Summary
円形RT-PCR、定量RT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、ノーザンブロットを組み合わせることで、循環RT-PCRベースの戦略を提示する。このプロトコルには、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるための正規化ステップが含まれており、トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次および処理された転写物を識別およびマッピングするのに適しています。
Abstract
植物ミトコンドリアでは、一部の定常転写物は転写開始(一次転写)に由来する5'三リン酸を有し、他のものは転写後に生成された5'モノリン酸(処理された転写物)を含む。2種類の転写物を区別するために、いくつかの戦略が開発され、それらのほとんどは5'三リン酸の存在/不在に依存しています。しかし、原発5'ターミニーニにおける三リン酸は不安定であり、2種類の転写物の明確な判別を妨げる。トウモロコシミトコンドリオンに安定して蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別してマッピングするために、cRT-PCR、RNA 5'ポリフォシュパターゼ処理、定量的な組み合わせにより、循環RT-PCR(cRT-PCR)ベースの戦略を開発しました。RT-PCR (RT-qPCR)、およびノーザン ブロット。改善として、この戦略は、不安定な5'三リン酸の影響を最小限に抑えるためのRNA正規化ステップを含む。
このプロトコルでは、濃縮されたミトコンドリアRNAは、RNA 5'ポリホスファターゼによって前処理され、5'トリフショファトを一リン酸に変換する。円形化および逆転転写後、5'ポリホスファターゼおよび非処理RNAに由来する2つのcDNは、処理された5'末端を有し、5'ポリホスファターゼに無感覚であるトウモロコシ26S成熟rRNAによって正規化される。正規化後、一次転写物と処理された転写物は、治療されたRNAおよび非処理されたRNAから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR産物を比較することによって判別される。トランスクリプトターミニは、cRT-PCR産物のクローニングとシーケンシングによって決定され、次いでノーザンブロットによって検証されます。
この戦略を用いることで、トウモロコシミトコンドリオンにおける最も定常状態の転写物が決定された。いくつかのミトコンドリア遺伝子の複雑な転写パターンのために、いくつかの定常転写は、北部のブロットで検出されたが、分化および/またはマッピングされなかった。この戦略が他の植物ミトコンドリアまたはプラスティドで定常状態の転写物を差別し、マッピングするのに適しているかどうかは分かりません。
Introduction
植物ミトコンドリアでは、多くの成熟した前駆体RNAが複数のアイソフォームとして蓄積され、定常状態の転写物は5'終端1、2、3の差に基づいて2つのグループに分けることができる。 4.一次転写物は、転写開始に由来する5'三リン酸端を有する。対照的に、処理された転写物は、転写後処理によって生成される5'モノリン酸を持っています。2種類の転写物の判別とマッピングは、転写および転写終了の成熟の基礎となる分子メカニズムを解明するために重要である。
植物ミトコンドリオンの一次転写物と加工トランスクリプトを区別するために、4つの主要な戦略が開発されました。最初の戦略は、5'三リン酸を一リン酸に変換し、一次転写物をRNAリゲスによって円形にすることを可能にするタバコ酸ピロホスファターゼ(TAP)でミトコンドリアRNAを前処理することです。TAP処理および非処理RNAサンプルの転写物の豊富さは、次いで、cDNA端部(RACE)または円形RT-PCR(cRT-PCR)2、3、4の迅速な増幅によって比較される。第2の戦略では、処理された転写物は、まずターミネータ5'-リン酸塩依存性エキノールクレアーゼ(TEX)を使用してミトコンドリアRNAから枯渇し、残された一次転写物はプライマー延長分析5、6によってマッピングされる。.第3の戦略は、グアニルトランスフェラーゼを使用して一次転写物をプレキャップし、その後、トリリン化された5'ターミニの位置は、リボヌクレアーゼまたはS1ヌクレアーゼ保護分析7、8と一緒にプライマー延長によって決定されます 、9.5'三リン酸の有無に応じて異なり、第4の戦略は、インビトロ転写、部位指向変異形成、およびプライマー拡張分析を組み合わせて、形成促進剤を特徴付け、転写を決定する開始サイト8,10,11.これらの戦略を使用することにより、多くの一次および処理された転写物は、植物ミトコンドリアで決定されている。
しかし、いくつかの研究は、一次転写物の5'三リン酸が不安定であり、それらは2、4、12、13の未知の理由で簡単に一リン酸塩に変換されたと報告している。この問題は、5'三リン酸の有無に応じて技術を使用して、2種類の転写物の明確な差別を妨げ、および植物の一次転写と処理された転写物を系統的に区別する以前の努力を妨げるミトコンドリアは失敗した 2,12.
このプロトコルでは、cRT-PCR、RNA 5'ポリホスファターゼ処理、RT-qPCR、およびノーザンブロットを組み合わせて、トウモロコシに安定に蓄積された一次転写物と処理された転写物を系統的に区別する(Zeamays)ミトコンドリオン(図1)。cRT-PCRは、RNA分子の5'および3'四肢の同時マッピングを可能にし、通常、植物2、12、14、15における転写ターミニをマッピングするように適応される。RNA 5' ポリホスファターゼは、三リン酸化された5'テルミニから2つのリン酸塩を除去することができ、これはRNAリガーゼによる自己ライゲーションのために一次転写物を利用できるようにする。以前の研究では、トウモロコシの成熟した26S rRNAが5'終産を処理し、RNA 5'ポリホスファターゼ1、16に対して無感覚であったことが示された。原発5'ターミニニにおける不安定な三リン酸の影響を最小限に抑えるために、5'ポリホスホナーゼ処理および非処理RNAは成熟した26S rRNAによって正規化され、その後、一次および処理された転写物は、2つのRNAサンプルから得られたcRT-PCR産物。cRT-PCR マッピングと判引結果は、それぞれノーザン ブロットと RT-qPCR によって検証されます。最後に、代替プライマーは、cRT-PCRではなく、北部ブロットで検出されたそれらの転写物を増幅するために使用されます。このcRT-PCRベースの戦略を使用することにより、トウモロコシミトコンドリオンのほとんどの定常状態の転写物が区別され、マッピングされた1.
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Protocol
1. プライマーデザイン
- プライマー設計17の一般的な規則に基づいてPCRプライマー設計ソフトウェア(材料の表)を用いた逆転転写(RT)のための遺伝子特異的プライマーを設計する。
注:RTプライマーはターゲットトランスクリプトに非常に特異的であり、一般的にコーディングシーケンスの5'部分(成熟したmRNAおよび前駆体RNA)、または予想される5'終端(18Sおよび26S rRNA)の下流から〜500〜600 ntに固定されています。 - cRT-PCRによって円形転写物を増幅する発散プライマーのペアを設計します。
注:対になった発散プライマーは、円形トランスクリプトの5'-3'接合部に隣接しており、その位置は分析されたターゲットトランスクリプト間で異なります(図S1)。 一部のトランスクリプトには長い UtR があります。たとえば、nad2-1 5' UTR およびrps4-1 3' UTR はそれぞれ 1,985 および 1,826/1,834 nt です。両方のプライマーがコーディング領域に固定されている場合、ターゲットトランスクリプトを増幅することは困難です。対照的に、一部の UtR は短いです。たとえば、nad2 -1 および nad4-1 の 3' A7 は 34/35 と 29-31 nt で、それぞれ1です。ペアリングされたプライマーがコーディングシーケンスから遠く離れている場合、PCRは失敗します。一般に、2組の発散プライマーはターゲットトランスクリプトごとに設計されていますが、トランスクリプトパターンが複雑でUtRが非常に長いペアをマッピングするには複数のペアが必要な場合があります。 - ノーザンブロット用のRNAプローブを調作成するために、収束プライマーのペアを設計します。
注:対になったプライマーは標的遺伝子のコード領域に位置し、PCR産物のサイズは100~1,000bpの範囲でなければなりません。各フォワードプライマーは、得られるプローブ内のベクター配列を最小限に抑えるための制限酵素部位を含める必要があります。
2.トウモロコシ開発カーネルからの原油ミトコンドリオンの調製
- オートクレーブで害虫、モルタル、ガラス漏斗、チューブ、先端を殺菌し、オーブンで乾燥させます。
- 4 °Cまたは氷の上ですべての手順を実行し、すべての溶液を事前に冷却します。
- 抽出バッファー(EB)の100mLを調製し、0.3Mショ糖、5mMピロリン酸、10mMKH2PO4、2mM EDTA、1%[w/v]ポリビニルピロリドン40、1%[w/v]ウシ血清アルブミン、5mM L-システイン、および2mKOHでpH 7.3に調整し、濾過によって殺菌する。
- 0.3Mスクロース、1mM EGTA、および10mM MOPS(3-(N-モルフォリーノ)プロパンスルホン酸からなる100mLの洗浄バッファー(WB)を調製する。NaOHでpH 7.2に調整し、濾過で殺菌します。
注:DEPC処理脱イオン化H2Oを用いてEBおよびWBを調製することが示唆される。 - 受粉(DAP)後11~20日で20gのカーネルを氷の上に置いた50mLチューブに集め、カーネルを予め冷却されたモルタルに移します。
注:トウモロコシカーネルの20gにEBの100 mLの比率を使用してください。 - 各モルタルに10~20mLの冷たいEBを加え、カーネルを完全に粉砕します。
- EBを追加し、2層のフィルタークロス(材料の表)を通して地面組織をフィルタリングします。
- 濾液を8,000 x gで10分間遠心分離し、ペレットを捨てます。
- 上清を新しいチューブに移し、20,000 x gで10分間遠心分離します。
- 上清を注ぎ、6 mL WBでペレットを再中断します。
- サスペンションを5本の1.5mL RNaseフリーチューブに付け、14,000 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、液体窒素中のミトコンドリアペレットを凍結し、-80°Cに保存する。
3. ミトコンドリアRNAの抽出
- 製造の指示に従って市販の試薬(材料の表)でミトコンドリアRNAを抽出します。
注意:この試薬には、フェノールとグアニジンイソチオシアネートが含まれています。ヒュームフードで作業し、ラボコートと手袋を着用してください。 - DEPC処理脱イオン化H2Oで単離されたミトコンドリアRNAを溶解し、分光光度計(材料表)でRNA濃度と純度を推定する。
注:一般に、〜250 μgミトコンドリアRNAは、15-DAPトウモロコシカーネルの20gから得られる。 - 1x TAEバッファー(40mMトリス、20mM酢酸、1mM EDTA)、1.5%アガロース(材料表)、および1x核染色染料(材料表)で構成された1つのアガロースゲルを調調します。
- 10xローディングバッファー(0.5%ブロムフェノールブルー、0.5%キシレンシアノールFF、および50%グリセロール)の適切な容積を追加し、1.5%アガロースゲルにミトコンドリアRNA/ローディングバッファー混合物をロードします。
- ゲルを1x TAEバッファーで20~25分間5~6V/cmで実行し、ゲルドキュメンテーションシステム(材料表)でゲルをイメージングしてミトコンドリアRNAの完全性を評価します。
注:2つの異なるバンド(トウモロコシミトコンドリア26Sおよび18S rRNAの場合は〜3,510および〜1,970 nt)の存在は、無傷のミトコンドリアRNAに対して許容可能な標準である。可能な分解を排除するには、循環RNA調製の複数のステップの間にRNAの完全性を調べるべきである(図2)。
4. RNA 5'ポリホスファターゼ処理
- RNA 5' ポリホスファターゼ (表および材料)処理 (表1) をセットアップし、37 °C で 30~ 60 分間インキュベートします。
- 製造元の指示に従って、RNA精製キット(材料の表)で5'ポリホスファターゼ処理RNAを回収します。
- 手順 3.3 から 3.5 を繰り返します。
5. RNAの円形化
- 5'ポリホスファターゼ処理および非処理ミトコンドリアRNA(表2)の同量を用いて2つの円形化反応を調製し、12〜16時間16°Cで両方の反応をインキュベートする。
- ステップ 4.2 と同じキットを使用して、2 組のセルフ ライゲーション RNA を回復します。
注:なお、ミトコンドリアRNAのほんの一部のみが自己ライゲーションされ、回収されたRNAは線形および円形転写物の混合物となることに留意すべきである。 - 手順 3.3 から 3.5 を繰り返します。
6. 逆転写
- 同じ量の円形5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNA(200 ng)から2組のcDNを合成する。
- 26S-CRTと最大7つの他のRTプライマーの等しい比率を追加することにより、プライマー混合物を調製します。
注:プライマー混合物の最終濃度は1μMでなければなりません。 - 表3に記載されている試薬を組み合わせて2つの前混合物を調製し、65°Cで5分間インキュベートし、氷の上で2分間冷やします。
- 2つのRT反応システム(表4)を組み立て、42°Cで50分間インキュベートします。
- 両方のRT反応を70°Cで5分間加熱し、氷の上で冷やします。
7. 正規化
- 5'ポリホスファターゼ処理または非処理RNAに由来する同じ体積のテンプレートcDNを添加して2つのPCR反応を調製し、円形26S rRNAの5'-3'接点を横切る発散プライマー(すなわち26S-CF1および-CR1)など(表5)。
- 表6に記載の条件下で、熱サイクラー(材料の表)で2つの反応を実行します。
- 1x TAEバッファー、1.0%アガロース、および1x核染色染料で構成された1つのアガロースゲルを準備します。
- 2 μL 10xローディングバッファー(0.5%ブロモフェノールブルー、0.5%キシレンシアノールFF、および50%グリセロール)を2つのPCR製品のそれぞれに加え、ゲルにロードします。
- 1x TAEバッファでゲルを5~6V/cmで30~40分間実行し、ステップ3.5と同じゲルドキュメンテーションシステムを使用して画像を作成します。
- コンピュータソフトウェア(材料表、図4A)を用いて2つのPCR製品の豊富さを比較し、必要に応じてテンプレートcDNAの量を変更して正規化を最適化します。
8. PCR増幅
- 正規化されたcDNの適切な体積と、標的転写物の5'-3'接合部に隣接する発散プライマーのペアを加えることによって、PCR反応のペアを調製する(表7)。
注:標的転写物のPCR増幅に使用されるテンプレートcDNの量は、26S rRNA正規化結果によって決定される。 - 表8に記載のプログラムに従ってPCR反応を実行する。
- 手順 7.3 から 7.5 を繰り返します。
- ネストされた発散プライマーに変更し、手順 8.1 と 8.2 を繰り返して最初のラウンド PCR 結果を確認します。
- 手順 7.3 から 7.5 を繰り返します。
- ゲルDNA回収キット(材料の表)を使用して、2ラウンドのPCR増幅で繰り返すことができる顕著なバンドを回収する。
9. トランスクリプトターミニの決定
- 標準的な技術を使用して、ゲル精製PCR製品を鈍エンドベクター(材料の表)にクローンします。
- コロニーPCRを実行して、ターゲットインサートを含む正のクローンを選択し、それらを商業的に配列します。
注:可変サイズのインサートを含む正のクローンは、植物ミトコンドリアの多くの定常状態転写物が不均一な5'および/または3'終端1、12を有するので、通常、単一の回収されたバンドから検出される。 - バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の基本的な局所アライメント検索ツール(BLAST)を使用して、シーケンシングデータをトウモロコシミトコンドリアゲノムと位置合わせします。微生物を選ぶ「トウモロコシ(タキド:4577)」と検索データベース「ヌクレオチドコレクション(nr/nt)」を選択します。
- 円形トランスクリプトの5'-3'ジャンクションを見つけ、5'と3'トランスクリプトターミニの位置を決定します。
- ターゲットトランスクリプトのサイズを計算します。
10. RNAゲルブロットハイブリダイゼーションによるcRT-PCRマッピング結果の検証
注:RNAゲルブロットハイブリダイゼーションは、ジゴキシゲニン(DIG)およびT7 RNAポリメラーゼを用いたRNAの転写標識用試薬を含む市販キット(材料表)を用いて行われ、ハイブリダイゼーションおよび免疫学的検出が行われる。詳細については、このキットで提供されるプロトコルを参照してください。手順全体に RNase フリー機器のみが使用されていることを確認します。
- RNAプローブを調作成するために使用されるDNA断片を増幅し、挿入部位の上流にT7プロモーター17bpを含むステップ9.1と同じベクターにクローンします。
- 適切な制限酵素を用いて構築物を線形化し、DNA精製キット(材料表)により線形プラスミドを回収し、DEPC処理脱イオン化H2Oに溶解する。
- 製造元の指示に従って、市販キット(材料の表)によってDIG-11-UTPを用いてRNAプローブにラベルを付けます。
- DEPC処理脱イオン化H2 O.をNaOHでpH 7.0に調整し、濾過により殺菌する10x MOPSバッファー(0.2M MOPS、50mM酢酸ナトリウム、および10mM EDTA)の500mLを調製します。
- 2~3体のロードバッファー(50%ホルムアミド、6.2%ホルムアルデヒド、1x MOPS、10%グリセロール、0.1%ブロモフェノールブルー)をステップ3.1~3.3で調製したミトコンドリアRNAに添加します。
- RNAサンプル/ローディングバッファー混合物を65°Cで10分間変性させ、氷上で1分間冷やします。
- 変性アガロースゲル(2%ホルムアルデヒド、1.2%アガロース、および1x MOPS)を調作し、RNAサンプル/ローディングバッファー混合物をゲル(ウェルあたり1-2 μgミトコンドリアRNA)にロードします。
- 約4時間3-4V/cmで1x MOPSでゲルを実行します。
- 20x SSCの2Lを調(3M NaCl、0.3Mク硝酸ナトリウム、pH 7.0)を調出します。一晩0.1%のDEPCでそれを処理し、オートクレーブで殺菌します。
- ゲルを20x SSC(毎回15分)で2回すすぎ、10~16時間20倍のSSCで毛細管転写によりナイロン膜(材料表)にゲルRNAを移します。
- 120°Cで30分間焼いて膜にRNAを固定します。
- 製造元の指示に従って、市販キット(材料の表)を使用してRNAハイブリダイゼーションと免疫学的検出を行います。
11. 一次と処理された5'の終わりの差別
- 一次および処理された5'終了を識別し、正規化された5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNAから得られたcRT-PCR産物を比較することによって終了する。
注:一次転写物に対して、5'ポリホスファターゼ処理RNAからのPCR産物の豊富さは、非処理対応物からのものよりもはるかに高い(図1、'遺伝子A'、および図4A)。しかし、処理された転写物に対しては、同等のレベルのPCR産物が、ミトコンドリアRNAの2組から増幅されるであろう(図1、'Gene B')。 - cRT-PCR マッピング結果に基づいて RT-qPCR プライマーを設計します。
- RT-qPCR による cRT-PCR 判別結果を確認します。
注:5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNAに由来する2つのcDNAサンプルは、26S成熟rRNAのRT-qPCR産物によって正規化される。
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Representative Results
ミトコンドリアRNA循環効率の推定
以前の研究では、合計およびミトコンドリアRNAの両方がアラビドプシスにおけるミトコンドリア転写ターミナのcRT-PCRマッピングに使用され(アラビドプシス・タリアナ)、および2種類のRNAは同様のマッピング結果12を与えた。当初は、トウモロコシのミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングにも合計RNAを用いた。多くの試行の後、ターゲットのトランスクリプトを検出するのは難しいことがわかりました。改善として、トウモロコシの開発カーネルからミトコンドリアRNAを濃縮し、1ラウンドのPCRで循環標的転写物の増幅を可能にしました。
濃縮後の標的転写物の容易な増幅を説明するために、代表的なミトコンドリア遺伝子nad5(図3および図S2)に対してRT-PCRを行うことによりRNA循環効率を推定した。トウモロコシnad5遺伝子には、2つのトランスと2つのシススプライシングイントロンが含まれています。合計およびミトコンドリアRNAの自己ライゲーション後、第1鎖cDNAは、nad5-RT1および-RT2プライマーを用いて独立して合成された。 2つのプライマーは、線形と円形のnad5 mRNA(図S2)の両方を逆に転写することができます。PCR 増幅には、sqF1&sqR1 および sqF2&sqR2 の半期定量 RT-PCR (RT-sqPCR) と qF1&qR1 および qF2&qR2 の RT-qPCR 用の 4 つのペアが使用されます。nad5-RT1 によって転写された cdNA の場合、プライマーの 4 つのペアすべてが円形および線形nad5成熟した mRNA の両方を検出しました。nad5-RT2逆転転写反応については、sqF2&sqR2およびqF2&qR2は両方の形態のmRNAを調査し、sqF1&sqR1およびqF1&qR1 PCR産物は円形nad5のみから導出された。この分析に基づいて、sqF2&sqR2(RT-sqPCR用)およびqF2&qR2(RT-qPCR用)PCR製品を用いてnad5-RT1および-RT2逆転転写反応を正規化し、円形nad5の比率を比較して推定した。 sqF1&sqR1 (RT-sqPCR の場合) または qF1&qR1 (RT-qPCR 用) PCR 製品。自己ライゲーションの前に、RNA 5'ポリホスファターゼによって前処理され、RNAリガーゼによる循環にすべての転写物を利用できるようにしました。RT-sqPCR解析では、総RNAを用いた場合にnad5 mRNAの非常に小さな割合が円形化されたが、濃縮ミトコンドリアRNAを使用した場合に比が劇的に増加した(図3B)。RT-qPCRの結果は、自己リゲーションnad5 mRNAの比率が濃縮後3.7%から32%に増加したことを示した(図3C)。nad1の分析は同様の結果を与え、nad1 mRNAの循環効率は0.7%から30%に増加した(図3D-F)。
これらの分析により、約30%のトウモロコシミトコンドリアRNAが改良後に自己ライゲーションされ、循環効率の向上により、cRT-PCRによる標的転写物の容易な検出が説明されています。
トウモロコシの決定コックス2cRT-PCRベースの戦略を用いてmRNAターミニ
このcox2遺伝子を例に、cRT-PCRベースの戦略を用いてトウモロコシミトコンドリア転写物のマッピングと判別を紹介した(図4)。
cox2 mRNAのマッピングの開始時に、3つの外向きプライマーCF1、CF2、およびCR1が遺伝子コード領域上で設計された(図4D)。CF1 と CF2 は入れ子になったプライマーで、CF2 は CF1 の下流 69 bp でした。ステップ6.1-6.5で合成し、ステップ7.1~7.6で正規化したテンプレートcDNを使用して、CF1&CR1プライマーペアは2つの顕著なバンドを増幅し、増幅結果は入れ子になったプライマーCF2&CR1(図4A)によって繰り返された。さらに、2つのバンドは5'ポリフソファターゼ処理RNAから強く増幅されたが、非処理対応で検出することは困難であったが、RNA 5'ポリソファターゼに敏感であり、一次5'ターミニを持っていることを示唆した。
2つの候補バンドはcox2-1と-2と名付けられ、アガロースゲルから独立して回収され、ベクターにクローン化された。 コロニーPCRの結果は、陽性クローンが可変サイズの挿入物を含み、転写物の不均一な5'および/または3'ターミニを暗示することを示した(図5)。陽性クローンを商業的に配列し、配列データをステップ9.3で説明するようにトウモロコシミトコンドリアゲノムと整列させた。
シーケンスと位置合わせの結果は、2 つのトランスクリプトが 3' 終端で同一であったが、5' UtR の長さが異なっていることを示しました (図 4D)。cox2-1および-2の5'終端は、それぞれAUGの992-1,030および1,276-1,283 nt nt上流で濃縮され、3'末端はストップコドンの下流39ntであった。cRT-PCRの結果から推測すると、cox2-1および-2の計算サイズはそれぞれ1,804-1,832および2,088-2,095 ntであった。
cRT-PCRマッピング結果を検証するために、cox2遺伝子コード領域に由来するプローブを用いてRNAゲルブロットハイブリダイゼーションを行い、cox2-1および-2と同様の大きさの2つの主要バンドを検出した(図4C)。 さらに、北部ブロットでは約2,500と2,800 ntの2つの大きなバンドが検出されたが、cRT-PCRによって増幅されなかった。2つの大きなバンドはそれぞれcox2-3と-4と命名されました。それらをマッピングするために、cox2-2の5'と3'のUtRに固定された別の2つの外向きのプライマー(すなわちCR2とCF3)が設計され、その位置はcox2-3と-4の予想されるトランスクリプトの終端に近かった。 プライマーペアCF3&CR2を用いて、5'ポリフソファターゼ処理RNAに由来するcDNから強く増幅されたが、非処理対応物からは増幅されなかった(図4A)。シーケンス結果は、変数3'が終了する間、それらが同一の5'ターミニを持っていることを示しました。2つの転写物の計算サイズはそれぞれ2,512/2,513と2,833-2,835 ntであり、北部ブロットで検出された2つの大きなバンドと近いサイズであった。さらに、cRT-PCRの結果は、コックス2-3および-4が一次5'ターミニを持つことを示唆した。
判別結果を確認するために、cRT-PCR マッピング結果に従って 5 つの外側向きのプライマーを設計しました。. qCF1、qCF2、qCR1、qCR2、および qCR3、およびプライマーペア qCF1&qCR1、qCF1&qCR2、qCF1&qCR3、および qCF2 を使用しました。cox2-1、-2、-3、-4 の RT-qPCR 分析5'ポリフソファターゼ処理試料中の4つのRT-qPCR産物の相対的な存在量は、cRT-PCR判引結果を確認する非処理対応物のものよりもはるかに高かった。
要約すると、トウモロコシcox2遺伝子の転写パターンは複雑であり、cRT-PCRベースの戦略はcox2 mRNAの複数のアイソフォームを効果的に判別してマッピングする。
図 1: cRT-PCR ベースの戦略の概要cRT-PCR ベースの戦略の主要な手順の図。5'+および5'-=それぞれRNA5'ポリホスファターゼによって処理され、非処理された2つのRNAサンプル。5'ポリホスファターゼ処理および非処理RNAに由来する2つのcDNAサンプルは、トウモロコシの26S成熟rRNAによって正規化され、一次および処理された転写物はcRT-PCR産物を比較することによって判別される。遺伝子Aの場合、5'ポリホスファターゼ処理RNAからのPCR産物の豊富さは、非処理された相手国のそれよりもはるかに高いため、対応するRNAは一次5'末端を有する。遺伝子Bの場合、ミトコンドリアRNAの2組のPCR産物は、対応するRNAの処理された5'終点を暗示し、同等のレベルで増幅される。コーディング領域と UtR は、それぞれ灰色のボックスと太字の線で表されます。CRT = 逆転写のためのプライマー;CF1、CF2、CR1、および CR2 = 円形トランスクリプトの 5'-3' ジャンクションを横切る PCR プライマー;qCF および qCR = RT-qPCR 用の発散プライマー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アガロースゲル電気泳動によるミトコンドリアRNA完全性の評価(A) 15-DAPトウモロコシカーネルから調製したミトコンドリアRNA。M = DNA分子マーカー。(B)5'ポリホスファターゼおよび/またはT4RNAリゲスによる円形化による処理後のカーネルミトコンドリアRNA。5'+=5'ポリホスファターゼによる処理後のミトコンドリアRNA;T4&5'+ = 5'ポリホスファターゼによる処理後のミトコンドリアRNAとT4 RNAリゲスによる円形化;T4&5'- = ミトコンドリアRNAは、循環後のみ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RT-PCRで推定されるnad5およびnad1 mRNAの円化効率。(A)および(D)それぞれnad5およびnad1遺伝子の概略図。 Ex = エキソン。エクソンとイントロンは、それぞれ灰色のボックスと曲線で表示されます。逆転写プライマーRT1およびRT2の位置は矢印で示される。黒い点はPCRプライマーの位置を示し、PCR製品の予測サイズが示されます。sqF1、sqF2、sqR1、および sqR2 は RT-sqPCR のプライマーです。qF1、qF2、qR1、および qR2 は RT-qPCR のプライマーです。(B)および ( E ) それぞれnad5およびnad1 mRNA の循環効率の RT-sqPCR 分析。M = DNA分子マーカー。(C) および (F) それぞれnad5およびnad1 mRNA の循環効率の RT-qPCR 分析。RT1 プライマーと RT2 プライマーによって書き起こされた 2 つの cDNA サンプルは、sqF2&sqR2 (RT-sqPCR 用) または qF2&qR2 (RT-qPCR 用) PCR 製品によって正規化されます。nad5およびnad1 mRNA の循環効率は、sqF1&sqR1 (RT-sqPCR の場合) または qF1&qR1 (RT-qPCR の場合) の PCR 製品を比較して推定します。Rt2 反応/qF1&qR1 に対する qF1&qR1 オーバー qF1&qR1 の循環/(循環+線形) = RT1 反応の qF2&qR2 に対する qF1&qR1。値は、3つの生物学的反復の平均とSDです。5′三リン酸による潜在的な影響を排除するために、RNAは自己ライゲーションの前に5′ポリホスファターゼによって処理された。合計と水戸 =合計およびミトコンドリアRNA、それぞれ。RT1 と RT2 = cDNA は RT1 と RT2 プライマーによって反転され、それぞれこの図の大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
図4:cRT-PCRケース戦略を用いたcox2成熟mRNAターミニのマッピング(A) cox2 cRT-PCR製品のゲル分離。+ および - = cDNA は、それぞれ 5' ポリホスファターゼ処理および非処理ミトコンドリア RNA に由来します。2つのcDNAサンプルは、26S cDNA(26S)の増幅により正規化した。円形cox2 mRNA の cRT-PCR 解析には 5 つのプライマーが使用されます: CF1、CF2、および CF3 はネストされたプライマーであり、CF2 と CF3 はそれぞれ CF1 の 69 bp および 138 bp 下流です。CR1 および CR2 はネストされたプライマーで、CR2 は CR1 の上流 1,288 bp です。「1」と「2」で示されるバンドはCF1&CR1とCF2&CR1の両方で増幅され、「3」と「4」のバンドはCF3&CR2によって増幅された。4つのバンドはすべてクローンによってシーケンスされた。アスタリスクでマークされたバンドは繰り返されず、結果から除外されました。M = DNA分子マーカー。(B) 5'ポリホスファターゼ処理後の円形cox2 mRNAの相対的な存在量のRT-qPCR分析。 2つのcDNAサンプルを26S-CRT、cox2-CRT、nad5-CRT、nad6-CRT、nad7-CRT、nad9-CRT、cob-CRT、cob-CRT、およびcox1-CRT等比で含有するプライマー混合物により合成し、26S成熟rRNAに由来するcDNAを正規化に用いた。+/- = cox2 over 26S の処理サンプル/cox2 オーバー 26S の非処理サンプル。 値は、3つの生物学的反復の平均とSDを表す。RT-qPCR に使用されるプライマーが示されます。(C) cox2転写物のノーザンブロット分析。2 μgミトコンドリアRNAをロードした。cox2成熟mRNAの異なるアイソフォームに対応するバンドがマークされている。(D) cRT-PCR結果から推測したcox2 mRNAの転写ターミニ。 UtR と開いている読み取りフレームは、それぞれ太字の線と灰色のボックスで表示されます。AUG(+1)とUAA(-1)に対する5'と3'ターミニの位置と、それらの位置で配列された単一クローンの数が示されます。逆転写およびPCR増幅プライマーの位置は、それぞれ閉じた矢印ヘッドと開いた矢印ヘッドとして示される。RT-qPCRに使用される外向きのプライマーはオープンスクエアとして示され、cox2プローブの位置は示されているとおりです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:コロニーPCRによるcox2-4挿入物を含む正のクローンの選択。 (A) cox2-4 インサートを含む単一クローンをスクリーニングするコロニーPCR。cox2-4インサートのサイズは約1,165 bpで、ベクトル配列のサイズは100bpです。コロニーPCR産物の計算サイズは約1,265bpであり、小さなサイズの挿入物を含むクローンは配列されなかった、すなわち、数11、14、22、および23。(B) (A)でスクリーニングした陽性クローンのシーケンシング結果。5'/3' の終わり = 5' と 3' は、それぞれ AUG (+1) と UAA (-1) を基準にして終了します。数字 12 と 20 のシーケンス結果は、他の数値よりもはるかに小さいため除外されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | 50 μL反応量(μL) | 最終濃度 |
| 10x RNA 5' ポリホスファターゼバッファー | 5 | 1x |
| RNase阻害剤(40 U/μL) | 0.75年 | 0.6 U/μL |
| ミトコンドリア RNA | X | 0.2 μg/μL |
| RNA 5' ポリホスファターゼ (20 U/μL) | 2.5年 | 1 U/μL |
| DEPC処理脱イオン化H2O | 50 μL まで | - |
表1:RNA5'ポリホスファターゼ処理の反応成分。
| コンポーネント | 20 μL反応の体積(μL) | 最終濃度 |
| 10x T4 RNA リゲス I バッファー | 2 | 1x |
| dATP (1 mM) | 1 | 50 μM |
| ペグ8000 (50%) | 6 | 15パーセント |
| RNA阻害剤(40U/μL) | 0.5年 | 1 U/μL |
| 5' ポリホスファターゼ処理または非処理ミトコンドリア RNA | X | 0.1~0.2 μg/μL |
| T4 RNA リゲス I (30 U/μL) | 0.4年 | 0.6 U/μL |
| DEPC処理脱イオン化H2O | 20 μL まで | - |
表2:ミトコンドリアRNA循環の反応成分。
| コンポーネント | 10 μL前混合物の容積(μL) |
| プライマー混合物(合計1μM) | 2 |
| dNTP混合物(各10mM) | 1 |
| 円形 5' ポリホスファターゼ処理または非処理ミトコンドリア RNAb | X |
| DEPC処理脱イオン化H2O | 10 μL まで |
表3:逆転写反応のための前混合物。a.プライマー混合物は26S-CRTと最大7つの他のRTプライマーの等しい比率を含み、最終的な濃度は1 μM.b 2つの前混合物が並んで調製され、それらは円形5'ポリホスファターゼ処理または同じ量(200 ng)を含有する。非処理ミトコンドリアRNA。
| コンポーネント | 20 μL反応システムの体積(μL) | 最終濃度 |
| テンプレート RNA/プライマー/dNTP* | 10歳 | - |
| 5x RTaseバッファ | 4 | 1x |
| RNase阻害剤(40 U/μL) | 0.5年 | 1 U/μL |
| RTase (200 U/μL) | 1 | 10 U/μL |
| DEPC処理脱イオン化H2O | 20 μL まで | - |
表4:逆転写の反応成分。*ステップ6.3で調製されたテンプレートRNA/プライマー/dNTPプリミックス。
| コンポーネント | 20 μL反応システムの体積(μL) | 最終濃度 |
| ディイオン化 H2O | 7 | - |
| 2x反応バッファー | 10歳 | 1x |
| dNTP混合物(各10mM) | 0.4年 | 各 0.2 mM |
| 26S-CF1 (10 μM) | 0.8年 | 0.4 mM |
| 26S-CR1 (10 μM) | 0.8年 | 0.4 mM |
| 円形5'ポリホスファターゼ処理または非処理RNAに由来するテンプレートcDNA * | 0.6年 | - |
| DNAポリメラーゼ(1 U/μL) | 0.4年 | 0.02 U/μL |
表5:26S cDNAのPCR増幅用反応成分。*当初は、正規化に同量のテンプレートcDN(0.6 μL)を使用します。必要に応じて、テンプレート cDN の量を変更して、2 つの PCR 反応間で同じ 26S PCR 製品を確保します。
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル番号 |
| 初期の非核化 | 95 °C | 3 分 | 1 サイクル |
| 変性 | 95 °C | 15秒 | 22~25サイクル |
| プライマーアニーリング | 56 °C | 15秒 | |
| 拡張子 | 72 °C | 30秒 | |
| 最終拡張子 | 72 °C | 5 分 | 1 サイクル |
| 保持 | 4 °C | ∞ | - |
表 6: 増幅する PCR 条件26上cDNAを正規化します。
| コンポーネント | 20μL反応システムの体積(μL) | 最終濃度 |
| 脱イオン化されたH2O | 20 μL まで | - |
| 2x反応バッファー | 10歳 | 1x |
| dNTP混合物(各10mM) | 0.4年 | 各 0.2 mM |
| 発散プライマーフォワード(10 μM) | 0.8年 | 0.4 mM |
| 発散プライマーリバース(10 μM) | 0.8年 | 0.4 mM |
| 円形5'ポリホスファターゼ処理または非処理RNAに由来するテンプレートcDNA * | X | - |
| DNAポリメラーゼ(1 U/μL) | 0.4年 | 0.02 U/μL |
表7:循環標的転写物のPCR増幅用反応成分。*これらの反応で使用されるテンプレートcDNの体積は、26S rRNA正規化結果によって決定される。
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル番号 |
| 初期の非核化 | 95 °C | 3 分 | 1 サイクル |
| 変性 | 95 °C | 15秒 | 22-40 サイクルc |
| プライマーアニーリング | 50-65 °C | 15秒 | |
| 拡張b | 72 °C | 0.5-1 分 | |
| フィナトル拡張 | 72 °C | 5 分 | 1 サイクル |
| 保持 | 4 °C | ∞ | - |
表8:対象転写物を増幅するPCR条件。a.正確なアニーリング温帯は、PCRプライマーの融解温度に依存します。b伸び時間は、増幅されるターゲットの長さに依存します。推奨時間は、PCR フラグメントの 1 kb あたり 1 分です。c一般に、30〜35サイクルは、十分な量のPCR製品を生成するのに十分である。低い豊富な転写物の場合は、サイクルの数を最大 40 サイクルに増やします。
図S1:代表的なトウモロコシミトコンドリア転写物のプライマーの位置。CRT = 逆転写プライマー;CF1、CF2、CR1、CR2 = PCR増幅用発散プライマー。qCF および qCR = RT-qPCR 用の発散プライマー。トウモロコシnad2-1、rps4-1、およびnad4-1の転写ターミナニは以前に決定されている(Zhang et al., 2019 1)。AUG(+1)に対する5'-および3'終端の位置とストップコドン(-1)の最後のヌクレオチドが示されている。コーディング領域と UtR は、それぞれ灰色のボックスと太字の線で示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図S2:トウモロコシにおけるnad5 mRNAの循環効率を推定する原理。自己ライゲーション反応では、ミトコンドリアRNAのほんの一部のみが円形化される。円形nad5 mRNAの比率を計算するために、2つの遺伝子特異的プライマーが最初の鎖cDNA、すなわちnad5-RT1および-RT2を合成するために使用される。 nad5-RT2 逆転写(RT)反応では、sqF2&sqR2(RT-sqPCR用)およびqF2&qR2(RT-qPCR用)によって増幅されたPCR製品は、線形および円形nad5の両方から派生し、sqF1&sqR1(RT-sQPC1の場合)は、sqF1&sqPc1の両方から導き出されます。&qR1 (RT-qPCR の場合) PCR 製品は、循環nad5のみから派生します。nad5-RT1反応では、PCRプライマーの4組すべてがnad5の両方の形態を増幅することができた。円形nad5 mRNAの比率を計算するために、2つの反応はsqF2&sqR2またはqF2&qR2 PCR産物によって正規化される。2つのRT反応の間にsqF1&sqR1またはqF1&qR1 PCR1産物の豊富さを比較することにより、nad5 mRNAの循環効率が大まかに推定される。ex = exon.エクソンとイントロンは、それぞれ灰色のボックスと曲線で表示されます。nad5-RT1 および -RT2 プライマーの位置は矢印で示されます。黒い点はPCRプライマーの位置を示し、PCR製品の予測サイズが示されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 S1: プライマー情報。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
以前の研究では、アラビドプシスの細胞懸濁培養物からの合計およびミトコンドリアRNAをcRT-PCRによるミトコンドリア転写テルミニーニのマッピングに使用し、同様の結果が12を得た。しかし、他の多くの研究1、2、3、9においてミトコンドリア転写テルミニをマッピングするために濃縮されたミトコンドリアRNAのみが使用された。ミトコンドリアRNAの濃縮は、トウモロコシにおけるミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングの重要なステップであることがわかった。この濃縮後、循環ミトコンドリアRNAの比率が0.3%~3.7%から~30%(図3、図S2)に劇的に増加し、1ラウンドのPCRで円形標的転写物の増幅が可能になります。
ミトコンドリアRNAの循環効率は、トウモロコシnad1およびnad5に関するRT-PCR分析によって推定され、いずれもシス-スプライシングイントロンによって独立した前駆体に分けられる。前駆体RNAの存在による潜在的な影響とRT効率の変動を排除できなかったため、これは実際のミトコンドリアRNA循環効率の大まかな推定に過ぎません。
ミトコンドリアRNAとPEG8000の濃度を変化させ、インキュベーション時間を延長することで自己ライゲーション条件を変更しましたが、これらの変化はミトコンドリアRNAの循環効率に影響を与えなかったようです。さらにPercoll勾配精製が循環効率を高めることができるかどうかはわかりませんが、セクション2で調製した粗ミトコンドリオンの品質は、トウモロコシのミトコンドリア転写ターミニのcRT-PCRマッピングに十分です。複数回のPCRが誤検知の結果を引き起こす可能性があるため、1ラウンドPCRでターゲット転写物を増幅すると、マッピング結果の信頼性が向上します。
一次転写物の5'三リン酸は不安定であり、未知の理由で5'モノリン酸に変換することができる。この問題は、5'三リン酸1、2、4の有無に応じてアプローチを使用することにより、一次転写と処理された転写物の明確な区別を妨げる。トウモロコシ26S rRNAの成熟形態は、単リン酸5'末端を有し、RNA 5'ポリホスファターゼに対して無感覚である。不安定な5'トリポスパウトの影響を最小限に抑えるために、成熟した26S rRNAは2つのRNAサンプルを正常化するために使用され、5'ポリホスファターゼによって処理され、未処理であり、トウモロコシの2種類の転写物を区別するための重要なステップであることが示されている。ミトコンドリア。正常化後、5'ポリホスファターゼおよび非処理RNAサンプルから得られたcRT-PCRおよびRT-qPCR結果を比較することによって、一次転写物および処理された転写物を判別することができた。一次転写物は5'ポリホスファターゼに敏感であり、それらは5'ポリホスファターゼ処理されたサンプルから強く増幅されるが、非処理された相手から(または不安定な5'三リン酸による非常に低いレベルで)。対照的に、処理された転写物は2つのサンプル間で同等のレベルで検出される。
植物では、多くのミトコンドリア遺伝子の転写パターンはかなり複雑な1,2である。例えば、トウモロコシnad6およびatp6遺伝子は、モノシストロンとディシストロンの両方として発現され、nad6、atp6、およびatp6-na6-na6成熟mRNAはそれぞれ2つ、3つ、および2つのアイソフォームを持つ。 さらに、1つのミトコンドリア遺伝子の転写集団は、実際には前駆体、成熟、および分解RNAの混合物である。PCRは小さいサイズの分子を増幅する傾向があり、1組のプライマーを使用してすべての転写アイソフォームを検出することは困難です。したがって、cRT-PCRマッピング結果を検証するためにRNAゲルブロットハイブリダイゼーションが必要であり、代替プライマーは、北部ブロットで検出された転写物を増幅する必要があり、初めてcRT-PCRによっては増幅されない場合があります。
このプロトコルには、cRT-PCR 判別結果を検証するための RT-qPCR ステップが含まれています。一部の成熟したmRNAの複数のアイソフォームはサイズ1に非常に近いため、RT-qPCRによるすべての判引結果を確認することは不可能であり、一部の定常転写は、治療されたcRT-PCR結果を比較することによって決定された。および非処理の RNA のみ。
このプロトコルでは、ターゲットトランスクリプトの5'および3'ターミニは、cRT-PCR産物のクローン作成とシーケンスによってマッピングされ、シーケンスされる単一クローンの数を制限する。別の方法として、cRT-PCR産物は次世代シーケンシングによって配列し、定常状態転写物の1セットに対して何千もの分子を配列することができ、マッピング結果はより正確になります。
cRT-PCRおよびRT-qPCRによる一次および処理された5'テルミニの判分に加えて、単リン酸5'テルミニは、周囲のRNA二次構造1、12の同定によって決定され得る。tRNAやt-元素などのRNA二次構造が、RNase Pおよび/またはRNase Z 12、18、19の内核溶解切断を指示することによってミトコンドリア転写物形成を媒知することができることはよく知られている。 20.したがって、tRNAまたはt-要素に隣接する5'ターミニは、転写後処理から導出され、単リン酸塩を含むべきである。
このプロトコルを使用することにより、定常状態の転写物の大部分はトウモロコシミトコンドリア1で決定されている。しかし、一部の人は区別されず、不明な理由でマッピングされませんでした1.さらに、このプロトコルには含まれていますが、プライマー拡張分析によって5'トランスクリプトターミニの位置を確認する方が良いと考えています。実験データが不足しているため、この戦略が米(オリザサティバ)やアラビドプシスなどの他の植物種に適しているかどうかはわかりません。植物ミトコンドリアに加えて、一次転写と処理された転写物の両方がプラスティド21に安定して蓄積され、この戦略がプラスティッド転写物のマッピングと判別に使用できるかどうかは不明である。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第31600250号、Y.Z.)、広州市科学技術プロジェクト(助成金第201804020015号、H.N.)、中国農業研究システム(助成金なし)によって支援されました。CARS-04-PS09,H.N.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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