Summary
Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5' y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5', y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.
Abstract
En las mitocondrias vegetales, algunas transcripciones en estado estacionario tienen 5' trifosfato derivado de la iniciación de la transcripción (transcripciones primarias), mientras que los otros contienen 5' monofosfato generado post-transcripción (transcripciones procesadas). Para discriminar entre los dos tipos de transcripciones, se han desarrollado varias estrategias, y la mayoría de ellas dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5'. Sin embargo, el trifosfato en la primaria 5' termini es inestable, y dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones. Para diferenciar y mapear sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas de forma estable en el mitocondrion de maíz, hemos desarrollado una estrategia circular basada en RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, tratamiento de polifoshpatase de ARN 5', cuantitativa RT-PCR (RT-qPCR) y Northern blot. Como mejora, esta estrategia incluye un paso de normalización de ARN para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5'.
En este protocolo, el ARN mitocondrial enriquecido es pretratado por la polifosfatasa de ARN 5', que convierte el triphsofato de 5' en monofosfato. Después de la circularización y la transcripción inversa, los dos CDNderivados derivados de ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante el ARNm maduro de maíz 26S, que tiene un extremo procesado de 5' y es insensible a 5' polifosfatasa. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos de los ARN tratados y no tratados. La transcripción termini se determina mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y luego verificada por Northern blot.
Mediante el uso de esta estrategia, se han determinado la mayoría de las transcripciones en estado estacionario en mitocondrion de maíz. Debido al complicado patrón de transcripción de algunos genes mitocondriales, algunas transcripciones en estado estacionario no se diferenciaron y/o mapearon, aunque se detectaron en una mancha del norte. No estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para discriminar y mapear las transcripciones de estado estacionario en otras mitocondrias vegetales o en plastoides.
Introduction
En las mitocondrias vegetales, muchos ARN maduros y precursores se acumulan como múltiples isoformas, y las transcripciones de estado estacionario se pueden dividir en dos grupos basados en la diferencia en sus extremos de 5'1,2,3, 4. Las transcripciones primarias tienen extremos de trifosfato de 5', que se derivan de la iniciación de la transcripción. Por el contrario, las transcripciones procesadas tienen 5' monofosfato generado por el procesamiento post-transcripción. La discriminación y el mapeo de los dos tipos de transcripciones son importantes para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcripción y la maduración final de la transcripción.
Para distinguir entre las transcripciones primarias y procesadas en el mitocondrion vegetal, se han desarrollado cuatro estrategias principales. La primera estrategia es pretratar los ARN mitocondriales con pirofosfatasa de ácido tabaco (TAP), que convierte el trifosfato de 5' en monofosfato y permite que las transcripciones primarias sean circularizadas por ARN ligatado. Las abundancias de transcripción de muestras de ARN tratadas con TAP y no tratadas se comparan entonces por la amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) o RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. En la segunda estrategia, las transcripciones procesadas se agotan en primer lugar de los ARN mitocondriales utilizando exonucleasa dependiente del terminador 5'-fosfato (TEX), y las transcripciones primarias que quedan se mapean mediante el análisis de extensión de imprimación5,6 . La tercera estrategia es pre-tapar las transcripciones primarias usando guanylyl transferasa, y luego la posición de trifosfato 5' termini se determina mediante la extensión de imprimación junto con el análisis de protección de la nucleasa S17,8 ,9. A diferencia de las que dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', la cuarta estrategia combina transcripción in vitro, mutagénesis dirigida por el sitio y análisis de extensión de imprimación para caracterizar a los promotores putativos y determinar la transcripción sitiosdeiniciación 8,10,11. Mediante el uso de estas estrategias, se han determinado muchas transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias vegetales.
Sin embargo, varios estudios han informado de que el trifosfato de 5' de transcripciones primarias eran inestables, y se convirtieron fácilmente en monofosfato por razón desconocida2,4,12,13. Este problema dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones mediante el uso de técnicas en función de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', y esfuerzos anteriores para discriminar sistemáticamente entre las transcripciones primarias y procesadas en la planta mitocondrias falló2,12.
En este protocolo, combinamos cRT-PCR, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5', RT-qPCR y Northern blot para distinguir sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en maíz (Zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR permite el mapeo simultáneo de 5' y 3' extremidades de una molécula deARN, y generalmente se adapta a la transcripción de mapa termini en plantas 2,12,14,15. ARN 5' polifosfatasa podría eliminar dos fosfatos de la trifosfato 5' termini, lo que hace que las transcripciones primarias estén disponibles para la auto-ligación por ARN ligasa. Estudios anteriores mostraron que el ARNm maduro 26S en el maíz había procesado 5' terminus, y era insensible al ARN 5' polifosfatasa1,16. Para minimizar la influencia del trifosfato inestable en los 5' termini primarios, los ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante arNM maduros de 26S, y las transcripciones primarias y procesadas se diferencian comparando las cRT-PCR obtenidos de las dos muestras de ARN. Los resultados de la asignación cRT-PCR y la discriminación son verificados por Northern blot y RT-qPCR, respectivamente. Por último, se utilizan imprimaciones alternativas para amplificar las transcripciones detectadas en Northern blot pero no por cRT-PCR. Mediante el uso de esta estrategia basada en cRT-PCR, la mayoría de las transcripciones de estado estacionario en mitocondrion de maíz se han diferenciado y mapeado1.
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Protocol
1. Primer diseño
- Diseñar imprimadores específicos de genes para transcripción inversa (RT) utilizando el software de diseño de imprimación PCR (Tablade Materiales)basados en las reglas generales del diseño de imprimación17.
NOTA: Los imprimadores RT son muy específicos para las transcripciones de destino, y generalmente están anclados en la parte de 5' de las secuencias de codificación (RNN maduros y ARN precursores), o 500-600 nt aguas abajo del extremo anticipado de 5' (18S y 26S rRNAs). - Diseñe pares de imprimaciones divergentes para amplificar las transcripciones circularizadas por cRT-PCR.
NOTA: Las imprimaciones divergentes emparejadas flanquean la unión de 5'-3' de las transcripciones circularizadas, y sus posiciones varían entre las transcripciones de destino analizadas (Figura S1). Algunas transcripciones tienen TOR larga; por ejemplo, nad2-1 5' UTR y rps4-1 3' UTR son 1,985 y 1,826/1,834 nt, respectivamente1. Si ambos imprimadores están anclados en la región de codificación, será difícil amplificar las transcripciones de destino. Por el contrario, algunas UTR son cortas; por ejemplo, los 3' UtRs de nad2-1 y nad4-1 son 34/35 y 29–31 nt, respectivamente1. Si las imprimaciones emparejadas se encuentran lejos de las secuencias de codificación, el PCR fallará. Generalmente, dos pares de imprimaciones divergentes están diseñados para cada transcripción objetivo, mientras que varios pares pueden ser necesarios para mapear aquellos cuyos patrones de transcripción son complicados y / o UT son muy largos. - Diseñe pares de imprimaciones convergentes para preparar sondas de ARN para la mancha del norte.
NOTA: Las imprimaciones emparejadas se encuentran en la región de codificación del gen objetivo, y el tamaño del producto PCR debe estar en el rango de 100 a 1.000 bp. Cada imprimación directa debe contener un sitio de enzimas de restricción para minimizar las secuencias vectoriales en las sondas resultantes.
2. Preparación de mitocondrion crudo a partir de núcleos en desarrollo de maíz
- Esterilice plagas, morteros, embudos de vidrio, tubos y puntas por autoclave, y séquelos en el horno.
- Realice todos los procedimientos a 4 oC o sobre hielo, y enfríe previamente todas las soluciones.
- Preparar 100 ml de tampón de extracción (EB), compuesto por sacarosa de 0,3 M, pirofosfato de tetrasodio de 5 mM, 10 mM KH2PO4,2 mM EDTA, 1% [w/v] polivinilpirrolidona 40, 1% [p/v] albúmina sérica bovina, 5 mM de L-cisteína y ácido ascórbico de 20 mM. Ajuste a pH 7.3 con KOH y esterilizar por filtración.
- Preparar 100 ml de tampón de lavado (WB) que consiste en sacarosa de 0,3 M, EGTA de 1 mM y MOPS de 10 mM (3-(N-morpholino)ácido propanesulfónico). Ajustar a pH 7.2 con NaOH y esterilizar por filtración.
NOTA: Se sugiere preparar EB y WB utilizando H2O desionizado tratado con DEPC. - Recoger 20 g de núcleos en desarrollo a los 11-20 días después de la polinización (DAP) a un tubo de 50 ml colocado en hielo, y luego transferir los granos a morteros pre-enfriados.
NOTA: Utilice una proporción de 100 ml de EB a 20 g de granos de maíz. - Agregue entre 10 y 20 ml de EB helado a cada mortero y muele los granos por completo.
- Agregue más EB y filtre los tejidos molidos a través de dos capas de tela de filtro (Tablade materiales).
- Centrifugar el filtrado a 8.000 x g durante 10 min y desechar el pellet.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugarlo a 20.000 x g durante 10 min.
- Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 6 ml WB.
- Alísgue la suspensión a cinco tubos libres de RNase de 1,5 ml, y centrifugarlos a 14.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante, congele el pellet mitocondrial en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 oC.
3. Extracción de ARN mitocondrial
- Extraiga el ARN mitocondrial con un reactivo comercial (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
PRECAUCION: Este reactivo contiene isotiocianato de fenol y guanidina. Trabaje con él en una capucha de humos, y use abrigo de laboratorio y guantes. - Disolver el ARN mitocondrial aislado en H2O desionizado tratado con DEPC, y estimar la concentración y pureza del ARN con un espectrofotómetro (Tablade materiales).
NOTA: Por lo general, el ARN mitocondrial de 250 g se obtiene a partir de 20 g de granos de maíz 15-DAP. - Preparar un gel de agarosa compuesto por 1 tampón TAE (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA), 1,5% de agarosa (Tablade materiales)y 1x tinte de tinción nuclear (Tablade materiales).
- Agregue un volumen apropiado de tampón de carga 10x (0,5% de azul bromofenol, 0,5% de xileno cianol FF y 50% glicerol), y cargue la mezcla de ARN mitocondrial/tampón de carga en el gel de agarosa del 1,5%.
- Ejecute el gel en 1 tampón TAE a 5-6 V/cm durante 20–25 min, y evalúe la integridad del ARN mitocondrial mediante imágenes del gel con un sistema de documentación de gel (Tablade materiales).
NOTA: La presencia de dos bandas distintas (3.510 y 1.970 nt para el maíz mitocondrial 26S y 18S rRNA, respectivamente) es un estándar aceptable para el ARN mitocondrial intacto. Para excluir la posible degradación, se debe investigar la integridad del ARN durante los múltiples pasos de la preparación circular del ARN (Figura2).
4. Arn 5' Tratamiento de polifosfatasa
- Configurar el tratamiento de la polifosfatasa de ARN 5' (Tabla y Materiales) (Tabla 1), e incubar a 37 oC durante 30-60 min.
- Recuperar el ARN tratado con polifosfatasa de 5' con un kit de purificación de ARN (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Repita los pasos 3.3 a 3.5.
5. Circularización del ARN
- Preparar dos reacciones de circularización utilizando las mismas cantidades de 5' ARN mitocondriales tratados con polifosfatasa y no tratados (Tabla 2), e incubar ambas reacciones a 16 oC durante 12-16 h.
- Recupere los dos conjuntos de ARN autoligados usando el mismo kit que en el paso 4.2.
NOTA: Cabe señalar que sólo una fracción del ARN mitocondrial será auto-ligada, y el ARN recuperado será una mezcla de transcripciones lineales y circularizadas. - Repita los pasos 3.3 a 3.5.
6. Transcripción inversa
- Sintetizar dos conjuntos de CDNA de las mismas cantidades de ARN circularizados de 5' tratados con polifosfatasa y no tratados (200 ng).
- Prepare una mezcla de imprimación añadiendo una proporción igual de 26S-CRT y hasta 7 otras imprimaciones RT.
NOTA: La concentración final de la mezcla de imprimación debe ser de 1 M. - Preparar dos premezclas combinando los reactivos enumerados en la Tabla3, incubar a 65oC durante 5 min y luego enfriar en hielo durante 2 min.
- Montar dos sistemas de reacción RT (Tabla4) e incubarlos a 42 oC durante 50 min.
- Calentar ambas reacciones RT a 70 oC durante 5 min, y luego enfriarlas en hielo.
7. Normalización
- Preparar dos reacciones de PCR añadiendo el mismo volumen de ACNdede de plantilla derivados de ARN polifosfatasa o no tratados de 5', imprimaciones divergentes que flanquean la unión de 5'-3' de rRNA circularizado 26S (es decir, 26S-CF1 y -CR1), etc. (Tabla5).
- Ejecute las dos reacciones en un ciclor térmico (Tabla de materiales) en las condiciones descritas en la Tabla 6.
- Preparar un gel de agarosa compuesto por 1 tampón TAE, 1,0% de agarosa y 1 x tinte de tinción nuclear.
- Añadir 2 l 10x tampón de carga (0,5% de bromofenol azul, 0,5% de xileno cianol FF y 50% de glicerol) a cada uno de los dos productos de PCR, y cargarlos en el gel.
- Ejecute el gel en 1 tampón TAE a 5-6 V/cm durante 30-40 min, e iimagee utilizando el mismo sistema de documentación de gel que el paso 3.5.
- Compare la abundancia de los dos productos pcR utilizando software informático (Tablade materiales, Figura 4A), y optimice la normalización cambiando las cantidades de cDNAs de plantilla si es necesario.
8. Amplificación de PCR
- Preparar pares de reacciones de PCR añadiendo el volumen adecuado de los CDNA normalizados y un par de imprimaciones divergentes que flanquean la unión 5'-3' de las transcripciones de destino (Tabla 7).
NOTA: La cantidad de cDNA de plantilla utilizados para la amplificación de PCR de las transcripciones de destino viene determinada por los resultados de normalización de rRNA 26S. - Realice las reacciones de PCR según el programa descrito en la Tabla 8.
- Repita los pasos 7.3 a 7.5.
- Cambie a imprimaciones divergentes anidadas y verifique los resultados de la primera ronda de PCR repitiendo los pasos 8.1 y 8.2.
- Repita los pasos 7.3 a 7.5.
- Recuperar las bandas prominentes que podrían repetirse en dos rondas de amplificación de PCR utilizando un kit de recuperación de ADN de gel (Tablade materiales).
9. Determinación de Transcripción Termini
- Clonar los productos PCR purificados por gel en un vector de extremo contundente (Tablade materiales)utilizando técnicas estándar.
- Realice la PCR de colonia para seleccionar clones positivos que contengan las inserciones de destino y secuenciarlos comercialmente.
NOTA: Los clones positivos que contienen plaquitas de tamaño variable se detectan generalmente a partir de una sola banda recuperada porque muchas transcripciones de estado estacionario en las mitocondriales vegetales tienen extremos heterogéneos de 5' y/o 3'1,12. - Alinee los datos de secuenciación con el genoma mitocondrial del maíz utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) del centro nacional de información biotecnológica (NCBI). Elija el organismo "maíz (taxid:4577)" y la base de datos de búsqueda "Colección de nucleótidos (nr/nt)".
- Encuentre la unión de 5'-3' de la transcripción circular, y determine las posiciones de 5' y 3' transcripción terminit.
- Calcular el tamaño de las transcripciones de destino.
10. Verificación de los resultados de mapeo cRT-PCR por ARN Gel Blot Hybridization
NOTA: La hibridación de la mancha de gel de ARN se realiza mediante un kit comercial (Tablade materiales),que contiene los reactivos para el etiquetado de transcripción de ARN con digoxigenina (DIG) y ARN T7 polimerasa, hibridación y detección inmunológica. Consulte los protocolos proporcionados en este kit para obtener más detalles. Asegúrese de que solo se utilice equipo libre de RNase para todo el procedimiento.
- Amplificar el fragmento de ADN utilizado para preparar la sonda de ARN, y clonarlo en el mismo vector que en el paso 9.1, que contiene un promotor T7 17 bp aguas arriba del sitio de inserción.
- Linealizar la construcción utilizando la enzima de restricción adecuada, recuperar el plásmido linealizado por un kit de purificación de ADN (Tablade materiales),y disolverlo en DEionizado con tratamiento DEPC H2O.
- Etiquete las sondas de ARN con DIG-11-UTP mediante un kit comercial (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar 500 ml de búfer MOPS 10x (0,2 M MOPS, 50 mM de acetato de sodio y EDTA de 10 mM) utilizando El sistema desionizado CON tratamiento DEPC H2O. Ajustar a pH 7.0 por NaOH, y esterilizar por filtración.
- Agregue de 2 a 3 volúmenes de tampón de carga (50% formamida, 6,2% de formaldehído, 1x MOPS, 10% glicerol y 0,1% de azul bromofenol) al ARN mitocondrial preparado en los pasos 3.1–3.3.
- Desnaturalice la muestra de ARN/mezcla de tampón de carga a 65 oC durante 10 minutos, y luego enfríe en hielo durante 1 min.
- Preparar un gel de agarosa desnaturalizado (2% formaldehído, 1,2% de agarosa y 1x MOPS), y cargar la mezcla de la muestra de ARN/tampón de carga en el gel (1–2 g de ARN mitocondrial por pocido).
- Ejecuta el gel en 1mopaTO a 3-4 V/cm durante 4 h.
- Preparar 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sodio, pH 7,0). Tratarlo con 0.1% DEPC durante la noche, y esterilizar por autoclave.
- Enjuague el gel dos veces en 20x SSC (15 min cada vez), y transfiera el ARN del gel a una membrana de nylon (Tablade Materiales)por transferencia capilar con 20x SSC durante 10-16 h.
- Fijar el ARN a la membrana horneando a 120 oC durante 30 min.
- Realizar hibridación de ARN y detección inmunológica con un kit comercial (Tablade Materiales)según las instrucciones del fabricante.
11. Discriminación de los extremos primarios y procesados de 5'
- Discrimine los extremos primarios y procesados de 5' comparando los productos cRT-PCR obtenidos de los ARN normalizados tratados con polifosfatasa y no tratados.
NOTA: Para las transcripciones primarias, la abundancia de productos de PCR a partir de ARN tratado con polifosfatasa de 5' es mucho mayor que la de la contraparte no tratada (Figura1, 'Gene A' y Figura 4A). Sin embargo, a las transcripciones procesadas, un nivel comparable de productos de ITP seamplificaría a partir de los dos conjuntos de ARN mitocondriales (Figura 1, «Gene B»). - Diseñe imprimadores RT-qPCR basados en los resultados de la asignación cRT-PCR.
- Verifique los resultados de la discriminación cRT-PCR por RT-qPCR.
NOTA: Las dos muestras de ADNc derivadas de ARN tratados con polifosfatasa y no tratadas de 5' son normalizadas por los productos RT-qPCR de rRNA maduro 26S.
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Representative Results
Estimación de la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial
En un estudio anterior, se utilizaron ARN totales y mitocondriales para la cartografía cRT-PCR de transcripción mitocondrial termini en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), y los dos tipos de ARN dieron resultados cartográficos similares12. Inicialmente, también usamos ARN totales para el mapeo cRT-PCR de la transcripción mitocondrial termini en el maíz. Después de muchas pruebas, encontramos que las transcripciones de destino eran difíciles de detectar. Como mejora, enriquecimos el ARN mitocondrial a partir de granos de desarrollo de maíz, e hizo posible la amplificación de las transcripciones de destino circularizadas en una ronda de PCR.
Para explicar la fácil amplificación de las transcripciones diana después del enriquecimiento, estimamos la eficiencia de la circularización del ARN realizando RT-PCR según el gen mitocondrial representativo nad5 (Figura3 y Figura S2). El gen nad5 de maíz contiene dos intrones transy dos cis-splicing. Después de la auto-ligación de ARN totales y mitocondriales, los CDNAs de primera hebra se sintetizaron de forma independiente utilizando imprimaciones nad5-RT1 y -RT2. Las dos imprimaciones podrían transcribir tanto los nad5 nmNM lineales como circularizados (FiguraS2). Se utilizan cuatro pares de imprimaciones convergentes para la amplificación de PCR: sqF1&sqR1 y sqF2&sqR2 para RT-PCR semicuantitativo (RT-sqPCR) y qF1&qR1 y qF2&qR2 para RT-qPCR. Para cDNAs transcritas por nad5-RT1, los cuatro pares de imprimaciones detectaron mRNA maduras de nad5 circularizados y lineales; para la reacción de transcripción inversa nad5-RT2, los productos sqF2&sqR2 y qF2&qR2 examinaron ambas formas de ARNm, mientras que los productos sqF1&sqR1 y qF1&qR1 PCR se derivaron únicamente de nad5 circularizado. Basándonos en este análisis, utilizamos los productos PCR sqF2&sqR2 (para RT-sqPCR) y qF2&qR2 (para RT-qPCR) para normalizar las reacciones de transcripción inversa nad5-RT1 y -RT2, y estimamos la relación de nad5 circularizada comparando la sqF1&sqR1 (para RT-sqPCR) o qF1&qR1 (para productos PCR RT-qPCR). Antes de la auto-ligación, los ARN fueron pretratados por la polifosfatasa de ARN 5' para hacer que todas las transcripciones estén disponibles para la circularización por ARN ligesa. El análisis RT-sqPCR mostró que una fracción muy pequeña de NAD5 mRNA se circularizó cuando se utilizó el ARN total, pero la relación se incrementó dramáticamente cuando se utilizó el ARN mitocondrial enriquecido (Figura3B). Los resultados de RT-qPCR mostraron que la relación entre nad5 y NAD5 autoligado aumentó de 3,7% a 32% después del enriquecimiento (Figura3C). El análisis de nad1 dio resultados similares, y la eficiencia de circularización de nad1 mRNA aumentó de 0.7% a 30% (Figura3D-F).
Según estos análisis, alrededor del 30% de los ARN mitocondriales de maíz se autoligaron después de la mejora, y el aumento de la eficiencia de la circularización explica la fácil detección de las transcripciones objetivo por cRT-PCR.
Determinación del maíz cox2 mRNA termini utilizando la estrategia basada en cRT-PCR
Usamos el gen cox2 como ejemplo para introducir el mapeo y la discriminación de las transcripciones mitocondriales de maíz utilizando la estrategia basada en cRT-PCR (Figura 4).
Al principio de la cartografía de cox2 mRNA, se diseñaron tres imprimaciones orientadas hacia el exterior CF1, CF2 y CR1 en la región de codificación genética (Figura4D). CF1 y CF2 eran imprimaciones anidadas, y CF2 era 69 bp aguas abajo de CF1. Utilizando la plantilla cDNAs sintetizada en los pasos 6.1–6.5 y normalizada en los pasos 7.1–7.6, el par de imprimación CF1&CR1 amplifiqué dos bandas prominentes, y los resultados de amplificación fueron repetidos por los imprimadores anidados CF2&CR1 (Figura4A). Además, las dos bandas se amplificaron fuertemente a partir del ARN tratado con poliphsofáforas de 5', mientras que eran difíciles de detectar en la contraparte no tratada, lo que sugiere que son sensibles al ARN 5' poliphsofáforase y tienen 5' termini primario.
Las dos bandas candidatas fueron nombradas cox2-1 y -2, y fueron recuperadas independientemente del gel de agarosa y clonadas en vectores. Los resultados de la PCR de colonias mostraron que los clones positivos contienen inserciones de tamaño variable, lo que implica 5' y/o 3' termini heterogéneos de las transcripciones (Figura 5). Los clones positivos se secuenciaron comercialmente, y los datos de secuenciación se alinearon con el genoma mitocondrial del maíz como se describe en el paso 9.3.
Los resultados de la secuenciación y alineación mostraron que las dos transcripciones eran idénticas en 3' extremos, pero diferentes en la longitud de 5' UT (Figura4D). Los 5' extremos de cox2-1 y -2 se enriquecieron en 992-1,030 y 1,276-1,283 nt aguas arriba de AUG, respectivamente, mientras que su 3' final fue 39 nt aguas abajo del codón de parada. Deducido de los resultados de cRT-PCR, los tamaños calculados de cox2-1 y -2 fueron 1.804-1.832 y 2.088-2.095 nt, respectivamente.
Para verificar los resultados de la asignación cRT-PCR, la hibridación de blot de gel de ARN se realizó utilizando la sonda derivada de la región de codificación de genes cox2, y se detectaron dos bandas principales con un tamaño similar al cox2-1 y -2 (Figura4C). Además, dos bandas más grandes de unos 2.500 y 2.800 nt fueron detectadas en la mancha norte, pero no fueron amplificadas por cRT-PCR. Las dos bandas más grandes fueron nombradas como cox2-3 y -4, respectivamente. Para mapearlos, se diseñaron otros dos imprimadores orientados hacia el exterior (es decir, CR2 y CF3), anclados en los UT2 -2 de 5' y 3', y sus posiciones estaban cerca de los extremos esperados de la transcripción de cox2-3 y -4. Utilizando el par de imprimación CF3&CR2, dos bandas principales se amplificaron fuertemente a partir de cDNAs derivados de ARN tratado con poliphsophatasa de 5', pero no de la contraparte no tratada (Figura4A). Los resultados de la secuenciación mostraron que tenían idénticos 5' termini mientras que los extremos variables de 3'. El tamaño calculado de las dos transcripciones fue de 2.512/2.513 y 2.833-2.835 nt, respectivamente, y eran de tamaño cercano con las dos bandas más grandes detectadas en la mancha norte. Además, los resultados de cRT-PCR sugirieron que los cox2-3 y -4 tienen 5' termini primarios.
Para confirmar los resultados de la discriminación, se diseñaron cinco imprimaciones orientadas hacia el exterior de acuerdo con los resultados de la asignación cRT-PCR, es decir, qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 y qCR3, y se utilizaron los pares de imprimación qCF1&qCR1, qCF1&qCR2, qCF1&qCR3 y qCF2&qCR3 Análisis RT-qPCR de cox2-1, -2, -3 y -4, respectivamente. La abundancia relativa de los cuatro productos RT-qPCR en la muestra tratada con poliefofatasa de 5' fue mucho mayor que la de la contraparte no tratada, lo que confirma los resultados de la discriminación cRT-PCR.
En resumen, el patrón de transcripción del gen cox2 de maíz es complicado, y la estrategia basada en cRT-PCR discrimina y mapea efectivamente las múltiples isoformas de mRNA cox2.
Figura 1: Visión general de la estrategia basada en cRT-PCR. Ilustración de los principales pasos de la estrategia basada en cRT-PCR. 5'+ y 5'- - las dos muestras de ARN tratadas y no tratadas por ARN 5' polifosfatasa, respectivamente. Las dos muestras de ADC derivadas de ARN tratadas con polifosfatasa y no tratadas de 5' se normalizan mediante rRNA maduros de 26S en el maíz, y las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR. Para el gen A, el ARN correspondiente tiene un extremo primario de 5' porque la abundancia del producto PCR a partir de ARN tratado con polifosfatasa de 5' es mucho mayor que la de la contraparte no tratada; para el gen B, los productos PCR de los dos conjuntos de ARN mitocondriales se amplifican a un nivel comparable, lo que implica una terminal procesada de 5' del ARN correspondiente. La región de codificación y los UTse se representan mediante cuadros grises y líneas en negrita, respectivamente. CRT - imprimación para transcripción inversa; CF1, CF2, CR1 y CR2- Imprimaciones PCR que flanquean la unión de 5'-3' de la transcripción circular; qCF y qCR - imprimaciones divergentes para RT-qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la integridad del ARN mitocondrial por electroforesis de gel de agarosa. (A) ARN mitocondriales preparados a partir de granos de maíz 15-DAP. M - Marcador molecular de ADN. (B) Kernel ARN mitocondrial después del tratamiento por 5' polifosfatasa y/o circularización por ligasa de ARN T4. 5'+ - ARN mitocondrial después del tratamiento por 5' polifosfatasa; T4&5'+ - ARN mitocondrial después del tratamiento por 5' polifosfatasa y circularización por t4 ARN ligse; T4&5'- - ARN mitocondrial después de la circularización solamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Eficiencia de circularización de los ARNm nad5 y nad1 estimados por RT-PCRs. (A) y (D) Diagrama esquemático de genes nad5 y nad1, respectivamente. Ex exon. Los exons y los intrones se muestran como cuadros grises y líneas curvas, respectivamente. La posición de las imprimaciones de transcripción inversa RT1 y RT2 se indican mediante flechas. Los puntos negros indican la posición de las imprimaciones PCR, y se muestra el tamaño previsto de los productos PCR. sqF1, sqF2, sqR1 y sqR2 son imprimaciones para RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 y qR2 son imprimaciones para RT-qPCR. (B) y (E) Análisis RT-sqPCR de la eficiencia de circularización de nad5 y nad1 mRNAs, respectivamente. M - Marcador molecular de ADN. (C) y (F) análisis RT-qPCR de la eficiencia de circularización de nad5 y nad1 mRNAs, respectivamente. Las dos muestras de ADN inversatranscritas por imprimaciones RT1 y RT2 están normalizadas por productos PCR sqF2&sqR2 (para RT-sqPCR) o qF2&qR2 (para RT-qPCR). La eficiencia de circularización de los ARNM nad5 y nad1 se estima comparando los productos PCR de sqF1&sqR1 (para RT-sqPCR) o qF1&qR1 (para RT-qPCR). circularizado/(circularizado+lineal) a qF1&qR1 sobre qF2&qR2 en reacción RT2/ qF1&qR1 sobre qF2&qR2 en reacción RT1. Los valores son medios y SDs de tres réplicas biológicas. Para excluir la influencia potencial por trifosfato de 5o, los ARN fueron tratados por polifosfatasa de 5o antes de la auto-ligación. Total y Mito: ARN totales y mitocondriales, respectivamente. RT1 y RT2 - cDNAs inverso transcrito por imprimaciones RT1 y RT2, respectivamente Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4: Mapeo de mRNA termini maduro según el uso de la estrategia de caja cRT-PCR. (A) Separación en gel de los productos cox2 cRT-PCR. +y - - CDNAs derivados de ARN mitocondriales tratados con polifosfatasa y no tratados de 5o, respectivamente. Las dos muestras de ADNc se normalizaron por amplificación de 26S cDNA (26S). Cinco imprimaciones se utilizan para el análisis cRT-PCR de mRNA cox2 circular: CF1, CF2 y CF3 son imprimaciones anidadas, y CF2 y CF3 son 69 y 138 bp aguas abajo de CF1, respectivamente; CR1 y CR2 son imprimaciones anidadas, y CR2 es 1,288 bp aguas arriba de CR1. Las bandas indicadas por '1' y '2' fueron amplificadas por CF1&CR1 y CF2&CR1, mientras que las bandas '3' y '4' fueron amplificadas por CF3&CR2. Las cuatro bandas fueron secuenciadas por clonación. Las bandas marcadas con asteriscos no se pudieron repetir, y fueron excluidas de los resultados. M - Marcador molecular de ADN. (B) Análisis RT-qPCR de la abundancia relativa de arnm cox2 circularizado después del tratamiento de 5' polifosfatasa. Las dos muestras de ADC fueron sintetizadas por una mezcla de imprimación que contenía 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT y cox1-CRT en igual proporción, y el ADNc derivado de rRNA maduro 26S se utilizó para la normalización. +/- - cox2 sobre 26S en la muestra tratada/cox2 sobre 26S en la muestra no tratada. Los valores representan medios y SD de tres réplicas biológicas. Se indican las imprimaciones utilizadas para RT-qPCR. (C) Análisis de la mancha norte de las transcripciones de cox2. Se cargó 2 g de ARN mitocondrial. Se marcan las bandas correspondientes a diferentes isoformas de arNM maduro scox2. (D) Transcripción termini de cox2 mRNA deducido de los resultados de cRT-PCR. Los TLE y los marcos de lectura abiertos se muestran como líneas en negrita y cuadros grises, respectivamente. Se muestran las posiciones de 5' y 3' termini en relación con AUG (+1) y UAA (-1), y el número de clones individuales secuenciados en esas posiciones. Las posiciones de transcripción inversa y imprimaciones de amplificación PCR se muestran como cabezales de flecha cerrados y abiertos, respectivamente. Las imprimaciones orientadas hacia el exterior utilizadas para RT-qPCR se muestran como cuadrados abiertos, y la posición de la sonda cox2 es como se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Selección de clones positivos que contienen insertos cox2-4 por PCR de colonia. (A) COLONY PCR para detectar clones individuales que contienen inserciones cox2-4. El tamaño de cox2-4 insert es de aproximadamente 1.165 bp, y el de las secuencias vectoriales es de 100 bp. El tamaño calculado de los productos de PCR de colonia es de aproximadamente 1.265 bp, y los clones que contienen inserciones de tamaño pequeño no se secuenciaron, es decir, los números 11, 14, 22 y 23. (B) Resultados de secuenciación de los clones positivos examinados en (A). 5'/3' termina los extremos 5' y 3' en relación con AUG (+1) y UAA (-1), respectivamente. Los resultados de la secuenciación de los números 12 y 20 fueron excluidos porque eran mucho más pequeños que los demás. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Volumen para una reacción de 50 s (L) | Concentración final |
| 10x ARN 5' tampón de polifosfatasa | 5 | 1x |
| Inhibidor de la RNase (40 U/L) | 0.75 | 0,6 U/L |
| ARN mitocondrial | X | 0,2 g/L |
| ARN 5' polifosfatasa (20 U/L) | 2.5 | 1 U/L |
| H2O desionizado tratado con DEPC | a 50 l | - |
Tabla 1: Componentes de reacción del tratamiento de la polifosfatasa de ARN 5'.
| Componente | Volumen para una reacción de 20 l (L) | Concentración final |
| 10x T4 ARN ligase I buffer | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 M |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15% |
| Inhibidor del ARN (40 U/L) | 0.5 | 1 U/L |
| 5' ARN mitocondrial tratado con polifosfatasa o no tratado | X | 0,1 a 0,2 g/L |
| T4 ARN ligasa I (30 U/L) | 0.4 | 0,6 U/L |
| Deionizado tratado con DEPC H2O | a 20 l | - |
Tabla 2: Componentes de reacción de la circularización del ARN mitocondrial.
| Componente | Volumen para premezcla de 10 l (L) |
| Mezcla de imprimación (1 M en total)a | 2 |
| mezcla dNTP (10 mM cada uno) | 1 |
| ARN mitocondrial circularizado de 5' tratado con polifosfatasa o no tratadob | X |
| H2O desionizado tratado con DEPC | a 10 l |
Tabla 3: Premezcla para reacción de transcripción inversa. a La mezcla de imprimación contiene la misma proporción de 26S-CRT y hasta 7 otras imprimaciones RT, y la concentración final es de 1 M. bSe preparan dos premezclas en paralelo, y contienen la misma cantidad (200 ng) de 5' tratada con polifosfatasa circularo o ARN mitocondrial no tratado.
| Componente | Volumen para el sistema de reacción de 20 l (L) | Concentración final |
| Plantilla ARN/imprimación/dNTP* | 10 | - |
| 5x tampón RTase | 4 | 1x |
| Inhibidor de la RNase (40 U/L) | 0.5 | 1 U/L |
| RTase (200 U/L) | 1 | 10 U/L |
| Deionizado tratado con DEPC H2O | a 20 l | - |
Tabla 4: Componentes de reacción de la transcripción inversa. *Las premezclas de ARN/imprimación/dNTP de la plantilla se prepararon en el paso 6.3.
| Componente | Volumen para el sistema de reacción de 20 l (L) | Concentración final |
| Deionizado H2O | 7 | - |
| Búfer de reacción 2x | 10 | 1x |
| mezcla dNTP (10 mM cada uno) | 0.4 | 0,2 mM cada uno |
| 26S-CF1 (10 m) | 0.8 | 0,4 mM |
| 26S-CR1 (10 m) | 0.8 | 0,4 mM |
| Plantillas cDNA derivadas de ARN circularizados de 5' polifosfatasa o no tratados * | 0,6 | - |
| ADN polimerasa (1 U/L) | 0.4 | 0.02 U/L |
Tabla 5: Componentes de reacción para amplificación PCR de 26S cDNA. *Inicialmente, se utiliza el mismo volumen de cDNAs de plantilla (0,6 l) para la normalización. Si es necesario, cambie las cantidades de cDNAs de plantilla para asegurar la misma abundancia de productos de PCR 26S entre las dos reacciones pcR.
| Paso | Temperatura | hora | Número de ciclo |
| Desnaturalización inicial | 95 oC | 3 min | 1 ciclo |
| Desnaturalización | 95 oC | 15 seg | 22–25 ciclos |
| Primer recocido | 56 oC | 15 seg | |
| Extensión | 72 oC | 30 seg | |
| Extensión final | 72 oC | 5 min | 1 ciclo |
| Mantener | 4 oC | ∞ | - |
Tabla 6: Condiciones de PCR para amplificar 26S cDNA para la normalización.
| Componente | Volumen para el sistema de reacción de 20-L (L) | Concentración final |
| H2O desionizado | a 20 l | - |
| Búfer de reacción 2x | 10 | 1x |
| mezcla dNTP (10 mM cada uno) | 0.4 | 0,2 mM cada uno |
| Imprimación de avance divergente (10 m) | 0.8 | 0,4 mM |
| Imprimación-reversa divergente (10 m) | 0.8 | 0,4 mM |
| Plantilla cDNA derivada de los ARN circularizados de 5' polifosfatasa o no tratados * | X | - |
| ADN polimerasa (1 U/L) | 0.4 | 0.02 U/L |
Tabla 7: Componentes de reacción para la amplificación pcR de las transcripciones de destino circularizadas. *El volumen de los cDNA de plantilla utilizados en estas reacciones está determinado por los resultados de normalización de rRNA 26S.
| Paso | Temperatura | hora | Número de ciclo |
| Desnaturalización inicial | 95 oC | 3 min | 1 ciclo |
| Desnaturalización | 95 oC | 15 seg | 22-40 ciclos c |
| Primer recocido un | 50-65 oC | 15 seg | |
| Extensión b | 72 oC | 0.5-1 min | |
| Finatl extensión | 72 oC | 5 min | 1 ciclo |
| Mantener | 4 oC | ∞ | - |
Tabla 8: Condiciones de PCR para amplificar las transcripciones de destino. a La temperatura de recocido exacta depende de la temperatura de fusión de las imprimaciones PCR. b El tiempo de alargamiento depende de la longitud del objetivo que se va a amplificar. El tiempo recomendado es 1 min por 1 kb del fragmento DE PCR. c En general, 30 a 35 ciclos son suficientes para producir una cantidad adecuada de producto PCR. Para transcripciones de bajo contenido, aumente el número de ciclos de hasta 40 ciclos.
Figura S1: Posición de los imprimadores para transcripciones mitocondriales de maíz representativas. CRT - imprimación de transcripción inversa; CF1, CF2, CR1 y CR2 - imprimaciones divergentes para amplificación de PCR; qCF y qCR - imprimaciones divergentes para RT-qPCR. La transcripción termini de maíz nad2-1, rps4-1 y nad4-1 se han determinado previamente (Zhang et al., 20191). Se muestran las posiciones de 5'- y 3' -extremos en relación con AUG (+1) y el último nucleótido de stop codon (-1). Las regiones de codificación y los UTRAC se indican como cuadros grises y líneas en negrita, respectivamente. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura S2: Principio para estimar la eficiencia de la circularización del ARNm nad5 en el maíz. En una reacción de auto-ligación, sólo se circulará una fracción de ARN mitocondriales. Para calcular la relación de nad5 circularizado, se utilizan dos imprimaciones específicas del gen para sintetizar los CDNA de la primera hebra, es decir, nad5-RT1 y -RT2. En la reacción detranscripción inversa nad5 -RT2 (RT), los productos PCR amplificados por sqF2&sqR2 (para RT-sqPCR) y qF2&qR2 (para RT-qPCR) se derivan de nad5 lineal y circularizado, mientras que el sqF1&sqR1 (para RT-sqPCR) y qF1 Los productos de PCR &qR1 (para RT-qPCR) se derivan únicamente de nad5 circularizado; en la reacción nad5-RT1, los cuatro pares de imprimaciones PCR podrían amplificar ambas formas de nad5. Para calcular la relación entre el ARNm nad5 circularizado, las dos reacciones se normalizan mediante productos pcR sqF2&sqR2 o qF2&qR2. Al comparar la abundancia de productos de PCR sqF1&sqR1 o qF1&qR1 entre las dos reacciones RT, se estima aproximadamente la eficiencia de circularización del ARNm nad5. ex exon. Los exons y los intrones se muestran como cuadros grises y líneas curvas, respectivamente. Las posiciones de las imprimaciones nad5-RT1 y -RT2 se indican mediante flechas. Los puntos negros indican las posiciones de los imprimadores PCR, y se muestra el tamaño previsto de los productos PCR. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla S1: Información de imprimación. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
En un estudio anterior, los ARN totales y mitocondriales del cultivo de suspensión celular de Arabidopsis se utilizaron para mapear la transcripción mitocondrial termini por cRT-PCR, y se obtuvieron resultados similares12. Sin embargo, sólo el ARN mitocondrial enriquecido se utilizó para mapear la transcripción mitocondrial termini en muchos otros estudios1,2,3,9. Encontramos que el enriquecimiento de ARN mitocondrial es un paso importante para el mapeo cRT-PCR de la transcripción mitocondrial termini en el maíz. Después de este enriquecimiento, la proporción de ARN mitocondrial circularizado se incrementa dramáticamente de 0,3%-3,7% a 30% (Figura3 y Figura S2),lo que hace posible la amplificación de transcripciones de objetivos circularizados en una ronda de PCR.
La eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial se estimó mediante el análisis RT-PCR sobre el maíz nad1 y nad5,ambos divididos en precursores independientes por intrones de empalme cis. Debido a que no se pudo descartar la influencia potencial de la presencia de ARN precursores, así como la variación de la eficiencia de RT, esto es sólo una estimación aproximada de la eficiencia real de la circularización del ARN mitocondrial.
Hemos alterado las condiciones de auto-ligación alterando la concentración de ARN mitocondrial y PEG8000, así como alargando el tiempo de incubación, pero estos cambios no parecían afectar la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial. Aunque no estamos seguros de si una mayor purificación de gradiente Percoll podría aumentar la eficiencia de la circularización, la calidad de la mitocondrion bruta preparada en la sección 2 es lo suficientemente buena para el mapeo cRT-PCR de la transcripción mitocondrial termini en el maíz. Dado que varias rondas de ITP pueden causar resultados falsos positivos, la amplificación de las transcripciones de destino en una ronda de PCR hace que los resultados de la asignación sean más fiables.
El trifosfato de 5' de transcripciones primarias es inestable, y podría convertirse en monofosfato de 5' por razones desconocidas. Este problema dificulta una clara diferenciación entre las transcripciones primarias y procesadas mediante el uso de enfoques en función de la presencia/ausencia de 5' trifosfato1,2,4. La forma madura de maíz 26S rRNA tiene un extremo monofosfato de 5', y es insensible al ARN 5' polifosfatasa. Para minimizar la influencia de la triphospahte inestable de 5', el ARNm 26S maduro se utiliza para normalizar las dos muestras de ARN, tratadas y no tratadas por polifosfatasa de 5', y se ha demostrado que es un paso importante para diferenciar los dos tipos de transcripciones en maíz Mitocondria. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas podrían ser discriminadas comparando los resultados de cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos a partir de muestras de ARN tratadas con polifosfatasa y no tratadas de 5'. Las transcripciones primarias son sensibles a la polifosfatasa de 5', y se amplifican fuertemente a partir de la muestra tratada con polifosfatasa de 5', pero no (o a un nivel muy bajo debido al trifosfato inestable de 5') de la contraparte no tratada. Por el contrario, las transcripciones procesadas se detectan en niveles comparables entre las dos muestras.
En las plantas, los patrones de transcripción de muchos genes mitocondriales son bastante complicados1,2. Por ejemplo, los genes nad6 y atp6 de maíz se expresan como monocistrones y dicistrones, y losARN 6, atp6y atp6-na6 maduros tienen dos, tres y dos isoformas, respectivamente. Además, la población de transcripción de un gen mitocondrial es en realidad una mezcla de ARN precursores, maduros y de degradación. Los PCR son propensos a amplificar moléculas de tamaño pequeño, y es difícil detectar todos los isoformas de transcripción usando un par de imprimaciones. Por lo tanto, se requiere la hibridación de la mancha de gel de ARN para verificar los resultados de la asignación cRT-PCR, y pueden ser necesarios imprimaciones alternativas para amplificar las transcripciones detectadas en Northern blot, pero no por primera vez cRT-PCR.
Este protocolo incluye un paso RT-qPCR para verificar los resultados de la discriminación cRT-PCR. Debido a que las múltiples isoformas dealgunos ARNM maduros son muy cercanas en el tamaño 1, es imposible confirmar todos los resultados de discriminación por RT-qPCR, y algunas transcripciones de estado estacionario se determinaron comparando los resultados de cRT-PCR entre los tratados y ARN no tratados solamente.
En este protocolo, los 5' y 3' termini de las transcripciones de destino se asignaron mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y limita el número de clones individuales que se van a secuenciar. Como método alternativo, los productos cRT-PCR podrían ser secuenciados por secuenciación de próxima generación, que secuencia miles de moléculas para un conjunto de transcripciones de estado estacionario, y los resultados de mapeo serían más precisos.
Además de la discriminación de primaria y procesada 5' termini por cRT-PCR y RT-qPCR, elmonofosfato 5' termini podría determinarse mediante la identificación de las estructuras secundarias de ARN circundantes 1,12. Es bien sabido que las estructuras secundarias de ARN como el tRNA y el elemento t podrían mediar en la formación de la transcripción mitocondrial dirigiendo las escotes endoucleólíticas de RNase P y/o RNase Z12,18,19, 20. Por lo tanto, esos 5' termini adyacentes a tRNA o t-elemento deben derivarse del procesamiento post-transcripción y contener monofosfatos.
Mediante el uso de este protocolo, una gran parte de las transcripciones de estado estacionario se han determinado en las mitocondrias de maíz1. Sin embargo, algunos no fueron diferenciados y/o mapeados por razón desconocida1. Además, creemos que la posición de 5' transcripción termini es mejor para ser confirmado por el análisis de extensión de imprimación, aunque está incluido en este protocolo. Debido a la falta de datos experimentales, no estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para otras especies vegetales, como el arroz (Oryza sativa) y Arabidopsis. Además de las mitocondrias vegetales, las transcripciones primarias y procesadas se acumulan de forma estable en los plastoides21,y no se sabe si esta estrategia podría utilizarse para mapear y discriminar transcripciones de plastoides.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (concesión no 31600250, Y.Z.), Proyectos de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Guangzhou (concesión no 201804020015, H.N.) y el Sistema de Investigación Agrícola de China (concesión no. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
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