Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi

Published: July 29, 2019 doi: 10.3791/60019
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

Summary

Vi presenterar en cirkulär RT-PCR-baserad strategi genom att kombinera cirkulär RT-PCR, kvantitativ RT-PCR, RNA 5 ' polyfosfatasbehandling, och Northern blot. Detta protokoll innehåller ett normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ' trifosfat, och det är lämpligt för att diskriminera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokondrier.

Abstract

I växternas mitokondrier har vissa steady-state-avskrifter 5 ' trifosfat som härrör från initiering av transkription (primära transkriptioner), medan de andra innehåller 5 ' monofosfat genererade post-transkriptionellt (bearbetade utskrifter). Att diskriminera mellan de två typerna av utskrifter, flera strategier har utvecklats, och de flesta av dem är beroende av närvaro/frånvaro av 5 ' trifosfat. Trifosfat i primär 5 ' Termini är dock instabilt, och det hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter. För att systematiskt differentiera och kartlägga de primära och bearbetade transkriptioner stabilt ackumulerade i majs mitokonskernas, har vi utvecklat en cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)-baserad strategi genom att kombinera cRT-PCR, RNA 5 "polyphoshpatase behandling, kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) och Northern blot. Som en förbättring, inkluderar denna strategi ett RNA normaliserings steg för att minimera påverkan av instabil 5 ' trifosfat.

I detta protokoll är det berikade mitokondriella RNA förbehandlat med RNA 5 ' polyfosfatas, som omvandlar 5 ' triphsophate till monofosfat. Efter circularization och omvänd Transkription, de två cDNAs som härrör från 5 ' polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av majs 26S mogna rRNA, som har en bearbetad 5 ' och är okänslig för 5 ' polyfosfatas. Efter normalisering diskrimineras de primära och bearbetade transkripterna genom att jämföra cRT-PCR-och RT-qPCR-produkter som erhålls från den behandlade och icke-behandlade RNAs. Avskriften Termini bestäms genom kloning och sekvensering av cRT-PCR-produkterna och verifieras sedan av Northern blot.

Genom att använda denna strategi har de flesta steady-state avskrifter i majs mitokon På grund av den komplicerade avskrift mönstret av vissa mitokondriella gener, några steady-state avskrifter inte differentieras och/eller kartläggas, även om de upptäcktes i en nordlig blot. Vi är inte säkra på om denna strategi är lämplig att diskriminera och kartlägga steady-state-avskrifter i andra växters mitokona eller i plastids.

Introduction

I växternas mitokonliker ackumuleras många mogna och föregångare rnas som flera isoformer, och de steady-state avskrifter kan delas in i två grupper baserat på skillnaden vid deras 5 ' slutar1,2,3, 4. De primära transkriptioner har 5 ' trifosfat ändar, som härrör från transkription initiering. Däremot har de bearbetade transkripterna 5 ' monofosfat som genererats genom post-transkriptionell bearbetning. Diskriminering och kartläggning av de två typerna av utskrifter är viktigt att riva upp de molekylära mekanismerna bakom transkription och avskrift mognad.

För att skilja mellan de primära och bearbetade transkriptioner i växternas mitokonbener har fyra viktiga strategier utvecklats. Den första strategin är att förbehandla den mitokondriella RNAs med tobaks syra pyrofosfatas (TAP), som omvandlar 5 ' trifosfat till monofosfat och gör det möjligt för primära avskrifter att cirkulariseras av RNA Ligase. Avskriften överflöd av Tap-behandlade och icke-behandlade RNA-prover jämförs sedan med snabb förstärkning av cDNA ändar (Race) eller cirkulär RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. I den andra strategin utarmas bearbetade utskrifter för det första från mitokondriell rnas med Terminator 5 '-fosfat beroende exonukleas (tex), och de primära avskrifter som lämnas sedan kartläggs med primer-förlängningsanalys5,6 . Den tredje strategin är att pre-Cap de primära avskrifter med guanylyl transferase, och sedan positionen av trifosfated 5 ' Termini bestäms av primer förlängning tillsammans med ribonukleas eller S1 Nuclease Protection Analysis7,8 ,9. Skiljer sig från de beroende på närvaron/frånvaron av 5 ' trifosfat, den fjärde strategin kombinerar in vitro-transkription, platsriktade mutagenes, och primer förlängnings analys för att karakterisera den förmodade initiativtagarna och bestämma transkription initiering platser8,10,11. Genom att använda dessa strategier har många primära och bearbetade avskrifter fastställts i växternas mitokona.

Emellertid, flera studier har rapporterat att 5 ' trifosfat av primära utskrifter var instabila, och de var lätt omvandlas till monofosfat av okänd anledning2,4,12,13. Detta problem hindrar en tydlig diskriminering av de två typerna av utskrifter genom att använda tekniker beroende på förekomst/frånvaro av 5 ' trifosfat, och tidigare ansträngningar för att systematiskt diskriminera mellan de primära och bearbetade avskrifter i växt mitokonbruen misslyckades2,12.

I detta protokoll kombinerar vi cRT-PCR, RNA 5 "polyfosfatasbehandling, RT-qPCR och Northern blot för att systematiskt särskilja de primära och bearbetade transkriptioner som stabilt ackumuleras i majs (Zea mays) Mitokonskernas (figur 1). cRT-PCR möjliggör samtidig kartläggning av 5 ' och 3 ' extremiteter av en RNA-molekyl, och den är oftast anpassad för att kartlägga avskrift Termini i växterna2,12,14,15. RNA 5 ' polyfosfatas kan ta bort två fosfater från trifosfated 5 ' Termini, vilket gör de primära avskrifter tillgängliga för själv-ligering av RNA Ligase. Tidigare studier visade att mogna 26S rRNA i majs hade bearbetat 5 ' Terminus, och det var okänsligt för RNA 5 ' polyfosfatas1,16. För att minimera påverkan av instabila trifosfat vid primär 5 ' Termini, den 5 ' polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade RNAs normaliseras av mogna 26S rRNA, och de primära och bearbetade utskrifter differentieras sedan genom att jämföra cRT-PCR-produkter som erhålls från de två RNA-proverna. CRT-PCR kartläggning och diskriminering resultat verifieras av Northern blot och RT-qPCR, respektive. Slutligen används alternativa primers för att förstärka de avskrifter som upptäckts i norra blot men inte av cRT-PCR. Genom att använda denna cRT-PCR-baserade strategi har de flesta steady-state-avskrifter i mitokonskbaserad majs differentierats och kartlagts1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. primer design

  1. Designa genspecifika primers för omvänd Transkription (RT) med hjälp av PCR primer Design Software (tabell över material) baserat på de allmänna reglerna för primer design17.
    Anmärkning: RT primers är mycket specifika för mål avskrifter, och de är i allmänhet förankrade på 5 ' del av kodning sekvenser (mogna mRNAs och föregångare RNAs), eller ~ 500 till 600 NT nedströms den förväntade 5 ' End (18S och 26S rRNAs).
  2. Design par avvikande primers att förstärka de cirkulariserade utskrifter av cRT-PCR.
    Anmärkning: de parade avvikande primers flanera 5 '-3 ' korsningen av de cirkulariserade avskrifter, och deras positioner varierar mellan de mål avskrifter analyseras (figur S1). Vissa utskrifter har långa utr; till exempel nad2-1 5 "UTR och rps4-1 3" UTR är 1 985 och 1826/1834 NT, respektive1. Om båda primers är förankrade på kodning region, kommer det att bli svårt att förstärka de mål avskrifter. Vissa utr är däremot korta. till exempel är 3 ' UTRs av nad2-1 och nad4-1 34/35 och 29-31 NT, respektive1. Om de parade primers är placerade långt bort från kodning sekvenser, kommer PCR misslyckas. I allmänhet är två par avvikande primers utformade för varje mål avskrifter, medan flera par kan vara nödvändigt att kartlägga de vars avskrift mönster är komplicerade och/eller utr är mycket långa.
  3. Design par konvergent primers att förbereda RNA sonder för Northern blot.
    Anmärkning: De parade primers är placerade på kodnings området av målgenen, och storleken på PCR-produkten bör vara i intervallet 100 till 1 000 BP. Varje framåt primer bör innehålla en begränsning enzym plats för att minimera vektor sekvenser i de resulterande sonderna.

2. beredning av rå Mitokonding från majs som utvecklar kärnor

  1. Sterilisera pestles, murbruk, glas trattar, rör och tips av autoklav, och torka dem i ugnen.
  2. Utför alla procedurer vid 4 ° c eller på is, och pre-cool alla lösningar.
  3. Förbered 100 ml extraktion buffert (EB), sammansatt av 0,3 M sackaros, 5 mm tetranatrium pyrofosfat, 10 mm KH2Po4, 2 mm EDTA, 1% [w/v] polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] bovint serum albumin, 5 mm L-cystein, och 20 mm askorbinsyra. Justera till pH 7,3 med KOH och sterilisera genom filtrering.
  4. Bered 100 mL tvättbuffert (WB) bestående av 0,3 M sackaros, 1 mM EGTA och 10 mM moppar (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid). Justera till pH 7,2 med NaOH och sterilisera genom filtrering.
    Anmärkning: Det föreslås att förbereda EB och WB med hjälp av DEPC-behandlade avjoniserat H2O.
  5. Samla 20 g utveckla kärnor vid 11 – 20 dagar efter pollinering (DAP) till en 50-mL tub placerad på is, och sedan överföra kärnor till förkylda murbruk.
    Anmärkning: Använd ett förhållande på 100 mL EB till 20 g majskärnor.
  6. Tillsätt 10 – 20 mL iskall EB till varje murbruk och slipa kärnorna helt.
  7. Tillsätt mer EB, och filtrera marken vävnader genom två lager av filterduk (tabell över material).
  8. Centrifugera filtratet vid 8 000 x g i 10 minuter och kassera pelleten.
  9. Överför supernatanten till ett nytt rör, och centrifugera den på 20 000 x g i 10 min.
  10. Häll av supernatanten, och Omsuspendera pelleten i 6 mL WB.
  11. Aliquot suspensionen till fem 1,5 mL RNase-fria rör, och centrifugera dem på 14 000 x g i 5 min.
  12. Kassera supernatanten, frys den mitokondriella pelleten i flytande kväve och förvara vid-80 ° c.

3. extraktion av mitokondriellt RNA

  1. Extrahera mitokondriellt RNA med en kommersiell reagens (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
    Försiktighet: Denna reagens innehåller fenol och guanidinisotiocyanat. Arbeta med den i en draghuv och Använd labbrock och handskar.
  2. Lös det isolerade mitokondriella RNA i DEPC-behandlade avjoniserat H2O och uppskatta RNA-koncentration och renhet med en spektrofotometer (tabell över material).
    Anmärkning: Generellt, ~ 250 μg mitokondriellt RNA erhålls från 20 g 15-DAP majs kärnor.
  3. Förbered en Agros gel bestående av 1x TAE buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra, 1mM EDTA), 1,5% Agreste (tabell över material), och 1x kärn färgning färgämne (tabell över material).
  4. Tillsätt en lämplig volym 10X lastbuffert (0,5% bromfenolblått, 0,5% xylen cyanol FF, och 50% glycerol), och ladda mitokondriell RNA/lastning buffert blandningen på 1,5% aguppstod gel.
  5. Kör gelen i 1x TAE buffert vid 5 – 6 V/cm för 20 – 25 min, och utvärdera mitokondrie RNA integritet genom avbildning av gelen med en gel dokumentationssystem (tabell över material).
    Anmärkning: Närvaron av två distinkta band (~ 3 510 och ~ 1 970 NT för majs mitokondrie 26S och 18S rRNAs, respektive) är en godtagbar standard för intakt mitokondriellt RNA. För att utesluta eventuell nedbrytning, bör RNA-integritet undersökas under flera steg i cirkulariserat RNA-preparat (figur 2).

4. RNA 5 " Polyfosfatasbehandling

  1. Ställ in RNA 5 ' polyfosfatas (tabell och material) behandling (tabell 1), och inkubera vid 37 ° c i 30 – 60 min.
  2. Återvinna 5 ' polyfosfatas-behandlat RNA med ett RNA rening Kit (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
  3. Upprepa steg 3,3 till 3,5.

5. RNA-Cirkularisering

  1. Bered två cirkulariserings reaktioner med samma mängder av 5 "polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade mitokondriella RNAs (tabell 2), och inkubera båda reaktionerna vid 16 ° c i 12 – 16 timmar.
  2. Återställ de två uppsättningarna med självligade RNAs med samma kit som i steg 4,2.
    Anmärkning: Det bör noteras att endast en bråkdel av mitokondriella RNA kommer att vara självligated, och den återvunna RNA kommer att vara en blandning av linjära och cirkulariserade utskrifter.
  3. Upprepa steg 3,3 till 3,5.

6. omvänd Transkription

  1. Syntetisera två uppsättningar av cDNAs från samma mängder av circularized 5 ' polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNAs (200 ng).
  2. Förbered en primer-blandning genom att lägga till ett lika förhållande på 26S-CRT och upp till 7 andra RT primers.
    Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av primer blandningen bör vara 1 μM.
  3. Förbered två för blandningar genom att kombinera de reagens som anges i tabell 3, inkubera vid 65 ° c i 5 min, och sedan kyla på is i 2 min.
  4. Montera två RT reaktionssystem (tabell 4), och inkubera dem vid 42 ° c för 50 min.
  5. Värm båda RT reaktioner vid 70 ° c i 5 min, och sedan kyla dem på is.

7. normalisering

  1. Förbered två PCR-reaktioner genom att lägga till samma volym av mallcdnas som härleds från 5 ' polyfosfatasbehandlade eller icke-behandlade RNAs, avvikande primers som fladderar 5 '-3 ' korsningen av cirkulär 26S rRNA (dvs. 26S-CF1 och-CR1), etc. (tabell 5).
  2. Kör de två reaktionerna i en termisk apparat (tabell över material) under de förhållanden som beskrivs i tabell 6.
  3. Förbered en aguppstod gel består av 1x TAE buffert, 1,0% Agreste, och 1x nukleär färgning färgämne.
  4. Tillsätt 2 μL 10X lastbuffert (0,5% bromfenolblått, 0,5% xylen cyanol FF och 50% glycerol) till var och en av de två PCR-produkterna och lasta dem på gelen.
  5. Kör gelen i 1x TAE buffert på 5 – 6 V/cm för 30 – 40 min, och bild den med samma gel dokumentationssystem som steg 3,5.
  6. Jämför överflödet av de två PCR-produkterna med hjälp av datorprogram (tabell över material, figur 4a) och optimera normaliseringen genom att ändra mängden mallcdnas om det behövs.

8. PCR-amplifiering

  1. Förbered par av PCR-reaktioner genom att tillsätta lämplig volym av den normaliserade cDNAs och ett par avvikande primers som fladderar 5 '-3 ' korsning av mål avskrifter (tabell 7).
    Anmärkning: Mängden mallcdnas som används för PCR-förstärkning av mål avskrifter bestäms av 26S rRNA normaliserings resultat.
  2. Utför PCR-reaktionerna enligt det program som beskrivs i tabell 8.
  3. Upprepa steg 7,3 till 7,5.
  4. Ändra till kapslade avvikande primers och kontrollera den första omgången PCR-resultat genom att upprepa steg 8,1 och 8,2.
  5. Upprepa steg 7,3 till 7,5.
  6. Återvinna de framstående band som kan upprepas i två omgångar av PCR amplifiering med hjälp av en gel DNA Recovery Kit (tabell över material).

9. bestämning av avskrift Termini

  1. Klona gel-renade PCR-produkter till en trubbig-end vektor (tabell över material) med hjälp av standardtekniker.
  2. Utför Colony PCR för att välja positiva kloner som innehåller mål insatserna och ordna dem kommersiellt.
    Anmärkning: Positiva kloner som innehåller skär med varierande storlek upptäcks vanligtvis från en enda återvunnet band eftersom många steady-state avskrifter i växternas mitokondriella har heterogena 5 ' och/eller 3 ' slutar1,12.
  3. Justera sekvenserings data med majs-mitokondriellt genom att använda grundläggande Local Alignment search Tool (BLAST) från National Center for Biotechnology information (NCBI). Välj organism "majs (taxid: 4577)", och sökdatabas "nucleotide Collection (nr/NT)".
  4. Hitta 5 '-3 ' korsningen av den circularized avskriften, och bestämma positionerna för 5 ' och 3 ' avskrift Termini.
  5. Beräkna storleken på mål avskrifter.

10. verifiering av cRT-PCR-mappning resultat av RNA gel blot hybridisering

Anmärkning: RNA gel blot hybridisering utförs med hjälp av en kommersiell Kit (tabell över material), som innehåller reagenser för transkription-märkning av RNA med digoxigenin (gräva) och T7 RNA-polymeras, hybridisering, och immunologisk detektion. Se de protokoll som finns i detta kit för mer information. Se till att endast RNase fri utrustning används för hela förfarandet.

  1. Förstärka DNA-fragment som används för att förbereda RNA-sond, och klona den till samma vektor som i steg 9,1, som innehåller en T7 promotor 17 BP uppströms insättningsstället.
  2. Linearize konstruktionen med rätt begränsning enzym, återvinna linearized Plasmid av en DNA rening Kit (tabell över material), och lösa upp den i DEPC-behandlade avjoniserat H2O.
  3. Label RNA sonder med gräva-11-UTP av en kommersiell sats (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Förbered 500 mL av 10X MOPS buffert (0,2 M moppar, 50 mM natriumacetat, och 10 mM EDTA) med DEPC-behandlade avjoniserat H2O. Justera till pH 7,0 av NaOH, och sterilisera genom filtrering.
  5. Tillsätt 2 – 3 volymer lastbuffert (50% formamid, 6,2% formaldehyd, 1x MOPS, 10% glycerol och 0,1% bromfenolblått) till det mitokondriella RNA som bereds i steg 3.1 – 3.3.
  6. Denaturera RNA provet/lastning buffert blandningen vid 65 ° c för 10 min, och sedan kyla på is för 1 min.
  7. Förbered en denaturerad Agros gel (2% formaldehyd, 1,2% Agreste och 1x MOPS) och ladda RNA-provet/lastbuffertblandningen till gelen (1 – 2 μg mitokondriellt RNA per brunn).
  8. Kör gelen i 1x moppar vid 3 – 4 V/cm för ~ 4 h.
  9. Bered 2 L 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat, pH 7,0). Behandla det med 0,1% DEPC över natten, och sterilisera med autoklav.
  10. Skölj gelen två gånger i 20x SSC (15 min varje gång), och överföra gel RNA till ett nylonmembran (tabell över material) genom kapillär överföring med 20x SSC för 10 – 16 h.
  11. Fixera RNA till membran genom att baka vid 120 ° c i 30 min.
  12. Utför RNA-hybridisering och immunologisk detektion med ett kommersiellt Kit (tabell över material) enligt tillverkarens anvisningar.

11. diskriminering av primära och bearbetade 5 "slutar

  1. Diskriminera de primära och bearbetade 5 ' ändarna genom att jämföra de cRT-PCR-produkter som erhålls från den normaliserade 5 ' polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNAs.
    Anmärkning: För primär utskrifter är överflödet av PCR-produkter från 5 "polyfosfatasbehandlat RNA mycket högre än det från icke-behandlad motsvarighet (figur 1," gen A "och figur 4a). För bearbetade utskrifter skulle emellertid en jämförbar nivå av PCR-produkter förstärkas från de två uppsättningarna av mitokondriell RNAs (figur 1, "gen B").
  2. Design RT-qPCR primers baserat på cRT-PCR-mappning resultat.
  3. Kontrollera diskrimineringen av cRT-PCR-resultat med RT-qPCR.
    Anmärkning: De två cDNA-proverna som härrör från 5 ' polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNAs-produkter normaliseras av RT-qPCR-produkterna från 26S mogna rRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uppskattning av mitokondriell RNA circularization effektivitet

I en tidigare studie, både totala och mitokondriella RNAs användes för cRT-PCR-mappning av mitokondriell avskrift Termini i Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), och de två typerna av rnas gav liknande kartläggning resultat12. Initialt använde vi också total RNAs för cRT-PCR-mappning av mitokondriell avskrift Termini i majs. Efter många prövningar fann vi att målet utskrifter var svåra att upptäcka. Som en förbättring berikade vi det mitokondriella RNA från majs som utvecklade kärnor, och det gjorde förstärkningen av de cirkulariserade mål avskrifter i en omgång PCR möjligt.

För att förklara den enkla amplifiering av mål utskrifter efter berikningen, vi uppskattade RNA circularization effektivitet genom att utföra RT-PCRs på representativa mitokondriell Gene nad5 (figur 3 och figur S2). Majs nad5 genen innehåller två trans-och två CIS-skarvning introner. Efter själv-ligation av total och mitokondriell RNAs var första strand cDNAs självständigt syntetiseras med hjälp av nad5-RT1 och-filen RT2 primers. De två primers kunde vända transkribera både linjär och circularized nad5 mrnas (figur S2). Fyra par konvergent primers används för PCR amplifiering: sqF1 & sqR1 och sqF2 & sqR2 för semi-kvantitativ RT-PCR (RT-sqPCR) och qF1 & qR1 och qF2 & qR2 för RT-qPCR. För cDNAs transkriberas av nad5-RT1, alla fyra par primers upptäcktes både circularized och linjär Nad5 mogen mrnas; för nad5-filen RT2 omvänd Transkription reaktion, SqF2 & SqR2 och QF2 & qR2 tillfrågade båda formerna av mRNA, medan SqF1 & SqR1 och QF1 & qR1 PCR-produkter härrör från circularized nad5 endast. Baserat på denna analys använde vi sqF2 & sqR2 (för RT-sqPCR) och qF2 & qR2 (för RT-qPCR) PCR-produkter för att normalisera nad5-RT1 och-filen RT2 omvänd Transkription reaktioner, och uppskattade förhållandet mellan cirkulariserade nad5 genom att jämföra sqF1 & sqR1 (för RT-sqPCR) eller qF1 & qR1 (för RT-qPCR) PCR-produkter. Innan själv-ligation, var RNAs förbehandlade med RNA 5 ' polyfosfatas att göra alla avskrifter tillgängliga för circularization av RNA Ligase. RT-sqPCR-analysen visade en mycket liten del av nad5 mRNA var cirkulariserat när totalt RNA användes, men kvoten ökades dramatiskt när det anrikade mitokondriella RNA användes (figur 3b). RT-qPCR-resultat visade att förhållandet mellan självligade nad5 mRNA ökade från 3,7% till 32% efter anrikningen (figur 3c). Analys av nad1 gav liknande resultat, och circularization effektivitet nad1 mRNA ökade från 0,7% till 30% (figur 3D-F).

Per dessa analyser, ca 30% majs mitokondriell RNAs var självligated efter förbättringen, och den ökade circularization effektivitet förklarar lätt detektering av målet utskrifter av cRT-PCR.

Bestämning av majs COX2 mRNA Termini använda cRT-PCR-baserad strategi

Vi använde COX2 -genen som ett exempel för att införa kartläggning och diskriminering av majs mitokondriella utskrifter genom att använda den CRT-PCR-baserade strategin (figur 4).

I början av kartläggningen COX2 mRNA, tre utåtriktade PRIMERS CF1, CF2, och cr1 utformades på genen kodning regionen (figur 4D). CF1 och CF2 var kapslade primers, och CF2 var 69 BP nedströms CF1. Använda mallen cdnas syntetiseras i steg 6.1 – 6.5 och normaliserade i steg 7.1 – 7.6, den CF1 & cr1 primer par förstärks två framstående band, och förstärknings resultaten upprepades av kapslade primers CF2 & cr1 (figur 4a). Dessutom var de två banden starkt förstärks från 5 ' polyphsophatase-behandlade RNA, medan de var svåra att upptäcka i den icke-behandlade motsvarigheten, vilket tyder på att de är känsliga för RNA 5 ' polyphsophatase och har primär 5 ' Termini.

De två kandidat banden fick namnet COX2-1 och-2, och de återfanns oberoende av agaros gel och klonade till vektorer. Colony PCR-resultat visade att de positiva klonerna innehåller skär med varierande storlek, vilket innebär heterogena 5 ' och/eller 3 ' Termini i avskrifter (figur 5). De positiva klonerna sekvenserades kommersiellt, och sekvenserings data anpassades till det mitokondriella genomet i majs enligt beskrivningen i steg 9,3.

Sekvensering och justering resultat visade att de två avskrifter var identiska vid 3 ' ändar, men olika i längden på 5 ' utr (figur 4D). Den 5 ' ändarna av COX2-1 och-2 var berikat på 992-1030 och 1276-1283 NT UPSTREAM av augusti, respectively, fördriva tiden deras 3 ' var 39 NT nedströms om stopp kodon. Från cRT-PCR-resultaten var de beräknade storlekarna COX2-1 och-2 1804 – 1832 respektive 2088 – 2095 NT.

För att kontrollera resultaten av cRT-PCR-mappning utfördes RNA gel blot-hybridisering med hjälp av sonden från COX2 gen kodnings region, och två större band med liknande storlek som COX2-1 och-2 upptäcktes (figur 4c). Dessutom upptäcktes två större band om 2 500 och 2 800 NT i norra blot, men de förstärkallades inte av cRT-PCR. De två större banden namngavs som COX2-3 respektive-4. För att kartlägga dem, var en annan två utåtriktade primers (dvs. CR2 och CF3), förankrade på 5 ' och 3 ' ut i COX2-2, konstruerade, och deras positioner var nära den förväntade avskriften slutar av COX2-3 och-4. Med hjälp av primer-paret CF3 & CR2, förstärknings två stora band starkt från cDNAs som härrör från 5 ' polyphsophatase-behandlat RNA men inte från den icke-behandlade motsvarigheten (figur 4a). Sekvenserings resultaten visade att de hade identiska 5 ' Termini medan variabeln 3 ' slutar. Den beräknade storleken på de två avskrifter var 2512/2513 och 2833-2835 NT, respektive, och de var nära i storlek med de två större banden upptäcktes i norra blot. Dessutom föreslog cRT-PCR-resultaten att cox2-3 och-4 har primär 5 ' Termini.

För att bekräfta diskriminerings resultaten utformades fem grundfärger för utåt enligt cRT-PCR-resultaten, d.v.s. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 och qCR3, och primer-paren qCF1 & qCR1, qCF1 & qCR2, qCF1 & qCR3 och qCF2 & qCR3 användes för RT-qPCR-analys av COX2-1,-2,-3 respektive-4. Det relativa överflödet av alla fyra RT-qPCR-produkter i 5 ' Polyfoniskt behandlat prov var mycket högre än de i den icke-behandlade motsvarigheten, vilket bekräftar diskriminerings resultaten från cRT-PCR.

Sammanfattnings, avskrift mönstret av majs COX2 gen är komplicerat, och CRT-PCR-baserade strategi diskriminerar effektivt och kartor flera isoformer av COX2 mRNA.

Figure 1
Figur 1: översikt över den cRT-PCR-baserade strategin. Illustration av de viktigaste stegen i den cRT-PCR-baserade strategin. 5 ' + och 5 '-= de två RNA-proverna behandlade och icke-behandlade med RNA 5 ' polyfosfatas, respektive. De två cDNA-proverna som härrör från 5 "polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNAs" normaliseras av 26S mogna rRNA i majs, och de primära och bearbetade transkripterna diskrimineras genom att jämföra cRT-PCR-produkterna. För gen A har motsvarande RNA en primär 5-', eftersom PCR-produktens överflöd från 5 ' polyfosfatasbehandlat RNA är mycket högre än det från den icke-behandlade motsvarigheten. för gen B förstärks PCR-produkterna från de två uppsättningarna av mitokondriella RNAs på en jämförbar nivå, vilket innebär en bearbetad 5 ' ändstationen av motsvarande RNA. Den kodnings region och utr representeras av grå rutan och fet linjer, respektive. CRT = primer för omvänd Transkription; CF1, CF2, CR1, och CR2 = PCR-primers som flörar 5 '-3 ' korsningen av den circularized avskriften; qCF och qCR = avvikande primers för RT-qPCR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: utvärdering av mitokondriell RNA-integritet genom agaros gel-elektrofores. A) mitokondriell RNAssomframställts från 15-DAP majskärnor. M = DNA molekylära markör. (B) kärnmitokondrie RNA efter behandling med 5 ' polyfosfatas och/eller cirkularisering av T4 RNA Ligase. 5 ' + = mitokondriellt RNA efter behandling med 5 ' polyfosfatas; T4 & 5 ' + = mitokondriellt RNA efter behandling med 5 ' polyfosfatas och cirkularisering av T4 RNA Ligase; T4 & 5 '-= mitokondriellt RNA efter circularization endast. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Cirkulariserings effektivitet hos nad5 och nad1 MRNAS som uppskattas av RT-PCRS. (A) och (D) Schematiskt diagram över nad5 respektive nad1 gener. Ex = exon. Exoner och introner visas som grå rutor respektive böjda linjer. Positionen för omvänd Transkription primers RT1 och filen RT2 indikeras med pilar. Svarta prickar anger positionen för PCR-primers och den förväntade storleken på PCR-produkterna visas. sqF1, sqF2, sqR1 och sqR2 är primers för RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 och qR2 är primers för RT-qPCR. B) och (E) RT-sqpcr-analys av cirkulariserings effektiviteten hos nad5 respektive nad1 mrnas. M = DNA molekylära markör. (C) och (F) RT-qPCR-analys av cirkulariserings effektiviteten hos nad5 respektive nad1 mrnas. De två cDNA-exemplen omvänt transkriberas av RT1 och filen RT2 primers normaliseras av sqF2 & sqR2 (för RT-sqPCR) eller qF2 & qR2 (för RT-qPCR) PCR-produkter. Den circularization effektiviteten av nad5 och nad1 mrnas uppskattas, genom att jämföra PCR-produkterna av sqF1 & sqR1 (för RT-sqpcr) eller qF1 & qR1 (för RT-qPCR). circularized/(cirkulär + linjär) = qF1 & qR1 över qF2 & qR2 i filen RT2 reaktion/qF1 & qR1 över qF2 & qR2 i RT1 reaktion. Värden är medel och SDs av tre biologiska replikat. För att utesluta den potentiella påverkan av 5 ′ trifosfat, RNAs behandlades med 5 ′ polyfosfatas före själv-ligation. Totalt och Mito = total respektive mitokondriell RNAs. RT1 och filen RT2 = cDNAs omvänd transkriberas av RT1 och filen RT2 primers, respektive vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: mappning av COX2 mature mRNA Termini med hjälp av strategin CRT-PCR-kapslade. A) gel separation av COX2 cRT-PCR-produkter. + och-= cDNAs härrör från 5 ′ polyfosfatas-behandlade och icke-behandlade mitokondriell RNAs, respektive. De två cDNA-proverna normaliserades genom amplifiering av 26S cDNA (26S). Fem primers används för cRT-PCR analys av circularized COX2 mRNA: CF1, CF2, och CF3 är kapslade primers, och CF2 och CF3 är 69 och 138 BP nedströms CF1, respektive; CR1 och CR2 är kapslade primers och CR2 är 1 288 BP uppströms CR1. De band som anges med "1" och "2" förstärkallades av både CF1 & CR1 och CF2 & CR1, medan "3" och "4" band förstärkallades av CF3 & CR2. Alla fyra av banden var sekvenserade av kloning. Banden markerade med asterisker kunde inte upprepas, och de exkluderades från resultaten. M = DNA molekylära markör. B) RT-qPCR-analys av det relativa överflödet av cirkulariserat COX2 mRNA efter 5 ' polyfosfatasbehandling. De två cDNA-proverna syntetiserades av en primer-blandning innehållande 26S-CRT, COX2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, COB-CRT och COX1-CRT vid lika förhållande, och cDNA som härstammar från 26S mogna rRNA användes för normalisering. +/-= COX2 över 26S i behandlat prov/Cox2 över 26S i obehandlat prov. Värden representerar medel och SD av tre biologiska replikat. Primers som används för RT-qPCR indikeras. C) analys av COX2 -utskrifter av Northern blot. 2 μg mitokondriellt RNA lästes in. Banden som motsvarar olika isoformer av COX2 mogna mRNA är markerade. (D) Avskrift Termini av COX2 mRNA härledas från cRT-PCR resultat. Utr och öppna Läs ramar visas som djärva linjer och grå rutor respektive. Positionerna för 5 ' och 3 ' Termini i förhållande till AUG (+ 1) och UAA (-1), och antalet enstaka kloner sekvenserade på dessa positioner visas. Positionerna för omvänd Transkription och PCR förstärkning primers visas som stängda och öppna pilhuvuden, respektive. Utåtriktade primrar som används för RT-qPCR visas som öppna kvadrater, och positionen för COX2 sond är som anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: val av positiva kloner som innehåller COX2-4-skär av Colony PCR. A) kolonin PCR för att avskärma enstaka kloner som innehåller COX2-4-skär. Storleken på COX2-4 insatsen är ca 1 165 BP, och att av vektorn sekvenser är 100 BP. Den beräknade storleken på kolonin PCR-produkter är ca 1 265 BP, och de kloner som innehåller små skär var inte sekvenserade, dvs nummer 11, 14, 22 och 23. Bsekvensering av resultaten av de positiva kloner som screenas i a. 5 '/3 ' ändar = 5 ' och 3 ' ändarna i förhållande till AUG (+ 1) respektive UAA (-1). Sekvenserings resultaten av siffrorna 12 och 20 exkluderades eftersom de var mycket mindre än de andra. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Komponent Volym för 50 μL reaktion (μL) Slutliga koncentrationen
10X RNA 5 ' polyfosfatasbuffert 5 1x
Rnashämmare (40 U/μL) 0,75 0,6 U/μL
Mitokondriellt RNA X 0,2 μg/μL
RNA 5 ' polyfosfatas (20 U/μL) 2,5 1 U/μL
DEPC-behandlade avjoniserat H2O till 50 μL -

Tabell 1: reaktions komponenter för RNA 5 "polyfosfatasbehandling.

Komponent Volym för 20 μL reaktion (μL) Slutliga koncentrationen
10X T4 RNA Ligase I buffert 2 1x
dATP (1 mM) 1 50 μM
PEG8000 (50%) 6 15
RNA-hämmare (40 U/μL) 0,5 1 U/μL
5 ' polyfosfatasbehandlat eller icke-behandlat mitokondriellt RNA X 0,1 ~ 0,2 μg/μL
T4 RNA Ligas I (30 U/μL) 0,4 0,6 U/μL
DEPC-behandlad avjoniserat H2O till 20 μL -

Tabell 2: reaktions komponenter för mitokondriell RNA-cirkularisering.

Komponent Volym för 10 μL förblandning (μL)
Primer-blandning (totalt 1 μM)a 2
dNTP-blandning (10 mM vardera) 1
Cirkulariserat 5 ' polyfosfatasbehandlat eller icke-behandlat mitokondriellt RNAb X
DEPC-behandlade avjoniserat H2O till 10 μL

Tabell 3: förblandning för omvänd transkriptionsreaktion. en en Primer blandningen innehåller lika med förhållandet 26S-CRT och upp till 7 andra RT primers, och den slutliga koncentrationen är 1 μM. btvå för blandningar bereds sida vid sida och de innehåller samma mängd (200 ng) av cirkulariserat 5 ' polyfosfatasbehandlade eller icke-behandlat mitokondriellt RNA.

Komponent Volym för 20 μL reaktionssystem (μL) Slutliga koncentrationen
Mall RNA/primer/dNTP * 10 -
5x RTase buffert 4 1x
Rnashämmare (40 U/μL) 0,5 1 U/μL
RTase (200 U/μL) 1 10 U/μL
DEPC-behandlad avjoniserat H2O till 20 μL -

Tabell 4: reaktions komponenter för omvänd Transkription. * Mallen RNA/primer/dNTP pre-blandningar bereds vid steg 6,3.

Komponent Volym för 20 μL reaktionssystem (μL) Slutliga koncentrationen
Deionized H2O 7 -
2x reaktionsbuffert 10 1x
dNTP-blandning (10 mM vardera) 0,4 0,2 mM vardera
26S-CF1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
26S-CR1 (10 μM) 0,8 0,4 mM
Mallar cDNA som härrör från circularized 5 ' polyfosfatas-behandlade eller icke-behandlade RNAs * 0,6 -
DNA-polymeras (1 U/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabell 5: reaktions komponenter för PCR-amplifiering av 26S cDNA. * Inledningsvis, lika volym av mall cDNAs (0,6 μL) används för normalisering. Om det behövs ändrar du beloppen för mallcdnas för att säkerställa samma överflöd av 26S PCR-produkter mellan de två PCR-reaktionerna.

Steg Temperatur Tid Cykel nummer
Initial denaturering 95 ° c 3 minuters 1 cykel
Denaturering 95 ° c 15 SEK 22 – 25 cykler
Primer glödgning 56 ° c 15 SEK
Förlängning 72 ° c 30 SEK
Final extension 72 ° c 5 min 1 cykel
Hålla 4 ° c ∞ -

Tabell 6: PCR-villkor för att förstärka 26S cDNA för normalisering.

Komponent Volym för 20 μL reaktionssystem (μL) Slutliga koncentrationen
Deionized H2O till 20 μL -
2x reaktionsbuffert 10 1x
dNTP-blandning (10 mM vardera) 0,4 0,2 mM vardera
Avvikande primer-framåt (10 μM) 0,8 0,4 mM
Avvikande primer-omvänd (10 μM) 0,8 0,4 mM
Mall cDNA som härrör från den cirkulariserade 5 "polyfosfatasbehandlade eller icke-behandlade RNAs * X -
DNA-polymeras (1 U/μL) 0,4 0,02 U/μL

Tabell 7: reaktions komponenter för PCR-amplifiering av de cirkulariserade mål avskrifter. * Volymen av mallcdnas som används i dessa reaktioner bestäms av 26S rRNA normaliserings resultat.

Steg Temperatur Tid Cykel nummer
Initial denaturering 95 ° c 3 minuters 1 cykel
Denaturering 95 ° c 15 SEK 22-40 cykler c
Primer glödgning a 50-65 ° c 15 SEK
( ) 72 ° c 0.5-1 minuters
Finatl förlängning 72 ° c 5 min 1 cykel
Hålla 4 ° c ∞ -

Tabell 8: PCR-villkor för att förstärka mål avskrifter. en en Exakt glödgning tempererade beror på smälttemperaturen hos PCR primers. b Förlängning tid beror på längden av mål som skall förstärkas. Rekommenderad tid är 1 min per 1 KB av PCR-fragmentet. c I allmänhet är 30 ~ 35 cykler tillräckligt för att producera en adekvat mängd PCR-produkt. För låg riklig utskrifter, öka antalet cykler upp till 40 cykler.

Figur S1: placering av primers för representativa majs mitokondriella transkriptioner. CRT = omvänd Transkription primer; CF1, CF2, CR1, och CR2 = avvikande primers för PCR amplifiering; qCF och qCR = avvikande primers för RT-qPCR. Avskriften Termini av majs nad2-1, rps4-1 och nad4-1 har fastställts tidigare (Zhang et al., 20191). Positioner på 5 '-och 3 '-ändar i förhållande till AUG (+ 1) och den sista nukleotiden av stoppkodon (-1) visas. De kodnings områden och utr anges som grå rutor och fet linjer, respektive. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Figur S2: princip för att uppskatta cirkulariserings effektiviteten hos nad5 mRNA i majs. I en själv-ligation reaktion, endast en bråkdel av mitokondriell RNAs är circularized. För att beräkna förhållandet mellan circularized nad5 mRNA, två gen-specifika primers används för att syntetisera den första programområdet cdnas, dvs nad5-RT1 och-filen RT2. I nad5-filen RT2 omvänd Transkription (RT) reaktion, PCR-produkter förstärks av SqF2 & sqR2 (för RT-sqpcr) och QF2 & qR2 (för RT-qPCR) härrör från både linjära och cirkulariserade Nad5, medan sqF1 & sqR1 (för RT-Sqpcr) och qF1 & qR1 (för RT-qPCR) PCR-produkter härleds endast från circularized nad5 ; i nad5-RT1 reaktion, kan alla fyra par av PCR primers förstärka båda formerna av nad5. För att beräkna förhållandet mellan circularized nad5 mRNA, de två reaktionerna normaliseras av SqF2 & SqR2 eller QF2 & qR2 PCR-produkter. Genom att jämföra överflödet av sqF1 & sqR1 eller qF1 & qR1 PCR-produkter mellan de två RT-reaktionerna uppskattas cirkulariserings effektiviteten hos nad5 mRNA ungefär. ex = exon. Exoner och introner visas som grå rutor respektive böjda linjer. Positionerna för nad5-RT1 och-filen RT2 primers indikeras med pilar. Svarta prickar anger positionerna för PCR-primers och den förväntade storleken på PCR-produkterna visas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Tabell S1: primer-information. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I en tidigare studie, total och mitokondriell RNAs från cellsuspension kultur Arabidopsis användes för att kartlägga mitokondriell avskrift Termini av CRT-PCR, och liknande resultat erhölls12. Emellertid, endast berikat mitokondriellt RNA användes för att kartlägga mitokondriella transkription Termini i många andra studier1,2,3,9. Vi fann att berikningen av mitokondriellt RNA är ett viktigt steg för cRT-PCR kartläggning av mitokondriell avskrift Termini i majs. Efter denna berikning, förhållandet mellan circularized mitokondrie RNA ökar dramatiskt från 0,3%-3,7% till ~ 30% (figur 3 och bild S2), vilket gör amplifiering av circularized mål avskrifter möjligt i en omgång av PCR.

Den cirkularisering verkningsgraden av mitokondriellt RNA uppskattades av RT-PCR analys på majs nad1 och nad5, som båda är indelade i oberoende prekursorer av CIS-splitsning introner. Eftersom den potentiella påverkan från närvaron av föregångare RNAs samt variationen av RT effektivitet inte kunde uteslutas, detta är bara en grov uppskattning av den verkliga mitokondriell RNA cirkularisering effektivitet.

Vi ändrade själv-ligation villkor genom att förändra koncentrationen av mitokondriella RNA och PEG8000, samt genom vid förlängning inkubationstiden, men dessa förändringar verkade inte påverka mitokondriell RNA cirkularisering effektivitet. Även om vi inte är säkra på om ytterligare Percoll gradient rening kan öka circularization effektivitet, är kvaliteten på rå mitokondrier som utarbetats i avsnitt 2 tillräckligt bra för cRT-PCR-mappning av mitokondriell avskrift Termini i majs. Eftersom flera omgångar med PCRs kan orsaka falskt positiva resultat, gör amplifiering av mål utskrifter i en runda PCR att kartläggnings resultaten blir mer pålitliga.

Den 5 ' adenosintrifosfat av primära utskrifter är instabil, och det kan konverteras till 5 ' monofosfat av okänd anledning. Detta problem hindrar en tydlig differentiering mellan de primära och bearbetade avskrifter genom att använda metoder beroende på förekomst/frånvaro av 5 ' trifosfat1,2,4. Den mogna formen av majs 26S rRNA har en monophosphated 5 ', och det är okänsligt för RNA 5 ' polyfosfatas. För att minimera påverkan av den instabila 5 ' triphospahte, mogna 26S rRNA används för att normalisera de två RNA prover, behandlas och obehandlad av 5 ' polyfosfatas, och det visar sig vara ett viktigt steg för att skilja de två typerna av utskrifter i majs mitokondrien. Efter normalisering kan de primära och bearbetade transkripterna diskrimineras genom att jämföra cRT-PCR-och RT-qPCR-resultat som erhållits från 5 "polyfosfatasbehandlade och icke-behandlade RNA-prover. De primära avskrifter är känsliga för 5 ' polyfosfatas, och de förstärks starkt från det 5 ' polyfosfatasbehandlade provet, men inte (eller på en mycket låg nivå på grund av det instabila 5 ' trifosfat) från den icke-behandlade motsvarigheten. Däremot upptäcks de bearbetade transkripterna på jämförbara nivåer mellan de två proverna.

I växter är avskriften mönster av många mitokondriella gener ganska komplicerat1,2. Till exempel, majs nad6 och atp6 gener uttrycks som både monocistrons och dicistrons, och nad6, Atp6, och atp6-na6 mogna mrnas har två, tre, och två isoformer, respektive. Dessutom är avskrift population av en mitokondriell gen faktiskt en blandning av föregångare, mogna, och nedbrytning RNAs. PCRs är benägna att förstärka små molekyler, och det är svårt att upptäcka alla avskrift isoformer med ett par primers. Därför är RNA gel blot hybridisering krävs för att kontrollera cRT-PCR kartläggning resultat, och alternativa primers kan vara nödvändigt att förstärka de utskrifter upptäcks i norra blot men inte av första gången cRT-PCR.

Detta protokoll innehåller ett RT-qPCR-steg för att kontrollera diskriminerings resultaten för cRT-PCR. Eftersom flera isoformer av vissa mogna mRNAs är mycket nära i storlek1, är det omöjligt att bekräfta alla diskrimineringsresultat av RT-qPCR, och vissa steady-state avskrifter bestämdes genom att jämföra CRT-PCR resultat mellan den behandlade och icke-behandlade RNAs.

I detta protokoll kartlades 5 "och 3" Termini i mål avskrifter genom kloning och sekvensering av cRT-PCR-produkterna, och det begränsar antalet enskilda kloner som ska sekvenseras. Som en alternativ metod kan cRT-PCR-produkterna sekvenseras av nästa generations sekvensering, som sekvenserar tusentals molekyler för en uppsättning steady-state-avskrifter, och kartläggnings resultaten skulle vara mer exakta.

Förutom diskrimineringen av primär och bearbetad 5 ' Termini av cRT-PCR och RT-qPCR, monofosfat 5 ' Termini kunde bestämmas genom identifiering av omgivande RNA sekundära strukturer1,12. Det är välkänt att RNA sekundära strukturer såsom tRNA och t-element kunde medla mitokondriell avskrift slutet formation genom att rikta endonukleolytic klyvning av RNase P och/eller RNase Z12,18,19, 20. Därför bör de 5 ' Termini som gränsar till tRNA eller t-elementet härledas från post-transkriptionell bearbetning och innehåller monofoshater.

Genom att använda detta protokoll har en stor del av de steady-state avskrifter fastställts i majsmitokona1. Några var dock inte differentierade och/eller kartlagda för okänd anledning1. Dessutom anser vi att positionen för 5 ' avskrift Termini är bättre att bekräftas av primer Extension analys, även om det ingår i detta protokoll. På grund av bristen på experimentella data, är vi inte säkra på om denna strategi är lämplig för andra växtarter, såsom ris (Oryza sativa) och Arabidopsis. Förutom växternas mitokona ackumuleras både primära och bearbetade utskrifter stabilt i plastids21, och det är osäkert om denna strategi skulle kunna användas för att kartlägga och diskriminera plastidavskrifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 31600250, Y.Z.), vetenskap och teknikprojekt i Guangzhou City (Grant nr 201804020015, H.N.), och Kinas jordbruks forsknings system (Grant No. BILAR-04-PS09, H.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Aladdin, China A112880 To prepare 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific, USA 4359659 Thermal cycler for PCR amplification
Ascorbic acid Sigma-aldrich, USA V900134 For preparation of extraction buffer
Biowest Agarose Biowest, Spain 9012-36-6 To resolve PCR products and RNAs
Bovine serum albumin Sigma-aldrich, USA A1933 For preparation of extraction buffer
Bromophenol blue Sigma-aldrich, USA B8026 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot
DEPC Sigma-aldrich, USA V900882 Deactivation of RNase
DIG Northern starter kit Roche, USA 12039672910 For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection.
EDTA Sigma-aldrich, USA V900106 For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer
EGTA Sigma-aldrich, USA E3889 For preparation of wash buffer
Gel documentation system Bio-Rad, USA Gel Doc XR+ To image the agarose gel
Glycerol Sigma-aldrich, USA G5516 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis
GoldView II (5,000x) Solarbio,. China G8142 DNA staining
Hybond-N+, Nylon membrane Amersham Biosciences, USA RPN119 For Northern blot
Image Lab Bio-Rad, USA Image Lab 3.0 Image gel, and compare the abundance of PCR products.
KH2PO4 Sigma-aldrich, USA V900041 For preparation of extraction buffer
KOH Aladdin, China P112284 For preparation of extraction buffer
L-cysteine Sigma-aldrich, USA V900399 For preparation of extraction buffer
Millex Millipore, USA SLHP033RB To sterile extraction and wash buffers by filtration
Miracloth Calbiochem, USA 475855-1R To filter the ground kernel tissues
MOPS Sigma-aldrich, USA V900306 For preparation of running buffer for Northern blot
NanoDrop Thermo Fisher Scientific, USA 2000C For RNA concentration and purity assay
NaOH Sigma-aldrich, USA V900797 For preparation of wash buffer
pEASY-Blunt simple cloning vector TransGen Biotech, China CB111 Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site.
Phanta max super-fidelity DNA polymerase Vazyme, China P505 DNA polymerase for PCR amplification
Polyvinylpyrrolidone 40 Sigma-aldrich, USA V900008 For preparation of extraction buffer
Primer Premier 6.24 PREMIER Biosoft, USA Primer Premier 6.24 To design primers for reverse transcription and PCR amplification
PrimeScript II reverse transcriptase Takara, Japan 2690 To synthesize the first strand cDNA
PureLink RNA Mini kit Thermo Fisher Scientific, USA 12183025 For RNA purificaion
RNA 5' polyphosphatase Epicentre, USA RP8092H To convert 5' triphosphate to monophosphate
RNase inhibitor New England Biolabs, UK M0314 A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase.
Sodium acetate Sigma-aldrich, USA V900212 For preparation of running buffer for Northern blot
Sodium chloride Sigma-aldrich, USA V900058 To prepare 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixes Bio-Rad, USA 1725202 For RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1 New England Biolabs, UK M0437 For RNA circularization
Tetrasodium pyrophosphate Sigma-aldrich, USA 221368 For preparation of extraction buffer
TIANgel midi purification kit Tiangen Biotech, China DP209 To purify DNA fragments from agarose gel
Tris Aladdin, China T110601 To prepare 1x TAE buffer
TRIzol reagent Invitrogen, USA 15596026 To extract mitochondiral RNA.
Universal DNA purification kit Tiangen Biotech, China DP214 To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction
Xylene cyanol FF Sigma-aldrich, USA X4126 For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
  3. Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
  4. Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
  5. Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5' end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
  6. Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
  7. Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
  8. Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
  9. Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
  10. Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
  11. Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
  12. Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5' and 3' end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
  13. Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5' ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
  14. Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
  15. Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
  16. Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5'-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
  17. Green, R. M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. (2012).
  18. Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
  19. Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
  20. Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
  21. Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).

Tags

Genetik cirkulär RT-PCR Northern blot kvantitativ RT-PCR RNA 5 ' polyfosfatasbehandling RNA-normalisering primära och bearbetade transkriptioner,
Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng,… More

Zhang, Y., Liao, X., Luo, P., Peng, K., Ye, W., Lian, T., Ma, Q., Nian, H. Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy. J. Vis. Exp. (149), e60019, doi:10.3791/60019 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter