Summary
Wir präsentieren eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie, indem wir kreisförmige RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung und Northern Blot kombinieren. Dieses Protokoll enthält einen Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren, und es eignet sich zur Unterscheidung und Kartierung der primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt werden.
Abstract
In pflanzlichen Mitochondrien enthalten einige stationäre Transkripte 5' Triphosphat, das aus der Transkriptioninitiierung abgeleitet wurde (primäre Transkripte), während die anderen 5' Monophosphat enthalten, das posttranskriptional erzeugt wurde (verarbeitete Transkripte). Um zwischen den beiden Arten von Transkripten zu unterscheiden, wurden mehrere Strategien entwickelt, und die meisten von ihnen hängen von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat ab. Das Triphosphat bei primären 5' Termini ist jedoch instabil und behindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten. Um die primären und verarbeiteten Transkripte, die in Maismitochondrion stabil angesammelt wurden, systematisch zu differenzieren und abzubilden, haben wir eine kreisförmige RT-PCR-basierte Strategie entwickelt, indem wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphoshpatase-Behandlung, quantitative RT-PCR (RT-qPCR) und Northern Blot. Als Verbesserung beinhaltet diese Strategie einen RNA-Normalisierungsschritt, um den Einfluss von instabilem 5'-Triphosphat zu minimieren.
In diesem Protokoll wird die angereicherte mitochondriale RNA mit RNA 5' Polyphosphatase vorbehandelt, die 5' Triphsophat in Monophosphat umwandelt. Nach Zirkularisierung und umgekehrter Transkription werden die beiden cDNAs, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs abgeleitet wurden, durch Mais 26S reife rRNA normalisiert, die ein verarbeitetes 5' Ende hat und unempfindlich gegen 5' Polyphosphatase ist. Nach der Normalisierung werden die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Produkten aus den behandelten und nicht behandelten RNAs diskriminiert. Die Transkript-Termini werden durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte bestimmt und dann durch Northern Blot überprüft.
Mit dieser Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion bestimmt. Aufgrund des komplizierten Transkriptmusters einiger mitochondrialer Gene wurden einige stationäre Transkripte nicht unterschieden und/oder kartiert, obwohl sie in einem nördlichen Fleck nachgewiesen wurden. Wir sind nicht sicher, ob diese Strategie geeignet ist, die stationären Transkripte in anderen pflanzenmitochondrien oder in Plastiden zu unterscheiden und abzubilden.
Introduction
In pflanzlichen Mitochondrien werden viele reife und Vorläufer-RNAs als mehrere Isoformen angesammelt, und die stationären Transkripte können in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf der Differenz an ihren 5' Enden1,2,3, 4. Die primären Transkripte haben 5' Triphosphatendenden, die aus der Transkriptionioninitiation abgeleitet sind. Im Gegensatz dazu haben die verarbeiteten Transkripte 5' Monophosphat, das durch posttranskriptielle Verarbeitung erzeugt wird. Diskriminierung und Kartierung der beiden Arten von Transkripten sind wichtig, um die molekularen Mechanismen zu entwirren, die der Transkription und Transkriptendreifung zugrunde liegen.
Um zwischen den primären und verarbeiteten Transkripten im pflanzlichen Mitochondrion zu unterscheiden, wurden vier Hauptstrategien entwickelt. Die erste Strategie besteht darin, die mitochondrialen RNAs mit Tabaksäurepyrophosphatase (TAP) vorzubehandeln, die 5' Triphosphat in Monophosphat umwandelt und die Zirkularisierung von Primärtranskripten durch RNA-Ligase ermöglicht. Die Transkriptsfülle von TAP-behandelten und nicht behandelten RNA-Proben wird dann durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) oder kreisförmiger RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4verglichen. In der zweiten Strategie werden die verarbeiteten Transkripte zunächst von mitochondrialen RNAs mit Terminator 5'-phosphatabhängiger Exonuklease (TEX) aufgebraucht, und die primären Transkripte werden dann durch Primer-Erweiterungsanalyse5,6 . Die dritte Strategie besteht darin, die primären Transkripte mit Guanylyltransferase vorab zu begrenzen, und dann wird die Position der triphosphierten 5' Termini durch Primerverlängerung zusammen mit der Ribonuklease- oder S1-Nukleaseschutzanalyse7,8 bestimmt. ,9. Anders als je nach Vorhandensein/Abwesenheit von 5'-Triphosphat kombiniert die vierte Strategie In-vitro-Transkription, standortgesteuerte Mutagenese und Primer-Erweiterungsanalyse, um die vermeintlichen Promotoren zu charakterisieren und die Transkription zu bestimmen. Initiationsstandorte8,10,11. Durch die Verwendung dieser Strategien wurden viele primäre und verarbeitete Transkripte in pflanzlichen Mitochondrien bestimmt.
Mehrere Studien haben jedoch berichtet, dass die 5' Triphosphat der primären Transkripte instabil waren, und sie wurden leicht in Monophosphat aus unbekanntem Grund umgewandelt2,4,12,13. Dieses Problem verhindert eine klare Diskriminierung der beiden Arten von Transkripten, indem Techniken verwendet werden, die vom Vorhandensein/Fehlen von 5'-Triphosphat abhängen, und frühere Bemühungen, systematisch zwischen den primären und den verarbeiteten Transkripten in Pflanzen zu unterscheiden. mitochondrien fehlgeschlagen2,12.
In diesem Protokoll kombinieren wir cRT-PCR, RNA 5' Polyphosphatase-Behandlung, RT-qPCR und Northern Blot, um systematisch die primären und verarbeiteten Transkripte zu unterscheiden, die in Mais (Zea mays) Mitochondrion angesammelt wurden (Abbildung 1). cRT-PCR ermöglicht die gleichzeitige Kartierung von 5' und 3' Extremitäten eines RNA-Moleküls, und es ist in der Regel angepasst, um Transkript-Termini in Pflanzen2,12,14,15. DIE Polyphosphatase von RNA 5 könnte zwei Phosphate aus dem triphosphatierten 5' Termini entfernen, wodurch die primären Transkripte für die Selbstligation durch RNA-Ligase verfügbar sind. Frühere Studien zeigten, dass reife 26S rRNA in Mais 5' Endstation verarbeitet hatte, und es war unempfindlich gegen RNA 5' Polyphosphatase1,16. Um den Einfluss von instabilem Triphosphat auf primäre 5' Termini zu minimieren, werden die 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs durch ausgereifte 26S rRNA normalisiert, und die primären und verarbeiteten Transkripte werden dann durch cRT-PCR-Produkte, die aus den beiden RNA-Proben gewonnen wurden. Die CRT-PCR-Mapping- und Diskriminierungsergebnisse werden von Northern Blot bzw. RT-qPCR überprüft. Schließlich werden alternative Primer verwendet, um die Transkripte zu verstärken, die im nördlichen Blot, aber nicht durch cRT-PCR erkannt wurden. Durch die Verwendung dieser cRT-PCR-basierten Strategie wurden die meisten stationären Transkripte in Maismitochondrion differenziert und kartiert1.
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Protocol
1. Primer Design
- Entwerfen Sie genspezifische Primer für die Reverse Transkription (RT) mit PCR Primer Design Software (Table of Materials) basierend auf den allgemeinen Regeln des Primer Designs17.
HINWEIS: RT-Primer sind sehr spezifisch für die Zieltranskripte und sind in der Regel auf dem 5' Teil der Codierungssequenzen (reife mRNAs und Vorläufer-RNAs) oder 500–600 nt stromabwärts des erwarteten 5'-Ends (18S und 26S rRNAs) verankert. - Entwerfen Sie Paare von divergenten Primern, um die kreisförmigen Transkripte durch cRT-PCR zu verstärken.
ANMERKUNG: Die gepaarten divergierenden Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung der kreisförmigen Transkripte, und ihre Positionen variieren zwischen den analysierten Zieltranskripten (Abbildung S1). Einige Transkripte haben lange UTRs; zum Beispiel sind nad2-1 5' UTR und rps4-1 3' UTR 1.985 bzw. 1.826/1.834 nt bzw.1. Wenn beide Primer im Codierungsbereich verankert sind, ist es schwierig, die Zieltranskripte zu verstärken. Im Gegensatz dazu sind einige UTRs kurz; Beispielsweise sind die 3' UTRs von nad2-1 und nad4-1 34/35 und 29–31 nt bzw.1. Wenn sich die gekoppelten Primer weit von den Codierungssequenzen entfernt befinden, schlägt die PCR fehl. Im Allgemeinen sind zwei Paare von divergenten Primern für jedes Zieltranskript entworfen, während mehrere Paare erforderlich sein können, um diejenigen zuzuordnen, deren Transkriptmuster kompliziert sind und/oder UTRs sehr lang sind. - Entwerfen Sie Paare konvergenter Primer, um RNA-Sonden für northern blot vorzubereiten.
HINWEIS: Die gepaarten Primer befinden sich im Kodierungsbereich des Zielgens, und die Größe des PCR-Produkts sollte im Bereich von 100 bis 1.000 bp liegen. Jede Vorwärtsprimer sollte eine Restriktionsenzym-Site enthalten, um Vektorsequenzen in den resultierenden Sonden zu minimieren.
2. Herstellung von Rohmitochondrion aus Mais entwicklungserkerne
- Schädlinge, Mörtel, Glastrichter, Rohre und Spitzen per Autoklav ensterilisieren und im Ofen trocknen.
- Führen Sie alle Verfahren bei 4 °C oder auf Eis durch und kühlen Sie alle Lösungen vor.
- Bereiten Sie 100 ml Extraktionspuffer (EB), bestehend aus 0,3 M Saccharose, 5 mM Tetranatriumpyrophosphat, 10 mM KH2PO4, 2 mM EDTA, 1% [w/v] Polyvinylpyrrolidon 40, 1% [w/v] Rinderserumalbumin, 5 mM L-Cystein und 20 mM Ascorbinsäure vor. Mit KOH auf pH 7.3 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
- 100 ml Waschpuffer (WB) bestehend aus 0,3 M Saccharose, 1 mM EGTA und 10 mM MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure) vorbereiten. Mit NaOH auf pH 7.2 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, EB und WB mit DEPC-behandelten deionisiertenH2O vorzubereiten. - Sammeln Sie 20 g entwickelnde Kerne in 11–20 Tagen nach der Bestäubung (DAP) zu einem 50-ml-Rohr auf Eis gelegt, und übertragen Sie dann die Kerne auf vorgekühlte Mörtel.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 100 ml EB zu 20 g Maiskernen. - Fügen Sie jedem Mörtel 10–20 ml eiskalteEB hinzu und mahlen Sie die Kerne vollständig.
- Fügen Sie weitere EB hinzu, und filtern Sie das gemahlene Gewebe durch zwei Schichten Filtertuch (Tabelle der Materialien).
- Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 8.000 x g für 10 min, und entsorgen Sie das Pellet.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 20.000 x g für 10 min.
- Gießen Sie den Überstand ab, und setzen Sie das Pellet in 6 ml WB wieder auf.
- Aliquot die Suspension zu fünf 1,5 ml RNase-freien Rohren, und zentrifugieren Sie sie bei 14.000 x g für 5 min.
- Den Überstand entsorgen, das mitochondriale Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
3. Extraktion von mitochondrialer RNA
- Extrahieren Sie mitochondriale RNA mit einem kommerziellen Reagenz (Materialtabelle) gemäß den Anweisungen der Herstellung.
ACHTUNG: Dieses Reagenz enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat. Arbeiten Sie damit in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie Labormantel und Handschuhe. - Lösen Sie die isolierte mitochondriale RNAin DEPC-behandelten deionisierten H2 O, und schätzen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer (Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Im Allgemeinen wird aus 20 g 15-DAP-Maiskernen eine mitochondriale RNA von 250 g gewonnen. - Bereiten Sie ein Agarose-Gel bestehend aus 1x TAE Puffer (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure, 1mM EDTA), 1,5% Agarose (Materialtabelle), und 1x Kernfärbung Farbstoff (Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie ein geeignetes Volumen von 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5% Xylolcyanol FF und 50% Glycerin) hinzu und laden Sie mitochondriale RNA/Loading Puffergemisch auf das 1,5% Agarose-Gel.
- Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 20–25 min aus und bewerten Sie die mitochondriale RNA-Integrität, indem Sie das Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem (Tableof Materials)abbilden.
HINWEIS: Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bändern (3.510 usd bzw. 1.970 nt für Mais mitochondriale 26S bzw. 18S rRNAs) ist ein akzeptabler Standard für intakte mitochondriale RNA. Um einen möglichen Abbau auszuschließen, sollte die RNA-Integrität in den verschiedenen Schritten der kreisförmigen RNA-Präparation untersucht werden (Abbildung 2).
4. RNA 5' Polyphosphatase Behandlung
- RNA 5' Polyphosphatase (Tabelle und Materialien) Behandlung einrichten ( Tabelle1), und inkubieren bei 37 °C für 30–60 min.
- Stellen Sie die 5' Polyphosphatase-behandelte RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder her.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.
5. RNA-Zirkularisation
- Bereiten Sie zwei Zirkulierungsreaktionen mit den gleichen Mengen von 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten mitochondrialen RNAs (Tabelle 2) vor und inkubieren Sie beide Reaktionen bei 16 °C für 12–16 h.
- Stellen Sie die beiden Sätze von selbstligierten RNAs mit dem gleichen Kit wie in Schritt 4.2 wieder her.
HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass nur ein Bruchteil der mitochondrialen RNA selbstligiert wird, und die wiedergewonnene RNA wird eine Mischung aus linearen und kreisförmigen Transkripten sein. - Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.5.
6. Umgekehrte Transkription
- Synthetisieren Sie zwei Sätze von cDNAs aus den gleichen Mengen von kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs (200 ng).
- Bereiten Sie eine Primermischung vor, indem Sie ein gleiches Verhältnis von 26S-CRT und bis zu 7 weitere RT-Primer hinzufügen.
HINWEIS: Die Endkonzentration des Primergemisches sollte 1 m betragen. - Bereiten Sie zwei Vormischungen vor, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführten Reagenzien kombinieren, bei 65 °C 5 min brüten und dann 2 min auf Eis abkühlen.
- Montieren Sie zwei RT-Reaktionssysteme (Tabelle 4) und inkubieren Sie sie bei 42 °C für 50 min.
- Beide RT-Reaktionen bei 70 °C 5 min erhitzen und dann auf Eis abkühlen lassen.
7. Normalisierung
- Bereiten Sie zwei PCR-Reaktionen vor, indem Sie das gleiche Volumen von Template-CDNAs hinzufügen, die von 5' Polyphosphatase-behandelten oder nicht behandelten RNAs abgeleitet sind, divergierende Primer flankieren die 5'-3'-Kreuzung von kreisförmiger 26S rRNA (d. h. 26S-CF1 und -CR1) usw. (Tabelle 5).
- Führen Sie die beiden Reaktionen in einem thermischen Cycler (Materialtabelle) unter den in Tabelle 6beschriebenen Bedingungen aus.
- Bereiten Sie ein Agarose-Gel aus 1x TAE-Puffer, 1,0% Agarose und 1x Kernfärbung vor.
- Fügen Sie jedem der beiden PCR-Produkte 2 l 10x Ladepuffer (0,5% Bromphenolblau, 0,5 % Xylolcyanol FF und 50 % Glycerin) hinzu und laden Sie sie auf das Gel.
- Führen Sie das Gel im 1x TAE-Puffer bei 5–6 V/cm für 30–40 min aus, und stellen Sie es mit demselben Geldokumentationssystem als Schritt 3.5 ab.
- Vergleichen Sie die Häufigkeit der beiden PCR-Produkte mit Computersoftware (Tabelle der Materialien, Abbildung 4A), und optimieren Sie die Normalisierung, indem Sie bei Bedarf die Mengen der Vorlagen-CDNAs ändern.
8. PCR-Verstärkung
- Vorbereiten Sie Paare von PCR-Reaktionen, indem Sie ein geeignetes Volumen der normalisierten cDNAs und ein Paar divergierender Primer hinzufügen, die 5'-3' Kreuzung der Zieltranskripte flankieren (Tabelle 7).
HINWEIS: Die Menge der Vorlagen-CDNAs, die für die PCR-Verstärkung der Zieltranskripte verwendet werden, wird durch die 26S rRNA Normalisierungsergebnisse bestimmt. - Führen Sie die PCR-Reaktionen gemäß dem in Tabelle 8beschriebenen Programm aus.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
- Wechseln Sie zu verschachtelten divergierenden Primern, und überprüfen Sie die PCR-Ergebnisse der ersten Runde, indem Sie die Schritte 8.1 und 8.2 wiederholen.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.3 bis 7.5.
- Stellen Sie die prominenten Bänder wieder her, die in zwei Runden PCR-Verstärkung mit einem Gel-DNA-Recovery-Kit (Tableof Materials)wiederholt werden könnten.
9. Bestimmung der Transkript-Termini
- Klonen Sie die gelgereinigten PCR-Produkte mit Standardtechniken in einen stumpfen Endvektor (Materialtabelle).
- Führen Sie Kolonie-PCR aus, um positive Klone auszuwählen, die die Zieleinsätze enthalten, und sequenzieren Sie sie kommerziell.
HINWEIS: Positive Klone, die Inserts mit variabler Größe enthalten, werden in der Regel von einem einzigen wiederhergestellten Band erkannt, da viele stationäre Transkripte in pflanzenmitochondrial heterogenen 5' und/oder 3' Enden1,12haben. - Richten Sie die Sequenzierungsdaten mit dem mitochondrialen Maisgenom mithilfe des grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeugs (BLAST) des nationalen Zentrums für biotechnologische Informationen (NCBI) aus. Wählen Sie Organismus "mais (taxid:4577)" und Suchdatenbank "Nukleotid-Sammlung (nr/nt)".
- Finden Sie die 5'-3' Kreuzung des kreisförmigen Transkripts, und bestimmen Sie die Positionen von 5' und 3' Transkript termini.
- Berechnen Sie die Größe der Zieltranskripte.
10. Verifikation der cRT-PCR Mapping Ergebnisse durch RNA Gel Blot Hybridisierung
HINWEIS: Die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung erfolgt mit einem kommerziellen Kit (Table of Materials), das die Reagenzien für die Transkriptionskennzeichnung von RNA mit Digoxigenin (DIG) und T7-RNA-Polymerase, Hybridisierung und immunologischem Nachweis enthält. Weitere Informationen finden Sie in den Protokollen in diesem Kit. Stellen Sie sicher, dass nur RNase freie Geräte für den gesamten Vorgang verwendet werden.
- Verstärken Sie das DNA-Fragment, das zur Vorbereitung der RNA-Sonde verwendet wird, und klonen Sie es auf den gleichen Vektor wie in Schritt 9.1, der einen T7-Promotor 17 bp vor der Einfügestelle enthält.
- Linearisieren Sie das Konstrukt mit dem richtigen Restriktionsenzym, bergen Sie das linearisierte Plasmid durch ein DNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien) und lösen Sie es in DEPC-behandelten deionisierten H2O.
- Label RNA Sonden mit DIG-11-UTP durch ein kommerzielles Kit (Tabelle der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers.
- 500 ml 10x MOPS-Puffer (0,2 M MOPS, 50 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA) mit DEPC-behandeltem deionisiertemH2O vorbereiten. Von NaOH auf pH 7,0 einstellen und durch Filtration sterilisieren.
- Fügen Sie der in den Schritten 3.1–3.3 hergestellten mitochondrialen RNA, die in den Schritten 3.1–3.3 hergestellt wird, 2–3 Volumen des Ladepuffers (50% Formamid, 6,2 % Formaldehyd, 1x MOPS, 10% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau) hinzu.
- Die RNA-Probe/Ladepuffermischung 10 min bei 65 °C denaturieren und dann 1 min auf Eis abkühlen lassen.
- Bereiten Sie ein denaturiertes Agarose-Gel (2% Formaldehyd, 1,2% Agarose und 1x MOPS) vor und laden Sie die RNA-Probe/Loading-Puffermischung in das Gel (1–2 g mitochondriale RNA pro Brunnen).
- Führen Sie das Gel in 1x MOPS bei 3–4 V/cm für 4 h aus.
- 2 L 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0) vorbereiten. Behandeln Sie es mit 0,1% DEPC über Nacht, und sterilisieren durch Autoklaven.
- Spülen Sie das Gel zweimal in 20x SSC (15 min jedes Mal), und übertragen Gel RNA auf eine Nylonmembran (Tisch der Materialien) durch Kapillartransfer mit 20x SSC für 10-16 h.
- Fixieren Sie die RNA an der Membran, indem Sie 30 min bei 120 °C backen.
- Führen Sie die RNA-Hybridisierung und den immunologischen Nachweis mit einem kommerziellen Kit (Tabelle der Materialien) gemäß der Anweisung des Herstellers durch.
11. Diskriminierung von Primär- und Verarbeiteten 5' Enden
- Diskriminieren Sie die primären und verarbeiteten 5' Enden, indem Sie die cRT-PCR-Produkte vergleichen, die aus den normalisierten 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden.
HINWEIS: Bei primären Transkripten ist die Häufigkeit von PCR-Produkten aus 5' Polyphosphatase-behandelter RNA viel höher als die von nicht behandelten Gegenstücken (Abbildung 1, "Gene A" und Abbildung 4A). Bei verarbeiteten Transkripten würde jedoch ein vergleichbares Niveau von PCR-Produkten aus den beiden Sätzen mitochondrialer RNAs (Abbildung1, "Gene B") verstärkt. - Design RT-qPCR Primer basierend auf den cRT-PCR-Mapping-Ergebnissen.
- Überprüfen Sie die CRT-PCR-Diskriminierungsergebnisse durch RT-qPCR.
HINWEIS: Die beiden cDNA-Proben, die aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden, werden durch die RT-qPCR-Produkte von 26S reifer rRNA normalisiert.
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Representative Results
Abschätzung der mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz
In einer früheren Studie wurden sowohl totale als auch mitochondriale RNAs für die cRT-PCR-Mapping von mitochondrialen Transkripttermini in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) verwendet, und die beiden Arten von RNAs ergaben ähnliche Kartierungsergebnisse12. Anfangs verwendeten wir auch totale RNAs für die cRT-PCR-Zuordnung von mitochondrialen Transkript-Termini in Mais. Nach vielen Versuchen stellten wir fest, dass die Zieltranskripte schwer zu erkennen waren. Als Verbesserung bereicherten wir die mitochondriale RNA aus Mais entwicklungsbasierten Kernen und ermöglichten die Verstärkung der kreisförmigen Zieltranskripte in einer Runde PCR.
Um die einfache Verstärkung von Zieltranskripten nach der Anreicherung zu erklären, schätzten wir die Effizienz der RNA-Zirkularisierung durch die Durchführung von RT-PCRs auf repräsentativen mitochondrialen Genen nad5 (Abbildung 3 und Abbildung S2). Das Mais-Nad5-Gen enthält zwei trans-und zwei cis-spleißende Introns. Nach der Selbstligation von totalen und mitochondrialen RNAs wurden die cDNAs des ersten Strangs unabhängig mit nad5-RT1 und -RT2 Primern unabhängig synthetisiert. Die beiden Primer konnten sowohl lineare als auch kreisförmige nad5 mRNAs umschreiben (Abbildung S2). Für die PCR-Verstärkung werden vier Konvergente-Primer-Paare verwendet: sqF1&sqR1 und sqF2&sqR2 für semiquantitative RT-PCR (RT-sqPCR) und qF1&qR1 und qF2&qR2 für RT-qPCR. Bei cDNAs, die von nad5-RT1 transkribiert wurden, erkannten alle vier Primerpaare sowohl kreisförmige als auch lineare nad5 reife mRNAs; für die nad5-RT2 Reverse-Transkriptionsreaktion untersuchten sqF2&sqR2 und qF2&qR2 beide Formen von mRNA, während sqF1&sqR1 und qF1&qR1 PCR-Produkte nur aus zirkulierten nad5 abgeleitet wurden. Basierend auf dieser Analyse verwendeten wir die PCR-Produkte sqF2&sqR2 (für RT-sqPCR) und qF2&qR2 (für RT-qPCR), um die Reverse-Transkriptionsreaktionen nad5-RT1 und -RT2 zu normalisieren, und schätzten das Verhältnis von zirkulierten nad5 durch den Vergleich der sqF1&sqR1 (für RT-sqPCR) oder qF1&qR1 (für RT-qPCR) PCR-Produkte. Vor der Selbstligation wurden RNAs mit RNA 5'-Polyphosphatase vorbehandelt, um alle Transkripte für die Zirkularisation durch RNA-Ligase zur Verfügung zu stellen. Die RT-sqPCR-Analyse zeigte, dass ein sehr kleiner Bruchteil von nad5 mRNA bei Verwendung der gesamten RNA zirkuliert wurde, aber das Verhältnis wurde dramatisch erhöht, als die angereicherte mitochondriale RNA verwendet wurde (Abbildung 3B). Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass das Verhältnis der selbstligierten nad5 mRNA nach der Anreicherung von 3,7 % auf 32 % stieg (Abbildung 3C). Die Analyse von nad1 ergab ähnliche Ergebnisse, und die Zirkularisierungseffizienz von nad1 mRNA stieg von 0,7% auf 30% (Abbildung 3D-F).
Durch diese Analysen wurden nach der Verbesserung etwa 30% maismitochondriale RNAs selbstligisiert, und die erhöhte Zirkularisierungseffizienz erklärt die einfache Detektion der Zieltranskripte durch cRT-PCR.
Bestimmung von Mais cox2 mRNA termini mit der cRT-PCR-basierten Strategie
Wir haben das cox2-Gen als Beispiel verwendet, um die Kartierung und Diskriminierung von mitochondrialen Transkripten von Mais mithilfe der cRT-PCR-basierten Strategie einzuführen ( Abbildung4).
Zu Beginn der Kartierung von cox2 mRNA wurden drei nach außen gerichtete Primer CF1, CF2 und CR1 für den Genkodierungsbereich entwickelt (Abbildung 4D). CF1 und CF2 waren verschachtelte Primer, und CF2 war 69 bp stromabwärts von CF1. Mit der Vorlage cDNAs synthetisiert in den Schritten 6.1–6.5 und normalisiert bei den Schritten 7.1–7.6, das CF1&CR1 Primer-Paar verstärkt zwei prominente Bänder, und die Verstärkungsergebnisse wurden von geschachtelten Primern CF2&CR1 (Abbildung 4A) wiederholt. Darüber hinaus wurden die beiden Bänder stark aus der 5' Polyphsophatase-behandelten RNA verstärkt, während sie im nicht behandelten Gegenstück schwer zu erkennen waren, was darauf hindeutet, dass sie empfindlich auf RNA 5' Polyphsophatase reagieren und primäre 5' Termini haben.
Die beiden Kandidatenbands wurden cox2-1 und -2 genannt, und sie wurden unabhängig vom Agarose-Gel wiederhergestellt und in Vektoren geklont. Die Ergebnisse der Kolonie-PCR zeigten, dass die positiven Klone Inserts mit variabler Größe enthalten, was heterogene 5' und/oder 3' Termini der Transkripte impliziert (Abbildung 5). Die positiven Klone wurden kommerziell sequenziert, und die Sequenzierungsdaten wurden mit dem mitochondrialen Maisgenom ausgerichtet, wie in Schritt 9.3 beschrieben.
Die Sequenzierungs- und Ausrichtungsergebnisse zeigten, dass die beiden Transkripte an 3' Enden identisch waren, sich aber in der Länge von 5' UTRs unterschieden (Abbildung4D). Die 5' Enden von cox2-1 und -2 wurden bei 992-1,030 bzw. 1.276-1.283 nt vor AUG angereichert, während ihr 3'-Ende 39 nt flussabwärts des Stop-Codons war. Aus den cRT-PCR-Ergebnissen abgeleitet, betrugen die berechneten Größen von cox2-1 und -2 1.804–1.832 bzw. 2.088–2.095 nt.
Um die cRT-PCR-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, wurde die RNA-Gel-Blot-Hybridisierung mit der Sonde durchgeführt, die aus dem cox2-Gen-Codierungsbereich abgeleitet wurde, und es wurden zwei Hauptbänder mit ähnlicher Größe wie cox2-1 und -2 nachgewiesen (Abbildung 4C). Zusätzlich wurden zwei größere Bänder über 2.500 und 2.800 nt im Nördlichen Blot nachgewiesen, aber sie wurden nicht durch cRT-PCR verstärkt. Die beiden größeren Bänder wurden als cox2-3 bzw. -4 benannt. Um sie abzubilden, wurden zwei weitere nach außen gerichtete Primer (d.h. CR2 und CF3), die auf den 5' und 3' UTRs von cox2-2 verankert sind, entworfen, und ihre Positionen waren nahe an den erwarteten Transkriptionenen von cox2-3 und -4. Mit dem Primerpaar CF3&CR2 wurden zwei Hauptbänder stark aus cDNAs verstärkt, die aus 5' polyphsophatase-behandelter RNA, aber nicht aus dem nicht behandelten Gegenstück (Abbildung 4A) abgeleitet wurden. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass sie identische 5' Termini hatten, während Variable 3' enden. Die berechnete Größe der beiden Transkripte betrug 2.512/2.513 bzw. 2.833–2.835 nt, und sie waren mit den beiden größeren Bändern, die im Nördlichen Fleck entdeckt wurden, nahe. Darüber hinaus legten die cRT-PCR-Ergebnisse nahe, dass Cox2-3 und -4 primäre 5' Termini haben.
Um die Diskriminierungsergebnisse zu bestätigen, wurden fünf nach außen gerichtete Primer nach den cRT-PCR-Mapping-Ergebnissen entwickelt, d.h. qCF1, qCF2, qCR1, qCR2 und qCR3, und die Primerpaare qCF1&qCR1, qCF1&qCR2, qCF1&qCR3 und qCF2&qCR3 wurden für RT-qPCR-Analyse von cox2-1, -2, -3 bzw. -4. Die relative Häufigkeit aller vier RT-qPCR-Produkte in 5' polyphsophatase-behandelten Proben war viel höher als bei den nicht behandelten Gegenstücken, was die CRT-PCR-Diskriminierung bestätigt.
Zusammenfassend ist das Transkriptmuster des Mais-Cox2-Gens kompliziert, und die cRT-PCR-basierte Strategie diskriminiert und bildet die multiplen Isoformen von cox2 mRNA effektiv ab.
Abbildung 1: Überblick über die cRT-PCR-basierte Strategie. Darstellung der wichtigsten Schritte der cRT-PCR-basierten Strategie. 5'+ und 5'- = die beiden RNA-Proben, die mit RNA 5' Polyphosphatase behandelt bzw. nicht behandelt werden. Die beiden cDNA-Proben, die aus 5' polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNAs gewonnen werden, werden durch 26S ausgereifte rRNA in Mais normalisiert, und die primären und verarbeiteten Transkripte werden durch den Vergleich der cRT-PCR-Produkte diskriminiert. Für Gen A hat die entsprechende RNA ein primäres 5'-Ende, da die PCR-Produktmenge aus 5' Polyphosphatase-behandelter RNA viel höher ist als die des nicht behandelten Gegenstücks; für Gen B werden die PCR-Produkte aus den beiden Sätzen mitochondrialer RNAs auf vergleichbarer Ebene verstärkt, was eine verarbeitete 5' Endstation der entsprechenden RNA impliziert. Der Codierungsbereich und UTRs werden durch graue Feld- bzw. Fettzeilen dargestellt. CRT = Primer für Reverse-Transkription; CF1, CF2, CR1 und CR2 = PCR-Primer, die die 5'-3'-Kreuzung des kreisförmigen Transkripts flankieren; qCF und qCR = Divergentprimer für RT-qPCR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bewertung der mitochondrialen RNA-Integrität durch Agarose-Gel-Elektrophorese. (A) Mitochondriale RNAs, die aus 15-DAP-Maiskernen hergestellt werden. M = DNA-Molekularmarker. (B) Kernel mitochondriale RNA nach der Behandlung durch 5' Polyphosphatase und/oder Zirkularisation durch T4-RNA-Ligase. 5'+ = mitochondriale RNA nach der Behandlung durch 5' Polyphosphatase; T4&5'+ = mitochondriale RNA nach der Behandlung durch 5' Polyphosphatase und Zirkularisation durch T4-RNA-Ligase; T4&5'- = mitochondriale RNA nur nach Zirkularisierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zirkularisierungseffizienz von nad5 und nad1 mRNAs, die von RT-PCRs geschätzt werden. (A) bzw. (D) Schematische simontische seder 5- bzw. nad1-Gene. Ex = exon. Exons und Introns werden als graue Felder bzw. gekrümmte Linien angezeigt. Die Position der Reverse-Transkriptionsprimer RT1 und RT2 wird durch Pfeile angezeigt. Schwarze Punkte zeigen die Position der PCR-Primer an, und die vorhergesagte Größe der PCR-Produkte wird angezeigt. sqF1, sqF2, sqR1 und sqR2 sind Primer für RT-sqPCR; qF1, qF2, qR1 und qR2 sind Primer für RT-qPCR. (B) und (E) RT-sqPCR Analyse der Zirkularisierungseffizienz von nad5 bzw. nad1 mRNAs. M = DNA-Molekularmarker. (C) und (F) RT-qPCR Analyse der Zirkularisierungseffizienz von nad5 bzw. nad1 mRNAs. Die beiden cDNA-Proben, die von RT1- und RT2-Primern transkribiert werden, werden durch pcR-Produkte sqF2&sqR2 (für RT-sqPCR) oder qF2&qR2 (für RT-qPCR) normalisiert. Die Zirkularisierungseffizienz von nad5 und nad1 mRNAs wird durch den Vergleich der PCR-Produkte von sqF1&sqR1 (für RT-sqPCR) oder qF1&qR1 (für RT-qPCR) geschätzt. circularized/(circularized+linear) = qF1&qR1 über qF2&qR2 in RT2-Reaktion/ qF1&qR1 über qF2&qR2 in RT1-Reaktion. Werte sind Mittelwerte und SDs von drei biologischen Repliken. Um den potentiellen Einfluss durch 5-Triphosphat auszuschließen, wurden die RNAs vor der Selbstligation mit 5"-Polyphosphatase behandelt. Total und Mito = total bzw. mitochondriale RNAs. RT1 und RT2 = cDNAs reverse transscribed by RT1 und RT2 primer, bzw. klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mapping von cox2 mature mRNA termini mit der cRT-PCR-Cased-Strategie. (A) Geltrennung von cox2 cRT-PCR-Produkten. + und - = cDNAs, die aus 5" Polyphosphatase-behandelten bzw. nicht behandelten mitochondrialen RNAs gewonnen werden. Die beiden cDNA-Proben wurden durch Amplifikation von 26S cDNA (26S) normalisiert. Fünf Primer werden für die cRT-PCR-Analyse von kreisförmigen cox2 mRNA verwendet: CF1, CF2 und CF3 sind verschachtelte Primer, und CF2 und CF3 sind 69 bzw. 138 bp nach dem CF1; CR1 und CR2 sind verschachtelte Primer, und CR2 ist 1.288 bp vor CR1. Die mit '1' und '2' gekennzeichneten Bänder wurden sowohl durch CF1&CR1 als auch durch CF2&CR1 verstärkt, während die Bands '3' und '4' durch CF3&CR2 verstärkt wurden. Alle vier Bands wurden durch Klonen sequenziert. Die mit Sternchen gekennzeichneten Bänder konnten nicht wiederholt werden und wurden von den Ergebnissen ausgeschlossen. M = DNA-Molekularmarker. (B) RT-qPCR-Analyse der relativen Häufigkeit von kreisförmigen Cox2 mRNA nach 5' Polyphosphatase-Behandlung. Die beiden cDNA-Proben wurden durch ein Primergemisch mit 26S-CRT, cox2-CRT, nad5-CRT, nad6-CRT, nad7-CRT, nad9-CRT, cob-CRT und cox1-CRT im gleichen Verhältnis synthetisiert, und die cDNA aus 26S reifer rRNA wurde zur Normalisierung verwendet. +/- = Cox2 über 26S in behandelter Probe/Cox2 über 26S in nicht behandelter Probe. Werte stellen Mittelwerte und SD von drei biologischen Repliken dar. Die für RT-qPCR verwendeten Primer sind angegeben. (C) Nördliche Blotanalyse von Cox2-Transkripten. 2 g mitochondriale RNA geladen wurde. Die Bänder, die verschiedenen Isoformen von cox2 mature mRNA entsprechen, sind markiert. (D) Transkript-Termini von cox2 mRNA abgeleitet aus cRT-PCR-Ergebnissen. UTRs und offene Leserahmen werden als fett formatierte Linien bzw. graue Felder angezeigt. Die Positionen von 5' und 3' termini relativ zu AUG (+1) und UAA (-1), und die Anzahl der einzelnen Klone, die an diesen Positionen sequenziert werden, werden angezeigt. Die Positionen der Reverse-Transkriptions- und PCR-Verstärkungsprimer werden als geschlossene bzw. offene Pfeilköpfe angezeigt. Nach außen gerichtete Primer, die für RT-qPCR verwendet werden, werden als offene Quadrate angezeigt, und die Position der Cox2-Sonde ist wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Auswahl positiver Klone, die Cox2-4-Einsätze nach Kolonie PCR enthalten. (A) Kolonie PCR zum Abschirmen einzelner Klone, die Cox2-4 Einsätze enthalten. Die Größe der Cox2-4-Einfügung beträgt etwa 1.165 bp, und die der Vektorsequenzen beträgt 100 bp. Die berechnete Größe der Kolonie-PCR-Produkte beträgt etwa 1.265 bp, und die Klone, die kleine Einsätze enthalten, wurden nicht sequenziert, d. h. die Zahlen 11, 14, 22 und 23. (B) Sequenzierungsergebnisse der in (A) gescreenten positiven Klone. 5'/3' Enden = die 5' und 3' Enden relativ zu AUG (+1) bzw. UAA (-1). Die Sequenzierungsergebnisse der Zahlen 12 und 20 wurden ausgeschlossen, da sie viel kleiner waren als die anderen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| teil | Volumen für 50 l Reaktion (l) | Endgültige Konzentration |
| 10x RNA 5' Polyphosphatase Puffer | 5 | 1x |
| RNase-Inhibitor (40 U/L) | 0,75 | 0,6 U/L |
| Mitochondriale RNA | X | 0,2 g/l |
| RNA 5' Polyphosphatase (20 U/L) | 2,5 | 1 U/L |
| DEPC-behandelte enonisierte H2O | bis zu 50 l | - |
Tabelle 1: Reaktionskomponenten der Polyphosphatase-Behandlung von RNA 5.
| teil | Volumen für 20 L-Reaktion (l) | Endgültige Konzentration |
| 10x T4 RNA Ligase I Puffer | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 m |
| PEG8000 (50%) | 6 | 15% |
| RNA-Inhibitor (40 U/L) | 0,5 | 1 U/L |
| 5' Polyphosphatase-behandelte oder nicht behandelte mitochondriale RNA | X | 0,1 bis 0,2 g/l |
| T4 RNA Ligase I (30 U/L) | 0,4 | 0,6 U/L |
| DEPC-behandelt enonisiert H2O | bis zu 20 l | - |
Tabelle 2: Reaktionskomponenten der mitochondrialen RNA-Zirkularisierung.
| teil | Volumen für 10 l Vormischung (l) |
| Primermischung (1 m insgesamt)a | 2 |
| dNTP-Mischung (je 10 mM) | 1 |
| Zirkulierte 5' Polyphosphatase-behandelte oder nicht behandelte mitochondriale RNAb | X |
| DEPC-behandelte enonisierte H2O | bis zu 10 L |
Tabelle 3: Vormischung für Reverse-Transkriptionsreaktion. a Die Primermischung enthält das gleiche Verhältnis von 26S-CRT und bis zu 7 anderen RT-Primern, und die Endkonzentration beträgt 1 m. bZwei Vormischungen werden nebeneinander hergestellt und enthalten die gleiche Menge (200 ng) von kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten oder unbehandelte mitochondriale RNA.
| teil | Volumen für 20 L-Reaktionssystem (L) | Endgültige Konzentration |
| Vorlage RNA/Primer/dNTP* | 10 | - |
| 5x RTase-Puffer | 4 | 1x |
| RNase-Inhibitor (40 U/L) | 0,5 | 1 U/L |
| RTase (200 U/L) | 1 | 10 U/L |
| DEPC-behandelt enonisiert H2O | bis zu 20 l | - |
Tabelle 4: Reaktionskomponenten der Reverse-Transkription. *Die Vorlage RNA/Primer/dNTP-Vormischungen, die in Schritt 6.3 hergestellt werden.
| teil | Volumen für 20 L-Reaktionssystem (L) | Endgültige Konzentration |
| Deionisiert H2O | 7 | - |
| 2x Reaktionspuffer | 10 | 1x |
| dNTP-Mischung (je 10 mM) | 0,4 | je 0,2 mM |
| 26S-CF1 (10 m) | 0,8 | 0,4 mM |
| 26S-CR1 (10 m) | 0,8 | 0,4 mM |
| Vorlagen cDNA aus kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten oder nicht behandelten RNAs * | 0,6 | - |
| DNA-Polymerase (1 U/L) | 0,4 | 0,02 U/L |
Tabelle 5: Reaktionskomponenten zur PCR-Verstärkung von 26S cDNA. *Zunächst wird für die Normalisierung gleiches Volumen der Vorlage-CDNAs (0,6 l) verwendet. Ändern Sie bei Bedarf die Mengen der Vorlagen-CDNAs, um die gleiche Häufigkeit von 26S PCR-Produkten zwischen den beiden PCR-Reaktionen zu gewährleisten.
| schritt | temperatur | zeit | Zyklusnummer |
| Anfängliche Denaturierung | 95 °C | 3 Min. | 1 Zyklus |
| Denaturierung | 95 °C | 15 Sek. | 22–25 Zyklen |
| Primer glühen | 56 °C | 15 Sek. | |
| anbau | 72 °C | 30 Sek. | |
| Endgültige Verlängerung | 72 °C | 5 Min. | 1 Zyklus |
| halten | 4 °C | ∞ | - |
Tabelle 6: PCR-Bedingungen zur Verstärkung 26S cDNA zur Normalisierung.
| teil | Volumen für 20-L-Reaktionssystem (L) | Endgültige Konzentration |
| Deionisiertes H2O | bis zu 20 l | - |
| 2x Reaktionspuffer | 10 | 1x |
| dNTP-Mischung (je 10 mM) | 0,4 | je 0,2 mM |
| Divergent primer-forward (10 'M) | 0,8 | 0,4 mM |
| Divergent primer-reverse (10 'M) | 0,8 | 0,4 mM |
| Vorlage cDNA aus den kreisförmigen 5' Polyphosphatase-behandelten oder nicht behandelten RNAs * | X | - |
| DNA-Polymerase (1 U/L) | 0,4 | 0,02 U/L |
Tabelle 7: Reaktionskomponenten zur PCR-Verstärkung der kreisförmigen Zieltranskripte. *Das Volumen der in diesen Reaktionen verwendeten Vorlagen-CDNAs wird durch die 26S rRNA-Normalisierungsergebnisse bestimmt.
| schritt | temperatur | zeit | Zyklusnummer |
| Anfängliche Denaturierung | 95 °C | 3 Min. | 1 Zyklus |
| Denaturierung | 95 °C | 15 Sek. | 22-40 Zyklen c |
| Primer glühen a | 50-65 °C | 15 Sek. | |
| Extenstion b | 72 °C | 0.5-1 min | |
| Finatl-Erweiterung | 72 °C | 5 Min. | 1 Zyklus |
| halten | 4 °C | ∞ | - |
Tabelle 8: PCR-Bedingungen zur Verstärkung der Zieltranskripte. a Das exakte Glühen von gemäßigten Temperaturen hängt von der Schmelztemperatur der PCR-Grundierungen ab. b Die Dehnungszeit hängt von der Länge des zu verstärkenden Ziels ab. Empfohlene Zeit beträgt 1 min pro 1 kb des PCR-Fragments. c Im Allgemeinen reichen 30 bis 35 Zyklen aus, um eine ausreichende Menge an PCR-Produkt zu produzieren. Bei niedrigen Häufigkeitstranskripten, erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen bis zu 40 Zyklen.
Abbildung S1: Position der Primer für repräsentative mitochondriale Transkripte von Mais. CRT = Reverse Transkriptionsprimer; CF1, CF2, CR1 und CR2 = divergierende Primer für pcR-Verstärkung; qCF und qCR = Divergentprimer für RT-qPCR. Die Transkript-Termini von Mais nad2-1, rps4-1 und nad4-1 wurden zuvor bestimmt (Zhang et al., 20191). Es werden Positionen von 5'- und 3'-Enden relativ zu AUG (+1) und dem letzten Nukleotid des Stop-Codons (-1) angezeigt. Die Codierungsbereiche und UTRs werden als graue Felder bzw. fett formatierte Linien angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Abbildung S2: Prinzip zur Schätzung der Zirkularisierungseffizienz von nad5 mRNA im Mais. In einer Selbstligationsreaktion wird nur ein Bruchteil der mitochondrialen RNAs zirkularisiert. Um das Verhältnis von circularized nad5 mRNA zu berechnen, werden zwei genspezifische Primer verwendet, um den ersten Strang cDNAs zu synthetisieren, d.h. nad5-RT1 und -RT2. In der Nad5-RT2-Reverse-Transkriptions-Reaktion (RT) werden die PCR-Produkte, die durch sqF2&sqR2 (für RT-sqPCR) und qF2&qR2 (für RT-qPCR) verstärkt werden, sowohl von linearen als auch von &qR1 (für RT-qPCR) PCR-Produkte werden nur aus zirkulierten nad5 abgeleitet; in nad5-RT1-Reaktion konnten alle vier Paare von PCR-Primern beide Formen von nad5verstärken. Um das Verhältnis von zirkulierten nad5 mRNA zu berechnen, werden die beiden Reaktionen durch sqF2&sqR2 oder qF2&qR2 PCR-Produkte normalisiert. Durch den Vergleich der Häufigkeit von sqF1&sqR1 oder qF1&qR1 PCR-Produkten zwischen den beiden RT-Reaktionen wird die Zirkularisierungseffizienz von nad5 mRNA grob geschätzt. ex = exon. Exons und Introns werden als graue Felder bzw. gekrümmte Linien angezeigt. Die Positionen der Primer nad5-RT1 und -RT2 werden durch Pfeile angezeigt. Schwarze Punkte zeigen die Positionen der PCR-Primer an, und die vorhergesagte Größe der PCR-Produkte wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle S1: Primerinformationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In einer früheren Studie wurden totale und mitochondriale RNAs aus der Zellsuspensionskultur von Arabidopsis verwendet, um mitochondriale Transkript-Termini durch cRT-PCR zu kartieren, und ähnliche Ergebnisse wurden12erzielt. Jedoch, nur angereicherte mitochondriale RNA wurde verwendet, um mitochondriale Transkript termini in vielen anderen Studien1,2,3,9. Wir fanden heraus, dass die Anreicherung von mitochondrialer RNA ein wichtiger Schritt für die cRT-PCR-Kartierung von mitochondrialen Transkript-Termini in Mais ist. Nach dieser Anreicherung wird das Verhältnis der zirkulierten mitochondrialen RNA dramatisch von 0,3 % –3,7 % auf 30 % erhöht (Abbildung 3 und Abbildung S2), was die Amplifikation von kreisförmigen Zieltranskripten in einer PCR-Runde ermöglicht.
Die Zirkularisierungseffizienz der mitochondrialen RNA wurde durch RT-PCR-Analyse auf Mais nad1 und nad5geschätzt, die beide durch cis-spleißende Introns in unabhängige Vorläufer unterteilt sind. Da der potenzielle Einfluss durch das Vorhandensein von Vorläufer-RNAs sowie die Variation der RT-Effizienz nicht ausgeschlossen werden konnten, ist dies nur eine grobe Schätzung der realen mitochondrialen RNA-Zirkularisierungseffizienz.
Wir veränderten die Selbstligationsbedingungen, indem wir die Konzentration von mitochondrialer RNA und PEG8000 veränderten und die Inkubationszeit längten, aber diese Veränderungen schienen die Effizienz der mitochondrialen RNA-Zirkularisierung nicht zu beeinflussen. Obwohl wir nicht sicher sind, ob eine weitere Percoll Gradientenreinigung die Zirkularisierungseffizienz erhöhen könnte, ist die Qualität des in Abschnitt 2 hergestellten rohen Mitochondrions gut genug für die cRT-PCR-Kartierung von mitochondrialen Transkripti im Mais. Da mehrere Runden pcRs falsch positive Ergebnisse verursachen können, macht die Verstärkung von Zieltranskripten in einer Runde PCR die Mapping-Ergebnisse zuverlässiger.
Das 5' Triphosphat der primären Transkripte ist instabil, und es könnte aus unbekannten Gründen in 5' Monophosphat umgewandelt werden. Dieses Problem behindert eine klare Unterscheidung zwischen den primären und den verarbeiteten Transkripten, indem Ansätze verwendet werden, die von der Anwesenheit/Abwesenheit von 5' Triphosphat1,2,4abhängen. Die reife Form von Mais 26S rRNA hat ein monophosphatiertes 5' Ende und ist unempfindlich gegen RNA 5' Polyphosphatase. Um den Einfluss der instabilen 5' Triphospahte zu minimieren, wird ausgereifte 26S rRNA verwendet, um die beiden RNA-Proben zu normalisieren, die mit 5' Polyphosphatase behandelt und unbehandelt werden, und es wird gezeigt, dass es ein wichtiger Schritt ist, die beiden Arten von Transkripten in Mais zu unterscheiden. Mitochondrion. Nach der Normalisierung könnten die primären und verarbeiteten Transkripte durch den Vergleich von cRT-PCR- und RT-qPCR-Ergebnissen aus 5' Polyphosphatase-behandelten und nicht behandelten RNA-Proben diskriminiert werden. Die primären Transkripte reagieren empfindlich auf 5' Polyphosphatase und werden stark aus der 5' Polyphosphatase-behandelten Probe verstärkt, jedoch nicht (oder auf einem sehr niedrigen Niveau aufgrund des instabilen 5' Triphosphats) des nicht behandelten Gegenstücks. Im Gegensatz dazu werden die verarbeiteten Transkripte auf vergleichbaren Ebenen zwischen den beiden Proben nachgewiesen.
Bei Pflanzen sind die Transkriptionmuster vieler mitochondrialer Gene ziemlich kompliziert1,2. Zum Beispiel werden die Gene Mais nad6 und atp6 sowohl als Monocistrone als auch als Dicistrone und nad6, atp6und atp6-na6 reife mRNAs zwei, drei bzw. zwei Isoformen exprimiert. Darüber hinaus ist die Transkriptpopulation eines mitochondrialen Gens tatsächlich eine Mischung aus Vorläufer-, Reife- und Abbau-RNAs. PCRs sind anfällig für die Verstärkung kleiner Moleküle, und es ist schwierig, alle Transkriptisoformen mit einem Paar Primer zu erkennen. Daher ist eine RNA-Gelfleck-Hybridisierung erforderlich, um die cRT-PCR-Mapping-Ergebnisse zu überprüfen, und alternative Primer können erforderlich sein, um die Transkripte zu verstärken, die in Northern Blot, aber nicht zum ersten Mal cRT-PCR, nachgewiesen wurden.
Dieses Protokoll enthält einen RT-qPCR-Schritt, um die CRT-PCR-Diskriminierungsergebnisse zu überprüfen. Da die multiplen Isoformen einiger ausgereifter mRNAs in Größe1sehr nahe sind, ist es unmöglich, alle Diskriminierungsergebnisse durch RT-qPCR zu bestätigen, und einige stationäre Transkripte wurden durch den Vergleich der cRT-PCR-Ergebnisse zwischen den behandelten und nicht behandelte RNAs.
In diesem Protokoll wurden die 5' und 3' Termini der Zieltranskripte durch Klonen und Sequenzieren der cRT-PCR-Produkte kartiert und begrenzen die Anzahl der zu sequenzierenden Einzelklone. Als alternative Methode könnten die cRT-PCR-Produkte durch Sequenzierung der nächsten Generation sequenziert werden, die Tausende von Molekülen für einen Satz von stationären Transkripten sequenziert, und die Mapping-Ergebnisse wären genauer.
Neben der Diskriminierung von primären und verarbeiteten 5' Termini durch cRT-PCR und RT-qPCR konnte das Monophosphat 5' termini durch Identifizierung der umgebenden RNA-Sekundärstrukturen1,12bestimmt werden. Es ist allgemein bekannt, dass RNA-Sekundärstrukturen wie tRNA und t-Element die mitochondriale Transkriptendbildung vermitteln könnten, indem sie endonukleolytische Spaltungen von RNase P und/oder RNase Z12,18,19, 20. Daher sollten diese 5' Termini neben tRNA oder t-Element aus der posttranskriptiellen Verarbeitung abgeleitet werden und Monophosphate enthalten.
Durch die Verwendung dieses Protokolls wurde ein großer Teil der stationären Transkripte in Mais mitochondrien1bestimmt. Einige wurden jedoch aus unbekanntem Grund nicht differenziert und/oder kartiert1. Darüber hinaus sind wir der Meinung, dass die Position von 5' Transkript termini besser durch eine Primer-Erweiterungsanalyse bestätigt werden sollte, obwohl sie in diesem Protokoll enthalten ist. Aufgrund des Mangels an experimentellen Daten sind wir nicht sicher, ob diese Strategie für andere Pflanzenarten geeignet ist, wie Reis (Oryza sativa) und Arabidopsis. Neben pflanzlichen Mitochondrien werden sowohl primäre als auch verarbeitete Transkripte in den Plastiden21stabil angesammelt, und es ist ungewiss, ob diese Strategie zur Kartierung und Diskriminierung von Plastid-Transkripten verwendet werden könnte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects of Guangzhou City (Grant-Nr. 201804020015, H.N.) und dem China Agricultural Research System (Grant-Nr. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
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