bolluk 26S PCR ürünleri sağlamak için şablon cDNAs tutarları değiştirin.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | Döngü numarası |
| İlk denatürasyon | 95 °C derece | 3 dk. | 1 döngüsü |
| Denatürasyon | 95 °C derece | 15 saniye sonra | 22 – 25 döngü |
| Astar tavlama | 56 °C derece | 15 saniye sonra | |
| Uzantısı | 72 °C derece | 30 saniye sonra | |
| Son uzatma | 72 °C derece | 5 dk. | 1 döngüsü |
| Tutun | 4 °C ' ye kadar | ∞ | - |
Tablo 6: PCR koşulları yükseltmek için 26S normalleştirme Için cDNA.
| Bileşen | 20-μL reaksiyon sistemi (μL) için hacim | Son konsantrasyon |
| Deionized H2O | 20 μL 'ye | - |
| 2x reaksiyon tamponu | 10 | 1x |
| dNTP karışımı (her biri 10 mM) | 0,4 | 0,2 mM her biri |
| Divergent astar-ileri (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Divergent astar-ters (10 μM) | 0,8 | 0,4 mM |
| Şablon cDNA ' den türetilmiş 5 ' poliphosphataz tedavi edilen veya tedavi edilmeyen RNAs * | X | - |
| DNA polimeraz (1 U/μL) | 0,4 | 0,02 U/μL |
Tablo 7: dairesel hedef transkriptlerin PCR amplifikasyonu Için reaksiyon bileşenleri. * Bu reaksiyonlar kullanılan şablon cDNAs hacmi 26S rRNA normalleştirme sonuçları tarafından belirlenir.
| Adım | Sıcaklık | Zaman | Döngü numarası |
| İlk denatürasyon | 95 °C derece | 3 dk. | 1 döngüsü |
| Denatürasyon | 95 °C derece | 15 saniye sonra | 22-40 döngüleri c |
| Primer tavlama a | 50-65 °C derece | 15 saniye sonra | |
| Uzatma b | 72 °C derece | 0.5-1 dakika | |
| Finatl uzantısı | 72 °C derece | 5 dk. | 1 döngüsü |
| Tutun | 4 °C ' ye kadar | ∞ | - |
Tablo 8: hedef transkriptleri yükseltmek için PCR koşulları. bir Tam Tavlama ılıman, PCR astarların erime sıcaklığına bağlıdır. b Uzama süresi, amplifikasyon için hedefin uzunluğuna bağlıdır. Önerilen zaman 1 KB PCR parçası başına 1 dakika olur. c Genel olarak, 30 ~ 35 döngüleri PCR ürün yeterli miktarda üretmek için yeterlidir. Düşük bol transkriptler için, 40 döngüleri kadar döngü sayısını artırın.
Şekil S1: temsili Mısır mitokondriyal transkriptler için astar pozisyonu. CRT = Ters transkripsiyon astar; CF1, CF2, cr1 ve CR2 = PCR amplifikasyon için farklı astar; QCF ve qcr = RT-qPCR için farklı astar. Nad2-1, rps4-1 ve nad4-1 Mısır transkript Termini daha önce belirlendi (Zhang ve al., 20191). Aug (+ 1) ' e göre 5 '-ve 3 '-sonların pozisyonları ve stop kodon 'un son nüktiotit (-1) gösterilir. Kodlama bölgeleri ve UTRs sırasıyla gri kutular ve kalın çizgiler olarak belirtilir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Şekil S2: Mısır 'da nad5 mRNA 'nın döngü verimliliğini tahmin etmek için prensip. Self-ligasyon reaksiyonunda, mitokondriyal RNAs 'ın sadece bir kısmı devre altındadır. Nad5 mRNA 'nın döngüsel oranını hesaplamak için, ilk Iplikteki cdnas, yani nad5-Rt1 ve-RT2 sentezlemek için iki gen spesifik astar kullanılır. Nad5-RT2 ters Transkripsiyon (RT) reaksiyonunda, SqF2 & sqR2 (RT-sqpcr için) ve QF2 & QR2 (RT-qPCR için) tarafından yükseltilmiş PCR ürünleri hem doğrusal hem de döngüsel nad5 türetilir , ancak SQF1 & SqR1 (RT-sqpcr için) ve qF1 & qR1 (RT-qPCR için) PCR ürünleri sadece devre nad5 elde edilir; nad5-Rt1 reaksiyon, dört çift PCR astar nad5her iki formları güçlendirebilirim. , Nad5 mRNA circularized oranını hesaplamak için Iki reaksiyon SqF2 & SqR2 veya QF2 & qR2 PCR ürünleri tarafından normalleştirilmiş. SqF1 & sqR1 veya qF1 & qR1 PCR ürünlerinin bolluğunu iki RT reaksiyonu arasında karşılaştırarak, nad5 mRNA 'nın döngü verimliliği kabaca tahmin edilmektedir. Eski = eXoN. Exons ve intronlar sırasıyla gri kutular ve eğri çizgiler olarak gösterilir. Nad5-Rt1 ve-RT2 astar pozisyonları oklar ile belirtilir. Siyah noktalar PCR astarlarının konumlarını gösterir ve PCR ürünlerinin tahmin edilen boyutu gösterilir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Tablo S1: Primer bilgi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki bir çalışmada, Arabidopsis hücre süspansiyon kültüründen toplam ve mitokondrial Rnas CRT-PCR tarafından mitokondriyal transkript Termini harita için kullanılan ve benzer sonuçlar elde edildi12. Ancak, mitokondriyal transkript Termini 'nin diğer birçok çalışmada1,2,3,9eşleminde sadece zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA kullanılmıştır. Mitokondriyal RNA 'nın zenginleşmesi, mitokondriyal transkript Termini 'nin Mısır 'da cRT-PCR haritalaması için önemli bir adım olduğunu tespit ettik. Bu zenginleştirme sonrasında, döngüsel mitokondriyal RNA 'nın oranı büyük ölçüde% 0.3 –% 3,7 ' den ~% 30 ' a (Şekil 3 ve Şekil S2) artar ve bu da bir PCR turunda, döngüsel hedef transkriptlerin amplifikasyonu mümkün kılar.
Mitokondriyal RNA 'nın döngüsel verimliliği, her ikisi de BDT-splicing intronlar tarafından bağımsız öncülere bölünmüş olan Mısır nad1 ve nad5üzerinde RT-PCR analizi ile tahmin edilmiştir. Çünkü habercisi Rnas varlığının potansiyel etkisi yanı sıra RT verimliliği varyasyonu değil, bu sadece gerçek mitokondriyal RNA döngü verimliliği kaba bir tahmindir.
Mitokondriyal RNA ve PEG8000 konsantrasyonunu değiştirerek ve kuluçpa süresini uzatmak suretiyle Self-ligasyon koşullarını değiştirdik, ancak bu değişiklikler mitokondriyal RNA döngülerleştirme verimliliğini etkilemez. Biz olup olmadığını daha Percoll gradyan arıtma, döngü verimliliği artırabilir emin değilseniz, ham mitokondri Bölüm 2 hazırlanmış kalitesi yeterince iyi cRT-PCR mitokondriyal transkript Termini Mısır haritası. PCRs birden fazla tur yanlış olumlu sonuçlara neden olabilir bu yana, bir yuvarlak PCR hedef transkriptlerin amplifikasyon haritalama sonuçları daha güvenilir hale getirir.
Primer transkriptlerin 5 ' trifosfat kararsız, ve bilinmeyen nedenlerle 5 ' monofosfat dönüştürülebilir. Bu sorun, 5 ' trifosfat1,2,4varlığı/yokluğunda bağlı olarak yaklaşımlar kullanarak birincil ve işlenmiş transkriptler arasında net bir farklılaşma engeller. Mısır 26S rRNA olgun formu monophosp, 5 ' End vardır ve RNA 5 ' polyphosphatase duyarsızdır. Dengesiz 5 ' triphospahte etkisini en aza indirmek için, Olgun 26S rRNA iki RNA örnekleri normalleştirmek için kullanılır, tedavi ve tedavi edilmemiş 5 ' polyphosphatase, ve Mısır 'da transkriptler iki tür ayırt etmek için önemli bir adım olarak gösterilir mitokondri. Normalleştirme sonrasında, birincil ve işlenmiş transkriptler, 5 ' poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNA örneklerinden elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR sonuçları karşılaştırılarak ayrımcılık yapabilir. Primer transkriptler 5 ' poliphosphataz duyarlı, ve güçlü bir şekilde 5 ' poliphosphataz tedavi numunesi ancak (veya çok düşük düzeyde kararsız 5 ' trifosfat nedeniyle) tedavi edilmemiş meslektaşı tarafından güçlendirilir. Buna karşılık, işlenen transkriptler iki örnek arasındaki karşılaştırılabilir düzeylerde algılanır.
Bitkiler, birçok mitokondriyal genlerin transkript desenleri oldukça karmaşık olan1,2. Örneğin, Mısır nad6 ve atp6 genler her iki monocistrons ve diklemler olarak ifade edilir ve nad6, Atp6, ve atp6-na6 olgun mrnas sırasıyla iki, üç ve iki isoforms vardır. Dahası, bir mitokondriyal genin transkript nüfusu aslında öncü, Olgun ve bozulma RNAs karışımıdır. PCRs küçük boyutta molekülleri yükseltmek için eğilimli, ve bir çift astar kullanarak tüm transkript izoformlarının algılamak zordur. Bu nedenle, CRT-PCR haritalama sonuçlarını doğrulamak için RNA jel leke hibridizasyon gereklidir, ve alternatif astar Kuzey leke algılanan Bu transkriptler yükseltmek için gerekli olabilir, ancak ilk kez cRT-PCR.
Bu protokol cRT-PCR ayrımcılık sonuçlarını doğrulamak için bir RT-qPCR adımı içerir. Bazı olgun Mrk 'ların birden fazla isoform1boyutunda çok yakın olduğu IÇIN, RT-qPCR tarafından tüm ayrımcılık sonuçlarının onaylanması imkansız, ve bazı sabit devlet transkriptler arasında crt-PCR sonuçlar karşılaştırılarak tespit edildi tedavi ve yalnızca tedavi edilmeyen RNAs 'lar.
Bu protokolde, hedef transkriptlerin 5 ' ve 3 ' Termini 'leri, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile eşleştirilir ve sıralanacak tek klonların sayısını sınırlar. Alternatif bir yöntem olarak, cRT-PCR ürünleri, bir dizi istikrarlı durum transkriptleri için binlerce molekül sıralayarak yeni nesil sıralamalar ile sıralanabilir ve eşleme sonuçları daha doğru olacaktır.
Birincil ve işlenmiş 5 ' Termini tarafından cRT-PCR ve RT-qPCR ayrımcılığı yanı sıra, monofosfat 5 ' Termini çevreleyen RNA ikincil yapıların tanımlaması ile tespit edilebilir1,12. TRNA ve t-elemanı gibi RNA sekonder yapıların, RNase P ve/veya RNase Z12,18,19, endonükleolitik bölünmesi yönlendirerek mitokondriyal transkript bitiş oluşumuna aracılık edebilmesi iyi bilinmektedir. 20' ye kadar. Bu nedenle, bu 5 ' Termini tRNA veya t-elemanı bitişik Post-transcriptional işleme türetilmelidir ve monophosp, içerir.
Bu protokolü kullanarak, sabit devlet transkriptlerin büyük bir kısmı Mısır mitokondri1belirlendi. Ancak, birkaç farklılaşmamış ve/veya bilinmeyen nedeni1için eşleştirilmiş. Ayrıca, biz 5 ' transkript Termini pozisyonu, bu protokol dahil olsa da, primer uzatma analizi ile teyit edilmesi daha iyidir düşünüyorum. Deneysel verilerin olmaması nedeniyle, bu stratejinin pirinç (Oryza sativa) ve Arabidopsisgibi diğer bitki türleri için uygun olup olmadığına emin değiliz. Bitki mitokondri yanı sıra, hem primer ve işlenmiş transkriptler stabil plastidler21birikmiş, ve bu stratejinin harita ve Plastit transkriptler ayrımcılık için kullanılabilir olup olmadığını belirsiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31600250, y), bilim ve teknoloji projeleri Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) ve Çin tarımsal araştırma sistemi (Grant Hayır tarafından desteklenmektedir. ARABALAR-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R.
