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Cancer Research

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.

Abstract

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una piccola popolazione con auto-rinnovamento e plasticità che sono responsabili della tumoralgenesi, resistenza al trattamento e malattia ricorrente. Questa popolazione può essere identificata da indicatori di superficie, attività enzimatica e un profilo funzionale. Questi approcci di per sé sono limitati, a causa dell'eterogeneità fenotipica e della plasticità del CSC. Qui aggiorniamo il protocollo di formazione delle sfere per ottenere sfere CSC da tumori al seno e ginecologici, valutando le proprietà funzionali, i marcatori CSC e l'espressione proteica. Le sfere sono ottenute con semina unicellulare a bassa densità nella coltura delle sospensioni, utilizzando un mezzo di metilcellulosa semi-solido per evitare migrazioni e aggregati. Questo protocollo redditizio può essere utilizzato nelle linee cellulari del cancro, ma anche nei tumori primari. La coltura tridimensionale di sospensioni non aderenti pensa di imitare il microambiente tumorale, in particolare la nicchia CSC, è completata da un fattore di crescita epidermico e da un fattore di crescita fibroblasto di base per garantire la segnalazione CSC. Con l'obiettivo di un'identificazione robusta del CSC, proponiamo un approccio complementare, che combina la valutazione funzionale e fenotipica. Capacità di formazione della sfera, auto-rinnovamento e area di proiezione della sfera stabiliscono le proprietà funzionali del CSC. Inoltre, la caratterizzazione comprende la valutazione della citometria di flusso dei marcatori, rappresentata da CD44-/CD24- e CD133 e Western blot, considerando ALDH. Il protocollo presentato è stato ottimizzato anche per i campioni di tumore primario, seguendo una procedura di digestione dei campioni, utile per la ricerca traslazionale.

Introduction

Le popolazioni di cancro sono eterogenee, con cellule che presentano diverse morfologie, proliferazione e capacità di invasione, a causa dell'espressione genica differenziale. Tra queste cellule, esiste una popolazione minoritaria chiamata cellule staminali tumorali (CSC)1, che hanno la capacità di auto-rinnovamento, ricapitolando l'eterogeneità della nicchia tumorale primaria e producendo progenitori aberranti che non rispondono adeguatamente ai controlli omeostatici2. Le proprietà CSC possono essere tradotte direttamente nella pratica clinica, data l'associazione con eventi, come la tumorigenicità o la resistenza alla chemioterapia3. L'identificazione del CSC può portare allo sviluppo di terapie mirate che possono includere il blocco dei marcatori di superficie, la promozione della differenziazione del CSC, il blocco dei componenti del percorso di segnalazione CSC, la distruzione di nicchia e i meccanismi epigenetici4.

L'isolamento del CSC è stato eseguito nelle linee delle cellule e nei campioni di tumori primari5,6,7,8. Il profilo funzionale descritto per il CSC include la capacità clonogenica, la popolazione laterale e la formazione della tumorosfera9. Il fenotipobasso CD44alto/CD24 è stato costantemente associato al CSC al seno, che si è dimostrato cancerogeno in vivo ed è già stato associato con la transizione epiteliale a mesenchymic5,10. Alta attività ALDH è stata anche associata con stelo ed epiteliale alla transizione mesenchymica (EMT) in diversi tipi di tumori solidi11. Espressione ALDH è stata associata con resistenza alla chemioterapia e al fenotipo CSC in vitro12,13,14,15,16. Diversi altri marcatori sono stati collegati alle proprietà CSC in diversi tipi di tumori, come CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 e altri, come descritto nella tabella 1.

Le sfere tumorali consistono in un modello tridimensionale per lo studio e l'espansione del CSC. In questo modello, le sospensioni cellulari da linee cellulari e da campioni di sangue o tumore sono coltivati in un mezzo integrato con fattori di crescita, vale a dire fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF), senza siero bovino fetale e in condizioni non aderenti17. L'inibizione dell'adesione cellulare provoca la morte da parte di anoikis di cellule differenziate18. Le sfere derivano dalla crescita clonale di una cellula isolata. A tale scopo, le celle sono distribuite a bassa densità per evitare la fusione cellulare el'aggregazione 19. Un'altra strategia include l'uso di metilcellulosa semisolida20.

Il protocollo di formazione a sfera ha guadagnato popolarità nell'isolamento e nell'espansione del CSC, a causa dei tempi e dei costi e dei motivi tecnici, redditizi e riproducibili21,22. Nonostante alcune riserve sull'estensione di quale formazione di sfera rifletta il CSC, vi è una propensione delle cellule staminali a crescere in condizioni non aderenti con il caratteristico fenotipo, che assomiglia al microambiente nativo21. Nessuno dei metodi disponibili per l'isolamento del CSC dai tumori solidi ha una completa efficienza, evidenziando l'importanza di sviluppare marcatori più specifici o combinazioni di metodologie e marcatori.

In questo protocollo, dettagliamo l'isolamento del CSC con il protocollo di formazione della sfera, con il principio della crescita a singola cellula in condizioni non aderenti e la capacità di produrre un fenotipo differenziato. Una rappresentazione schematica di questa procedura è rappresentata nella Figura 1. Descriviamo anche la caratterizzazione con marcatori di superficie ed espressione ALDH per CSC, sia per le linee di cellule tumorali mammarie e ginecologiche e campioni di tumori primari.

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Protocol

Questo protocollo è stato eseguito in conformità con le linee guida etiche dell'Ospedale di Coimbra e della Banca del tumore dell'Università (CHUC) ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Salute del CHUC e dalla Commissione nazionale portoghese per la protezione dei dati.

1. Protocollo di formazione delle sfere e popolazioni derivate di aderenti da colture cellulari continue

NOTA: eseguire tutte le procedure in condizioni sterili rigorose.

  1. Preparazione di flaconi o piastre di coltura sospese non aderenti ricoprendo la superficie di crescita con poli(2-hydroxyethyl-methacrylate (poly-HEMA)
    1. Preparare una soluzione da 15 mg/mL mescolando poli-HEMA in etanolo assoluto a 65 gradi centigradi. Fiasche o piastre di coltura delle cellule di cappotto con 50 l/cm2.
    2. Lasciare asciugare a 37 gradi centigradi in un forno di essiccazione. Se necessario, avvolgere le piastre e conservarle a temperatura ambiente.
  2. Preparazione dei mezzi di coltura della sfera (SCM)
    1. Preparare una soluzione del 2% di metilcellulosa in acqua ultrapura e sterilizzare nell'autoclave. La metilcellulosa tende ad essere più facile da solubilizzare mediante raffreddamento; quindi disperdere la polvere in acqua a 80 gradi centigradi e mescolare fino a raffreddare23.
    2. Preparare una soluzione concentrata due volte di SCM (soluzione stock). La soluzione di lavoro SCM contiene DMEM-F12, integrata con putrescine 100 mM, 1% di insulina, transferrina, selenio e 1% soluzione antibiotico-antimicotico (10.000 U/mL penicillina, 10 mg/mL streptomycin e 25 g/mL ancolarica B).
    3. Per preparare il sCM, mescolare volumi uguali della soluzione stock SCM con la soluzione 2% di metilcellulosa.
    4. Completare il mezzo immediatamente prima dell'uso aggiungendo 10 fattore di crescita epidermica ng/mL (EFG) e 10 fattore di crescita del fibroblasto di base ng/mL (bFGF).
    5. Se sono in uso linee cellulari più fastidiose, integrare il mezzo con 0.4% siero bovino albumin, che potrebbe essere un vantaggio.
  3. Inizia con un pallone di cancro al seno MCF7 o HCC1806 o ECC-1 o RL95-2 cellule tumorali (o altra linea cellulare del cancro di scelta) con una confluenza tra l'80% e il 90%.
  4. Eliminare i mezzi di coltura cellulare, lavare con la soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) e staccare le cellule con trypsin-EDTA (da 1 a 2 mL per un flacone di coltura cellulare 75 cm2).
  5. Aggiungere i mezzi di coltura cellulare (da 2 a 4 mL per una fiaschetta di coltura cellulare 75 cm2) e centrifugare a 200 x g per 5 min per scartare gli enzimi.
  6. Sospendere il pellet in un volume noto di coltura cellulare media e pipetta su e giù per garantire una sospensione a singola cella. A tale scopo, è possibile utilizzare un colino cellulare da 40 m.
  7. Contare le cellule nell'emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare della sospensione cellulare. Approfitta di questo passaggio per garantire l'osservazione di una sospensione a cella singola. Un attento conteggio cellulare è essenziale per quantificare con precisione gli effetti dei trattamenti.
  8. Sospendere la quantità determinata di sospensione cellulare nel mezzo completo SCM e trasferire a piatti rivestiti poli-HEMA. Come valore di riferimento per la densità di seeding, considerare da 500 a 2000 celle/cm2.
    NOTA: l'ottimizzazione della densità di semina e del tempo di coltura per ogni linea cellulare è altamente raccomandata24.
  9. Incubare a 37 e 5% CO2 per 2 giorni senza disturbare le piastre.
  10. Ristabilire la concentrazione dei fattori di crescita aggiungendo 10 ng/mL EFG e 10 ng/mL bFGF ai mezzi di coltura cellulare. Ripetere questo passaggio ogni due giorni.
  11. Incubare a 37 s e 5% CO2 fino a 5 giorni dopo la placcatura (questo può variare da 3 a 12 giorni a seconda della linea cellulare) per ottenere sfere, che presentano la morfologia delle colonie cellulari a forma di palla sospensione.
  12. Utilizzare o raccogliere le sfere, pipettando, per gli esperimenti.
  13. Per ottenere popolazioni aderenti derivate, posizionare le sfere in condizioni di coltura standard, a prescissione della linea cellulare utilizzata. Da 1 a 2 giorni dopo, è possibile osservare un monostrato di cellule che crescono intorno a sfere aderenti, che presenta una morfologia simile alla linea cellulare di origine.

2. Protocollo di formazione delle sfere da campioni di tumore umano

NOTA: L'uso di campioni umani a fini di ricerca deve essere conforme alla legislazione di ciascun paese e deve essere approvato dal Comitato Etico delle istituzioni coinvolte.

  1. Preparare il supporto di trasporto contenente DMEM/F12, integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e una soluzione antimicotica antibiotica del 2% (10.000 U/mL penicillina, 10 mg/mL streptomicina e 25 g/mL di anforterica B).
  2. Preparare il supporto per la digestione contenente DMEM/F12, integrato con 10% FBS, 1% soluzione antimicotica antibiotica, 1 mg/mL di tipo IV collagenase e 100 g/mL DNAse I.
  3. Preparare il supporto di inattivazione enzimatica contenente DMEM/F12, integrato con 10% FBS e 1% di soluzione antibiotico-antimycotica (10.000 U/mL penicillina, 10 mg/mL streptomicina e 25 g/mL anforcumrica B).
  4. Preparare il file SCM come descritto nella sezione 1.2.
  5. Ottenere il campione durante lo studio macroscopico del pezzo operativo il più presto possibile dopo la rimozione chirurgica.
  6. Collocare i campioni nel supporto di trasporto e trasferirli in laboratorio per la lavorazione. L'elaborazione del campione deve iniziare entro 1 h dopo la raccolta per migliorare la percentuale di successo della procedura. Prestare attenzione nella raccolta di esempi. Maneggiare i campioni con attenzione. Evitare l'uso di zone necrotiche o cauterizzate.
  7. Sotto la camera di flusso sterile, trasferire il campione in un piatto e tagliare a pezzi più piccoli (circa 1 mm3) con un bisturi.
  8. Incubare il tessuto umano in un tubo con supporti di digestione in uno shaker rotante fino a 180 min, a 37 gradi centigradi. Identificare questo tubo come tubo A.
  9. Sostituire la soluzione enzimatica ogni 15 min.
    1. Raccogliere il supporto di digestione (senza rimuovere alcun frammento di tessuto) e trasferirlo attraverso un colino cellulare di 40 m in un nuovo tubo mezzo pieno di mezzi di inattivazione enzimatica. Mantenere questo tubo a temperatura ambiente e identificarlo come tubo B.
    2. Aggiungete un nuovo supporto di digestione al tubo A e riportatelo allo shaker rotante a 37 gradi centigradi.
    3. A ogni raccolta, controllare la fattibilità delle celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan.
    4. Ripetere questa procedura per 180 min o fino a quando il numero di celle è significativamente inferiore.
  10. Incubare i frammenti di tessuto nel tubo A in una seconda soluzione di digestione contenente parti uguali di accutasi e tripsina-EDTA, mescolando per 10 min a 37 gradi centigradi.
  11. Aggiungere il supporto di inattivazione enzimatica al tubo A e filtrare il contenuto attraverso un colino cellulare di 40 m nel tubo B.
  12. Centrifugare la sospensione cellulare nel tubo B a 200 x g per 10 min.
  13. Sospendere il pellet in SCM e controllare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro.
  14. Sospendere la quantità determinata di sospensione cellulare in SCM e trasferire a piatti rivestiti poli-HEMA (vedere il punto 1.1) con una densità di semina di 4000 celle/cm2.
  15. Incubare a 37 e 5% CO2 per 2 giorni senza disturbare le piastre.
  16. Ristabilire la concentrazione dei fattori di crescita aggiungendo 10 ng/mL EFG e 10 ng/mL bFGF ai mezzi di coltura cellulare.
    NOTA: è necessario eseguire questa operazione ogni due giorni.
  17. Incubare a 37 s e 5% CO2 fino a 5 giorni dopo la placcatura (questo può variare fino a 12 giorni) per ottenere sfere, che presentano la morfologia delle colonie cellulari a forma di palla sospensione.

Figure 1
Figura 1: Ottenere cellule staminali tumorali da campioni di tumore endometriale umano (A) e linee cellulari del cancro al seno e ginecologico (B). I campioni di tumore umano sono frammentati, enzimaticamente digeriti e placcati nel mezzo di coltura in sfera in piatti rivestiti poli-HEMA. Le linee cellulari del cancro vengono staccate, le sospensioni cellulari vengono contate e le singole cellule vengono distribuite a bassa densità in piastre rivestite poli-HEMA in condizioni appropriate. Le sfere ottenute, quando poste in condizioni di cultura aderenti, producono popolazioni aderenti derivate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Capacità di formazione della sfera, autorinnovamento e area di proiezione della sfera

NOTA: La capacità di formazione delle sfere è la capacità di una popolazione di cellule tumorali di produrre sfere. L'autorinnovamento è la capacità delle cellule sfere di produrre nuove colonie di cellule sferiche in sospensione. L'area di proiezione della sfera è rappresentativa dell'area occupata dalla sfera e quindi espressiva delle loro dimensioni e del numero di divisioni cellulari subite in un certo periodo di tempo.

  1. Determinazione della capacità di formazione della sfera
    1. Dopo aver completato il protocollo di formazione della sfera, raccogliere le sfere in un tubo di centrifuga e centrifugare a 125 x g per 5 min.
    2. Eliminare il SCM e sospendere delicatamente il pellet in un volume noto di supporti freschi. Con l'obiettivo di concentrare le sfere per facilitare il conteggio, sospendere le sfere in un piccolo volume di media. Fare attenzione a non disturbare le sfere.
    3. Utilizzare un emocitometro per contare le sfere con più di 40 m di diametro. In alternativa, le sfere possono essere conteggiate direttamente sulla piastra utilizzando un microscopio dotato di graticola25 o utilizzando un sistema automatizzato26,27.
    4. Calcolare il rapporto percentuale delle sfere ottenute rispetto al numero di cellule inizialmente placcate.
  2. Determinazione dell'autorinnovamento
    1. Dopo aver completato il protocollo di formazione della sfera, raccogliere le sfere in un tubo di centrifuga e centrifugare a 125 x g per 5 min.
    2. Scartare la sfera di coltura del supporto e sospendere delicatamente il pellet in trypsin-EDTA.
    3. Incubare fino a 5 min a 37 gradi centigradi.
    4. Aggiungere supporti di inattivazione enzimatica e pipetta su e giù per garantire una singola sospensione cellulare.
    5. Utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione blu trypan, contare le cellule vitali nella sospensione.
    6. Avviare il protocollo di formazione della sfera come descritto nella sezione 1.
    7. Dopo 8 giorni, utilizzare un emocitometro per contare le sfere con più di 40 m di diametro.
    8. Calcolare il rapporto percentuale delle sfere ottenute rispetto al numero di cellule inizialmente placcate.
  3. Determinazione dell'area di proiezione della sfera
    1. Per valutare l'area occupata dalle sfere, ottenere immagini di almeno 10 campi casuali per condizione, in un microscopio invertito dotato di un modulo di acquisizione delle immagini. Si consiglia un ingrandimento da 100X a 400X.
    2. Analizza le immagini utilizzando il software di imaging, come il software ImageJ28,disegnando aree di interesse corrispondenti alle sfere e misurandone l'area in pixel.
    3. Calcolare l'area di proiezione della sfera come area media dei pixel misurata.

4. Valutazione del marcatore delle cellule staminali del cancro con citometria di flusso

N.B.: CD44-/CD24-/fenotipo basso è stato costantemente associato alle cellule staminali del cancro al seno e ginecologico. La procedura descritta può essere utilizzata per valutare questo e altri marcatori di superficie cellulare.

  1. Dopo aver completato il protocollo di formazione della sfera, raccogliere le sfere in un tubo di centrifuga e centrifugare a 125 x g per 5 min.
  2. Eliminare l'SCM e sospendere delicatamente il pellet in trypsin-EDTA.
  3. Incubare fino a 5 min a 37 gradi centigradi.
  4. Aggiungere supporti di inattivazione enzimatica e pipetta su e giù per garantire una singola sospensione cellulare.
  5. Centrifuga a 125 x g per 5 min, scartare il supernatante e sospendere delicatamente le cellule in PBS.
  6. Lasciare riposare le cellule in sospensione per 30 min per garantire il recupero della conformazione della membrana.
  7. Utilizzando un emocitometro e il metodo di esclusione blu trypan, contare le celle nella sospensione.
  8. Regolare il volume delle sospensioni cellulari a 106 celle/500 .
  9. Incubare con gli anticorpi monoclonali secondo le istruzioni dei fornitori (concentrazione, tempo, temperatura e luce/scuro) e considerando il set di esperimenti rappresentato nella tabella 2 o i marcatori indicati nella tabella 1.
  10. Subito dopo la colorazione, eseguire l'analisi citometrica del flusso utilizzando un citometro di flusso con moduli di rilevamento appropriati.
  11. Standardizzare la configurazione del citometro, seguendo i protocolli stabiliti dal Consorzio EuroFlow29.
  12. Impostare porte primarie in base alla dispersione in avanti e laterale esclusi i detriti e le cellule morte. Questo può essere migliorato con l'etichettatura concomitante con annessina V e gating cellule negative.
  13. Impostare i cancelli di fluorescenza in base ai campioni incontaminati e la compensazione per una sovrapposizione spettrale utilizzando controlli a macchia singola.

5. Valutazione del marcatore delle cellule staminali tumorali con Blot occidentale

NOTA: Oltre all'attività alDH1, l'alta espressione di questo marcatore è stata costantemente associata alle cellule staminali del cancro al seno e ginecologico13,14. La procedura descritta può essere utilizzata per valutare questo e altri marcatori di cella.

  1. Dopo aver completato il protocollo di formazione della sfera, raccogliere le sfere in un tubo di centrifuga e centrifugare a 125 x g per 5 min.
  2. Preparazione di interi lismi cellulari
    1. Posizionare i tubi di centrifuga sul ghiaccio e scartare il supernatante senza interrompere il pellet.
    2. Lavare il pellet con 1 mL di PBS freddo e scartare per centrifugazione.
    3. Sospendere il pellet in un piccolo volume (200-500 l) del buffer di lisi RIPA30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7,4, Triton-X100 1% vol./vol./vol., acido deossicolilico di sodio 0,5% wt./vol., solfato di sodio solfato 0,5% wt./vol.) integrato con cOmplete Mini e dithiothreitol 1 mM.
    4. Mantenendo i campioni freddi (sul ghiaccio), sottoposirli al vortice e alla sonicazione con un'ampiezza del 30%.
    5. Centrifugare i campioni per 15 min a 14.000 x g in una centrifuga refrigerata impostata a 4 gradi centigradi.
    6. Trasferire i supernatanti in microtubi nuovi e correttamente identificati.
    7. Determinare le concentrazioni di proteine utilizzando i saggi BCA o Bradford31.
    8. Se necessario, conservare i campioni a -80 gradi fino a un'ulteriore analisi delle macchie occidentali.
  3. Eseguire la denaturazione del campione, l'elettroforesi, il trasferimento di elettroni e il rilevamento delle proteine secondo i protocolli standard di gonfiore occidentale, come descritto32,33,34.

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Representative Results

Il protocollo di formazione della sfera consente di ottenere colonie sferiche in sospensione da diverse linee cellulari del cancro endometriale e mammario (Figura 2A) o dopo una digestione enzimatica delicata del tessuto da campioni di tumore umano (Figura 2E). In entrambi i casi, pochi giorni dopo la placcatura, si ottengono colonie sferiche monoclonali in sospensione. Sia le sfere di cancro dell'endometrio che quello del seno danno origine a un monostrato cellulare con morfologia simile alla linea cellulare di origine, da 1 a 2 giorni dopo la placcatura (Figura 2A).

Origini distinte di lignaggio e tessuto possono essere confrontate con la capacità di formazione della sfera, l'autorinnovamento e l'area di proiezione. I risultati rappresentativi delle linee cellulari del cancro al seno possono essere osservati nei grafici nella figura 2B-D. Il cancro al seno ormonale positivo al seno MCF7 cellule mostrano maggiore capacità di forma della sfera, auto-rinnovamento e area di proiezione rispetto alle cellule di cancro al seno triplo negativo HCC180614. Per entrambe le linee cellulari, una piccola percentuale delle cellule placcate (meno del 3%) è stato in grado di produrre sfere che enfatizzano le cellule staminali tumorali come una popolazione minoritaria all'interno dell'eterogeneità delle cellule tumorali. L'autorinnovamento delle cellule staminali tumorali è stato brevettato da un valore significativamente diverso dell'autorinnovamento della sfera delle linee cellulari rappresentate. L'area di proiezione della sfera, come misura approssimativa della dimensione delle sfere, è correlata al numero di cicli mitotici e visualizza intervalli di tempo diversi per entrambi i lignaggi.

Mentre solo una piccola percentuale di cellule è in grado di formare sfere tumorali in vitro e mantenere la capacità di auto-rinnovamento che trasporta le proprietà delle cellule staminali, diversi marcatori sono stati associati a questo fenotipo.

Il protocollo di citometria di flusso presentato consente approcci sperimentali versatili, considerando gli antigeni di superficie (vedere la tabella 1). I risultati rappresentativi, illustrati nella Figura 3A-B, riguardano i marcatori a membrana CD44/CD24 e CD133 che sono stati proposti come corrispondenti a un fenotipo più simile a cellule staminali. L'analisi delle sfere ottenute dalle linee cellulari endometriali RL95-2 ed ECC-1 ha permesso di identificare quattro popolazioni (Figura 3A). Le sfere ottenute da Endometrial RL95-2 comprendevanoun'altaCD44 /CD24- popolazione tre volte più grande della linea cellulare parentale35. Nel caso delle sfere ECC-1, il CD44alto/CD24- corrisponde alla popolazione maggiore, che è anche CD133 positivo, mentre il CD44basso/CD24-, CD44basso/CD24e CD44-/CD24- hanno espressione negativa o bassa CD133.

La valutazione della superficie e dei marcatori intracellulari può essere eseguita anche da macchie occidentali dopo la raccolta di sfere delicate e un'attenta preparazione del campione proteico. La figura 3C mostra i risultati tipici del cambiamento di ALDH, un marcatore la cui maggiore attività o espressione proteica aumentata è associata al fenotipo delle cellule staminali tumorali13,14 sulle sfere e sulle cellule aderenti derivate per quanto riguarda la linea cellulare ecc1 endometriale.

Figure 2
Figura 2: cellule del cancro endometriale e mammario, sfere e popolazioni aderenti derivate. (A) . Immagini rappresentative delle linee cellulari tumorali endometriali (RL95-2 e ECC-1) e mammarie (MCF7 e HCC1806), delle rispettive sfere endometriali (ES1) e del seno (MS1) e delle popolazioni aderenti derivate (G1). Immagini rappresentative delle linee cellulari tumorali RL95-2, ECC-1, MCF7 e HCC1806 sono state ottenute con un ingrandimento di 200x (barra della scala - 50 m). Le immagini rappresentative di ES1 RL95-2 e ES1 ECC-1 sono state ottenute con un ingrandimento di 200x (barra di scala n. 50 m). Immagini rappresentative di MS1 MCF7 e MS1 HCC1806 sono state ottenute con un ingrandimento di 200x (barra di scala 100 m). Le immagini rappresentative di G1 RL95-2 e G1 ECC-1 sono state ottenute con un ingrandimento di 200x (barra di scala 50 m). Immagini rappresentative di G1 MCF7 e G1 HCC1806 sono state ottenute con un ingrandimento di 200x (barra di scala 100 m). (B-D) . Capacità di formazione della sfera, auto-rinnovamento e area di proiezione della sfera delle sfere di cancro al seno MCF7 e HCC1806. (E) . Immagini rappresentative di sfere ottenute da campioni di tumore endometriale umano. Queste immagini sono state catturate con un ingrandimento di 200x (barra di scala di 50 m). Parte di questa cifra è stata modificata da una pubblicazione precedente con il permesso dell'editore14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: valutazione combinata dei marcatori delle cellule staminali tumorali nelle cellule tumorali endometriali. (A) . Grafici rappresentativi dell'etichettatura CD44/CD24 della linea cellulare RL95-2 e delle celle della sfera RL95-2. (B) . Istogrammi rappresentativi dell'etichettatura CD133 delle cellule sphere (ES1) ottenuti dalle linee cellulari RL95-2 ed ECC-1. La densità rappresenta una misura del numero di celle. CD44-/CD24-, CD44low/CD24-, CD44basso/CD24e CD44-/CD24- popolazioni sono verniciate rispettivamente in verde, rosa, blu e giallo. C. Espressione ALDH nella linea cellulare ECC-1, nelle sfere (ES1) e nella popolazione aderente derivata (G1). L'immunoblot rappresenta l'espressione ALDH e actina per le rispettive condizioni sperimentali. L'espressione ALDH è stata valutata con l'anticorpo ALDH1/2, che rileva gli isoformi ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 e ALDH2 di origine del topo, del ratto e dell'uomo. Parte di questa cifra è stata modificata rispetto alle pubblicazioni precedenti con il permesso degli editori13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei marcatori delle cellule staminali ginecologiche e del cancro al seno.

Marcatore Origine delle cellule staminali Riferimenti
CD24 (informazioni in due) Cancro ovarico 60
CD29 (informazioni in stato inquestoe utente Cancro al seno 61
CD44 (informazioni in confronto a 3) Cancro ovarico 62,63
CD44/CD24-/basso Cancro al seno 13,5,3,64
CD44-/CD24-/low/ESA Cancro al seno 65
CD44/ALDH1s/hi Cancro al seno 66
CD44/CD24-/basso/ABCG2 Cancro al seno 67
CD44/CD24-/basso/ALDH1 Cancro al seno 43,68,69
CD44/CD24-/basso/EpCAM Cancro al seno 5
CD44/CD24-/basso/SSEA-3 Cancro al seno 70
CD44/CD49f/CD133/2 Cancro al seno 71
CD44/CD133/ALDH1s/hi Cancro al seno 69
CD44/CD117 Cancro ovarico 7
CD44/MyD88 Cancro ovarico 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Cancro ovarico 74,75
CD44/CD24/Epcam Cancro ovarico 76,77
CD44/CD24- Cancro ovarico 78,79
CD44/CD166 Cancro ovarico 80
CD44/CD24 Cancro cervicale 81
CD49f Cancro al seno 4
Cancro cervicale 82
CD117 o c-Kit Cancro dell'endometrio 83
Cancro ovarico 62,84
CD133 Cancro al seno 4,85
Cancro ovarico 62,86
Cancro dell'endometrio 13,87,88,89
Cancro cervicale 82
CD133hi/CXCR4hi/ALDH1hi Cancro al seno 90
CD133/ALDH1 Cancro al seno 91
Cancro ovarico 60,92
CD133/CXCR4 Cancro dell'endometrio 93
ABCG2 Cancro al seno 65
Cancro cervicale 82,81
ALDH-1 Cancro al seno 4
Cancro dell'endometrio 94,95 anni
Cancro cervicale 82
CXCR4 o CD184 Cancro al seno 96
EpCAM/CD49f Cancro al seno 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Cancro al seno 70
GD2/GD3/GD3Shi Cancro al seno 98
ITGA6 Cancro al seno 4
PROCR Cancro al seno 43

NOTA: Questa tabella fornisce un elenco di epitopi di superficie espressi da varie cellule staminali ginecologiche e tumorali al seno; la maggior parte di questi marcatori sono espressi anche da una serie di altri tessuti. Questo elenco non mira a includere tutti i marcatori segnalati.

Tabella 2: Elenco dei tubi da includere in un tipico esperimento di citometria a flusso per valutare il fenotipo CD24/CD44. La tabella mostra un set minimo di tubi campione necessari per un esperimento di co-colorazione, compresi i controlli necessari.

Tubo Condizione Antigeni-fluoroforo
1 Cellule non colorate Nessuno
2 CD44 a macchia singola CD44-PE
3 CD24 a macchia singola CD24-APC
4 Doppia macchia CD44/CD24 CD44-PE e CD24-APC

NOTA: Questo esperimento può essere eseguito aggiungendo l'annessina V-FICT al tubo 4 e aggiungendo il rispettivo tubo di controllo al fine di tenere cancello le cellule negative di annessione V ed escludere eventuali cellule in apoptosi.

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Discussion

Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per ottenere le sfere tumorali dalle linee cellulari tumorali e dai campioni umani primari. Le sfere tumorali sono arricchite in una sottopopolazione con proprietà simili a cellule staminali36. Questo arricchimento nel CSC dipende dalla vitalità in un ambiente privo di ancoraggio, mentre le cellule differenziate dipendono dall'adesione a un substrato37. Poiché la placcatura primaria delle cellule tumorali in un ambiente a bassa aderenza che impone la sospensione non garantisce l'arricchimento nel CSC di per sé, forniamo strategie per valutare l'auto-rinnovamento (capacità di formazione della sfera e auto-rinnovamento), la capacità di differenziazione (popolazioni aderenti derivate) e il fenotipo del CSC (con citometria di flusso e/o macchia occidentale). Le cellule staminali tumorali possono essere identificate tramite diversi marcatori fenotipici ampiamente descritti (cfr. tabella 1).

Poiché le colture primarie del tumore umano sono spesso difficili da stabilire e mantenere nella coltura, il protocollo di formazione della sfera potrebbe fornire uno strumento per la gestione di questi campioni. La procedura di digestione enzimatica ha suggerito di fornire sospensioni unicellulari da campioni di tessuto endometriale38. Il protocollo di formazione della sfera fornisce un numero significativo di CSC, che sono difficili da ottenere con altri mezzi. Il modello tridimensionale potrebbe essere più efficiente nell'imitare la situazione in vivo, vale a dire il microambiente fisiologico e l'eterogeneità tumorale, rispetto alle colture cellulari monostrato convenzionali.

La certezza circa l'origine monoclonale delle sfere tumorali è un passo critico di questo protocollo. Minimizzare l'aggregazione, che tende a verificarsi nelle colture delle sospensioni, e un'ottimizzazione approfondita delle densità di semina per distribuire sospensioni unicellulari sonocruciali 24. Altri autori hanno suggerito la placcatura di una singola cella per pozzo39,40. Per evitare questa laboriosa procedura, abbiamo superato questo problema assicurando che una sospensione a cella singola sia placcata a bassa densità in un mezzo arricchito di metilcellulosa. Grazie alla sua tenuta d'acqua e alle proprietà di valorizzazione della viscosità23, la metilcellululosa fornisce un mezzo semi-solido che evita la migrazione e l'aggregazione, garantendo la monoclonalità delle sfere ottenute21. Il numero di giorni in coltura è un altro aspetto che dipende dall'ottimizzazione, poiché il numero di giorni necessari per ottenere sfere con diametri superiori a 40 m dipende da ogni tipo di cellula che raddoppia il tempo24. Il mezzo basso o senza siero è un'altra caratteristica del protocollo, in quanto il mezzo contenente FBS è rilevante per la crescita differenziata delle cellule nelle condizioni di aderenza41, come nelle linee cellulari parentali e nelle cellule aderenti derivate. Il protocollo dipende dal mantenimento di una concentrazione costante dei fattori di crescita specifici. La segnalazione eGF svolge un ruolo importante nel mantenimento dei percorsi di pluripotenza, mentre bFGF agisce come un mitogeno che contribuisce alla generazione di sfere42,43.

Il protocollo di formazione della sfera, associato a tecniche appropriate, fornisce i mezzi per espandere, isolare e valutare popolazioni specifiche di CSC21. Diversi autori hanno sottolineato la sua utilità nella valutazione dell'espressione genica delle cellule staminali44,45,46,47e lo stelo nei tumori47,48 , per studiare la transizione epiteliale-mesenchymica44,49 e la tumorigenesi45,48, per valutare l'effetto delle nuove terapie21, 50e resistenza ai farmaci44 , 51, e per stabilire le culture da campioni primari21,45,46. Tuttavia, è importante tenere a mente che si tratta di un esperimento sensibile, fortemente dipendente da condizioni di coltura adeguate. Inoltre, le sfere presentano eterogeneità cellulare a causa della divisione asimmetricaCSC 52 e non rappresentano un buon modello della complessità della formazione e del mantenimento delle cellule staminali tumorali nella nicchia in vivo46.

Oltre al protocollo di formazione della sfera, altri saggi funzionali sono stati utilizzati per il rilevamento del CSC. La tumorigenicità in vivo comporta l'inoculazione di un basso numero di cellule nei topi immunocompromessi per ottenere tumori36,53. Ciò dipende dalla disponibilità di condizioni adeguate per eseguire studi sugli animali e, a causa del microambiente non specifico delle specie, il recupero delle cellule viventi potrebbe essere difficile. Un saggio di unità di formazione colonia, valutando la capacità cellulare di generare colonie dopo che sono placcate a bassa densità52, fornisce un basso numero di cellule. La popolazione laterale si basa sullo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare un gruppo di cellule con la capacità di estrudere la macchia di Hoescht 33342. Questo metodo sensibile si basa sull'espressione dei trasportatori ATP leganti di proteine a cassette (ABC), responsabili dell'efflusso di droga54. Tuttavia, la popolazione laterale è associata ad alcuni svantaggi, vale a dire, la non specificità per alcuni fenotipi del CSC e le caratteristiche del colorante, che è tossico e in gran parte influenzato da condizioni sperimentali (temperatura, concentrazione)54,55. ALDEFLUOR è un altro saggio basato sulla citometria di flusso per l'identificazione di cellule con attività ALDH intracellulare. Il problema principale è la mancanza di riproducibilità tra gli studi che sembrano essere fortemente influenzati dalle condizioni culturali54.

Il protocollo di formazione della sfera è spesso combinato con l'analisi fenotipica, come abbiamo proposto qui, sottolineando l'utilità di metodi complementari per identificare CSC13,14. Abbiamo raccomandato l'arricchimento del CSC attraverso il protocollo di formazione della sfera e un'ulteriore conferma dello stelo attraverso la valutazione dei marcatori biochimici per citometria di flusso e macchia occidentale. Gli studi sulla citometria di flusso hanno identificato popolazioni eterogenee all'interno delle sfere. Infatti, c'è un arricchimento nel CSC negli studi mostrati, rappresentato in questo protocollo dalle cellulebasse CD44alte/CD24. A causa dell'auto-rinnovamento asimmetrico delCSC,sono stati identificati anche altri fenotipi cellulari. Nel caso del CD133, i risultati rappresentativi hanno mostrato che la popolazione con maggiore stelo è positiva nel caso della linea cellulare ECC-1, ma negativa nelle sfere RL95-2. Ciò indica la mancanza di specificità di alcuni marcatori CSC descritti, che non sono unici per queste cellule e potrebbero variare con la plasticità del fenotipo, e l'importanza di utilizzare una combinazione di strategie per confermare l'assottiglia.

La macchia occidentale è una metodologia alternativa che potrebbe essere utile in alcuni casi. Per esempio, mentre l'attività ALDH è ampiamente utilizzata, è ormai noto che più isoformi contribuiscono alla metabolizzazione ALDEFLUOR54. Così, specifici metodi antigeni-anticorpi potrebbero essere più affidabili e abbiamo già mostrato l'associazione tra espressione della proteina ALDH e stelo13,14.

Capacità di formazione della sfera, auto-rinnovamento e derivate popolazioni aderenti rappresentano la capacità del CSC di dividere indefinitamente e produrre una progenie differenziata, che si traduce clinicamente in eventi come ricaduta, metastizzazione e resistenza al trattamento9. La resistenza ai farmaci nel CSC può essere spiegata dalla sovraespressione delle proteine della membrana a resistenza multifarmaco (MDR), espressione ALDH coinvolta nei meccanismi di disintossicazione, meccanismi di riparazione del DNA, protezione contro le specie reattive dell'ossigeno e resistenza all'apoptosi56. CsC hanno la capacità di essere quiescente a causa della loro plasticità e questo è emerso come un meccanismo di resistenza ai farmaci. Questa popolazione può essere risparmiata dalla chemio e dalla radioterapia a causa del ciclo cellulare arrestato cellule differenziate57. Le sfere sono una popolazione tumorale con resistenza ai farmaci citostatici utilizzati nel trattamento convenzionale e sono state anche un focus per la combinazione con terapie mirate54,58,59. La sensibilità delle sfere può essere testata per la citostatica utilizzata nei tumori al seno e all'endometrio. Inoltre, l'isolamento del CSC da un campione di tumore può essere una piattaforma per l'applicazione clinica della terapia specifica per ogni tumore, prevedendo la resistenza e la conseguente malattia ricorrente.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla Società portoghese di ginecologia attraverso il Premio Ricerca 2016 e da CIMAGO. Cnc. IBILI è sostenuta attraverso la Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) e co-finanziata da FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). L'Ospedale Coimbra e la Banca del tumore del Centro Universitario (CHUC), approvato dal Comitato Etico per la Salute del CHUC e dalla Commissione nazionale portoghese per la protezione dei dati, è stata la fonte di campioni endometriali di pazienti seguiti presso il servizio di ginecologia dell'istituzione. La Figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier Medical Art, disponibile da www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

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