Summary
Селективное внутрибронхиальной кислоты зависания в левом легком у мышей приводит к односторонней и самоограниченной острой травмы легких, что модели человеческого острого респираторного дистресс-синдрома (ARDS), вызванного аспирации желудочной кислоты.
Abstract
Селективное внутрибронхическое запор соляной кислоты (HCl) к мурин левому основному бронху вызывает острые повреждения тканей с гистопатологическими находками, похожими на острый респираторный дистресс-синдром человека (ОРДС). В результате альвеолярный отек, альвеолярно-капиллярный барьер повреждения, и лейкоцитов инфильтрации преимущественно влияют на левое легкое, сохраняя правое легкое в качестве невредимым контроля и позволяет животным выжить. Эта модель самоограниченной острой травмы легких позволяет иссмотреть механизмы разрешения тканей, такие как макрофаг эпрероцитоз апоптотические нейтрофилы и реституция альвеолярно-капиллярной барьерной целостности. Эта модель помогла определить важные роли для агонистов резолюции, в том числе специализированных про-разрешителяющих посредников (SPM), обеспечивая основу для разработки новых терапевтических подходов для пациентов с ARDS.
Introduction
Острый респираторный дистресс-синдром (АРДС)является важной причиной острой дыхательной недостаточности 1. Это общее и смертельное или отключение болезни, которая возникает в 10% всех пациентов, госпитализированных в отделения интенсивной терапии во всем мире2. В соответствии с берлинским определением3, ARDS определяется острым началом гипоксомической дыхательной недостаточности (Злт;1 неделю) и двусторонними легочными инфильтратами на рентгенографии грудной клетки, которые не объясняются сердечной недостаточностью4. Основной патобиология характеризуется чрезмерной воспалительной реакцией. Легкие могут быть повреждены непосредственно, например, при пневмонии или с желудочной кислоты аспирации, или косвенно, например, при сепсисе или после нескольких переливания крови4. После первоначального оскорбления, ПАтогенез ARDS прогрессирует в три фазы: экссудативные, пролиферативные и фиброзные фазы1. Эти фазы характеризуются различными молекулярными и клеточными иммунными и ремонтными механизмами, которые определяют прогноз для пациентов С АРДС. Поддерживающая помощь остается основой для пациентов САРД; в настоящее время, Есть нет эффективных фармакологических методов лечения ARDS, так что существует настоятельная необходимость для новых исследований по этому разрушительному состоянию4.
Дисрегуляция врожденного иммунного ответа во время экссудативной фазы способствуетострому насегини АРДС и связанной с ней дыхательной недостаточности 1. Мощный провоспалительный посредник сигнализации организует первоначальные иммунные реакции, что приводит к нарушению альвеолярно-капиллярного барьера, диффузного альвеолярного отека и нейтрофиловой инфильтрации к месту повреждения легочной ткани4. В ARDS, неэффективные тормозные сигналы для острого воспаления предрасполагают к отказу легких и может задержать своевременнокатаизм поврежденной ткани легких5. С этой целью доклиническое расследование эндогенных механизмов инициирующих и про-разрешение ARDS может выявить новые терапевтические стратегии. Такое исследование требует самоограниченных экспериментальных in vivo моделей острой травмы легких, которые очень похожи на особенности человеческого ARDS, позволяя допроса механизмов, лежащих в основе фаз инициации и разрешения повреждения тканей.
Представленная здесь модель мурин производит прямую острую травму легких, которая демонстрирует кардинальные патобиологические процессы экссудативного АРДС, а именно нарушение альвеолярно-капиллярного барьера и нейтрофиловую инфильтрацию. Метод опирается на селективное внутрибронхиальное зависание HCl через каниуляцию левого основного бронха, локализацию травмы и воспалительные реакции на левое легкое; неповрежденное правое легкое может быть использовано в качестве внутреннего контроля для выбора определений повреждения тканей и воспаления. Кроме того, односторонняя травма легких является нелетальной и представляет программу резолюции. Это предлагает четкое окно в разрешение воспаления легких, которые могут быть использованы для идентификации эндогенных про-решения посредников и клеточных механизмов и открыть новые терапевтические возможности для ARDS, что подчеркивает сятворство разрешения и Фармакологии.
Protocol
Все процедуры для животных, приведенные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Бригаме и женской больнице (Протокол #2016N000356).
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная техника была соблюдена для всех процедур выживания. Для каждой операции было установлено стерильное поле с использованием стерильного драпировки, в то время как хирурги носили стерильные хирургические перчатки, шапки, маски и чистые лабораторные пальто. Все хирургические инструменты были стерилизованы с помощью автоклава, а стерильность сохранялась с помощью стерилизатора биса.
1. Подготовка 0.1 N HCl
- Добавьте 11 мл ddH2O в бутылку янтарного стекла. Медленно добавьте 1 мл 37% HCl (12 N), чтобы создать 1 N HCl рабочий запас.
ПРЕДЕКТО: Убедитесь, что HCl добавляется в воду. Это забота безопасности потому что добавлять воду сразу к кислоте может причинить кислоту кипеть и выплеснуть из бутылки. При обращении с концентрированным HCl, убедитесь, что кислота хранится в вентилируемый химический капот и соответствующее индивидуальное защитное оборудование носится, в том числе лабораторное пальто, перчатки и защитные очки. - Медленно добавьте 4 мл ранее разбавленного рабочего запаса HCl в 35 мл ddH2O в конической трубке 50 мл для создания экспериментального запаса 0,1 N HCl.
- Измерьте рН экспериментального запаса с помощью электронного зонда pH после двухточечной калибровки с использованием решений с низким рН. Титрат до pH 1.1 с использованием наoh или HCl фондовых решений по мере необходимости, так что окончательный объем составляет 40 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение низких значений pH может быть затруднено. Чтобы обеспечить точное измерение, убедитесь, что зонд pH правильно откалиброван с использованием низких стандартов рН, чтобы избежать чрезмерной экстраполяции измерения. - Непосредственно перед экспериментом процедите 1-2 мл экспериментального запаса HCl через стерильный фильтр 0,22 мкм в стерильную микроцентрифугную трубку.
2. Селективное внутрибронхиальное загонование HCl
-
Подготовка хирургической области
- Индуцировать общую анестезию путем доставки смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) путем интраперитонеального инъекции. Убедитесь, что мышь полностью обезглавлена, аккуратно сжимая кончик хвоста или заднюю ногу. Отсутствие ответа вывода требуется до принятия разреза кожи. При необходимости наводят дополнительную анестезию болузами.
- Доставьте 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно под потертости шеи. Предоперационный анальгетик усилит действие анестезии и устранит предоперационную и послеоперационную боль в результате процедуры.
- Используйте электрические клиперы, чтобы аккуратно побрить хирургическую область на брюшной поверхности мыши, ниже подбородка в шейной области горла, используя медленные нисходящие удары. Удалите рыхлый мех, чтобы полностью разоблачить основную кожу.
- Подготовка хирургической области путем мазка бритый сайт с 10% повидон-йод раствор. После применения асептического раствора очистите участок с помощью 70% мазка изопропилового спирта. Повторите этот шаг 3x.
-
Изолировать трахею
- Поместите мышь в положение на спине на чистой хирургической доске и накройте мышь стерильной хирургической драпировкой, сохраняя при этом воздействие хирургической области. Закрепите драпировку на месте.
- Сделайте 0,5 см продольной разрез в коже над трахеей и слюнных желез. Используйте слегка изогнутые зубчатые щипцы, чтобы тщательно отодвинуть кожу и аккуратно отделить слюнные железы, чтобы разоблачить мышцы трахеи.
- Использование зубчатых щипцы для тупого вскрытия, осторожно раздвинуть паратрахеальные мышцы и дразнить от фасции, которая окружает трахею, пока хрящевые кольца трахеи полностью подвергаются.
- Используйте полностью изогнутые зубчатые щипцвы, чтобы поднять трахею и отделить соединительную ткань между ретро-трахеей и ретро-фасцией. После того, как соединительная ткань отделена, кончик щипцы должны скользить полностью за трахеей.
- Держите изогнутые щипчи за трахеей и захватить 10-15 см кусок 4-0 плетеный шелковый шов с кончиками щипц. Потяните шов за трахеей так, чтобы есть четная длина с обеих сторон.
- После того, как шов на месте, осторожно потяните стороны шва к задней мыши и удерживайте стороны на месте.
-
Выборочно ежефайкирование левого основного бронха и привитие HCl
- Возьмите 24 G х 3/4 "ангиокатетер и вставьте иглу, скосал вверх, в передней области трахеи между первым и вторым трахеи кольца. После правильной вставки подтверждается прямой визуализации кончика иглы в трахеи просвет, отпустите шов и заранее канюли над иглой и в трахею, пока сопротивление не будет достигнуто, а затем снять иглу. Угол направление вставки к левой основной ствол бронхов для селективного заставления в левое легкое.
- После того, как канюля на месте, твердо захватить порт инъекций, чтобы предотвратить катетер от смещения.
- Используя пипетку P200 и стерильные наконечники пипеток P200, прививай 2,5 мл/кг (50 л для 20 г мыши) стерильной фильтрованной 0,1 N HCl в катетер, за которым следует одинаковый объем воздуха.
- Быстро снимите катетер и поднимите хирургическую доску под углом 60 градусов в течение 30 с.
-
Закрытие хирургической зоны
- Положите хирургическую доску плоским и удалить шов из-за трахеи.
- Используйте 4-0 восковое покрытие плетеные шелковые швы, чтобы закрыть разрез кожи с помощью 2-3 стежков.
3. Послеоперационный уход
- Как только разрез закрыт, поместите мышь на левую сторону на теплую грелку, пока мышь не оправится от анестезии. Начните мониторинг мыши на боль и уровень активности, прежде чем вернуть его в нормальное жилье.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин следует вводить при 0,1 мг/кг подкожно каждые 6-12 ч в течение первых 24 ч. Если постоянная боль прорыв присутствует, продлить режим анальгетика до боли спадает.
4. Всего легких бронхоальвеолярной лавировки (BAL) и лейкоцитов иммунофенотипирования
-
Эвтанизировать мышь, вводя 3x дозу кетамина / ксилазина используется в шаге 2.1.1.
- Чтобы дифференцировать интерстициальные и внутрисосудистые нейтрофилы, внутривенно вводят выбранное флюорофорное антитело Ly6G за 5 минут до эвтаназии. Эта этикетка должна быть подходящей для обнаружения с помощью цитометрии потока, чтобы отличить внутрисосудистые нейтрофилы от легких интерстициальных и альвеолярных нейтрофилов, которые будут помечены во время подготовки ткани с другим флюорофором (см. ниже).
- Поместите мышь на хирургическую доску и крючок передние резцы вокруг петли 2-0 плетеный шелковый шов.
- Выполните шаги 2.2.2-2.2.6. подготовить трахею к канистрам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что диафрагма не проколов, чтобы максимизировать транс-альвеолярное надувное давление во время промывки легких; левое соответствие легких уменьшается после травмы, которая может потребовать более высокого транс-альвеолярного давления требования для промывки легких. - Каннуляция трахеи после шага 2.3.1, но не продвигайте катетер ниже карины; вставить катетер параллельно трахееее.
- С катетером вставлен, связать шов вокруг трахеи, чтобы держать катетер на месте.
- Привить и снять два последовательных 1 мл aliquots ледяной PBS -/- (без магния или кальция) с 0,6 мм EDTA с использованием 1 см шприц. Для иммунофенотипирования по течению цитометрии, удалить каждый aliquot и вернуться к 5 мл полистирола FACS трубки на льду.
- Для обеспечения эвтаназии, выполнить торакотомию с помощью хирургических ножниц с последующим проколом сердца. Легкие могут быть собраны для дальнейшей обработки.
- Centrifuge BAL в течение 10 мин при 800 г при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать клетки.
- Декант супернатант в 2 мл микроцентрифуговой трубки и aliquot в 1,5 мл микроцентрифуговых труб. Храните при -80 градусах по Цельсию для последующего анализа.
- Resuspend клеточные гранулы в PBS -/- с 2% FBS для анализа дифференциала лейкоцитов цитометрией потока.
- Чтобы дифференцировать интерстициальные и внутрисосудистые нейтрофилы, удалите левое и правое легкое отдельно и обработайте легкие для цитометрии потока, как в Абдулнурии и др. 6.
- Пятно результирующей клеточной суспензии с использованием выбранных антител FACS, убедившись, что пятно для Ly6G, который спрягается с другой флюорофор, чем антитела Ly6G от шага 4.1.1.
5. Оценка альвеолярного барьера проницаемость использованием голубой краситель Эвана (EBD)
- Внутривенно вводят голубой краситель Эвана (40 мг/кг) за 30 мин до эвтаназии.
- Эвтанизировать мышь с помощью передозировки кетамина/ксилазина (шаг 4.1).
- Для измерения целостности альвеолярного барьера выполните шаги 4.2-4.9 для коллекции BAL.
- Передача 100 л BALF на четкую нижнюю микроплиту 96-пузыль, а также 100 л дублирующих стандартов EBD. Используйте PBS -/- в качестве пробела.
- Используйте микроплитный считыватель для измерения абсорбции BALF на 620 нм и 740 нм. Используйте абсорбцию на 740 нм, чтобы исправить для загрязнения гема в образцах7.
- Для измерения целостности сосудистого барьера, perfuse легких медленно инъекционных 5 мл ледяной PBS -/- через правый желудочек сердца. Удалить левое легкое.
- Высушите левое легкое в течение 72 ч при 58 градусах По Цельсию, чтобы удалить излишки воды.
- Обработайте высушенную легочную ткань, какв Раду и Чернове 2013 8, и измерьте абсорбции на 620 нм и 740 нм.
6. Легкая гистология
- Каннула трахея, следующие шаги 4.1-4.5.
- Для давления исправить легкие на 20 см H2O, используйте кольцо стенд и зажим, чтобы поднять 60 мл шприц оснащен клапаном контролируемых труб и заполнены выбрать фиксаторный раствор (например, цинк фиксатор) так, что мениск из фиксаторного решения на 20 см выше Легкие.
- Прикрепите трубку к катетеру и откройте значение. Медленно заполните легкие с фиксацией, пока они не перестанут надуваться.
- Удалите катетер 3/4 пути выхода из трахеи. Свяжите трахею с швом перед полностью удалением катетера, чтобы свести к минимуму потерю фиксатора.
- Удалить легкие и сердце ан блок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что легкие не проколоты во время удаления, чтобы сохранить давление, настоянный фиксатор. - Исправить легкие в течение 24 ч в 25 мл фиксатора при комнатной температуре.
- Вымойте фиксированные легкие для последовательных 20 минут интервалы в PBS -/-, 30% этанола, и 50% этанола.
- После последней стирки, хранить легкие в 70% этанола для обработки гистологии, как в Eickmeier и др. 20139.
Representative Results
Селективное внутрибронхиальное зависление HCl приводит к односторонней острой травме легких
Метод селективного внутрибронхического зависания HCl в левый основной бронхов иллюстрируется на рисунке 1A. Последующая острая травма легких включает в себя все левое легкое, и после внутривенного введения EBD и перфузии легких, EBD остался только в левом легком(Рисунок 1B). Экстравазация EBD в левое легкое была количественно оценена и оказалась значительно увеличенной по сравнению с фиктивным селективным зависанием(рисунок 1C; адаптирована из Abdulnour et al. 20146). В ответ на травму легких, циркулирующих лейкоцитов диапедии в воспаленной ткани. В этой модели сосудистые нейтрофилы проходят трансэндотелиальную миграцию в поврежденный интерститий легких. Интерстициальные нейтрофилы, накопленные в левом легком 24 ч после закапывания HCl, в отличие от правого легкого, где наблюдается несколько интерстициальных нейтрофилов(рисунок 1D). Эти результаты показывают, что селективный левый основной метод внутрибронхиальной завистыния привел к острой травме легких, которая была в значительной степени локализована в левом легком и произвела патологические изменения, которые также наблюдаются с человеческим ARDS, в том числе увеличение альвеолярно-капиллярный барьер нарушения и нейтрофилов инфильтрации.
Односторонняя острая травма легких позволяет исследует механизмы разрешения
Для изучения фазы разрешения кислотно-индуцированной острой травмы легких мышей должны быть в состоянии пережить первоначальное оскорбление. Отличается от внутрипечевого HCl, затаив только в левой основной бронхов приводит к самоограниченной травмы с равномерной выживания в противном случае здоровых мышей. Легкие могут быть получены от мышей на ранних или более поздних временных точек, как на рисунке 2A. Гистология легких показывает повреждение тканей и воспаление на уровне органа и клеток с экссудативным воспалением 24 ч после травмы, характеризующейся выраженным альвеолярным отеком и нейтрофилой инфильтрации в левом легком. Обратите внимание, что нет значительных травм или притока лейкоцитов в невредимое правое легкое(рисунок 2A). 72 ч после травмы, отеки и клеточные инфильтры значительно уменьшаются, что представляет собой разрешивающую истодационную фазу. Альвеолярные нейтрофилы могут контролироваться с помощью цитометрии потока (CD45-/CD68-/F4/80-/Ly6G /CD11b) получают целые промывки легких. Нейтрофилы увеличиваются в левом легком 24 ч после первоначальной травмы и существенно уменьшаются на 48 и 72 ч(рисунок 2B). Если будут исследованы более поздние временные моменты, числа нейтрофилов вернутся к исходной линии, и механизмы на более поздних стадиях катабассиса, такие как фибропролиферативные реакции, могут быть изучены.
Рисунок 1: Селективное внутрибронхиальное запорирование HCl приводит к одностороннему повреждению легких, определяемому нарушением альвеолярного барьера и нейтрофилом инфильтрации. (A) Представление канистики murine левый бронхов mainstem для селективного зависания HCl в левое легкое. (B) Резеченные правые (RL) и левые (LL) легкие подвергаются селективному завиванию кислоты и проникнуты после внутривенного синего красителя Эвана. (C) Количественная оценка синего красителя интерстициального Эвана из гомогенизированного, пронизанного легкого 24 ч после повреждения кислоты или фиктивного контроля; фигура адаптирована из Абдулнур и др. 20146. Значения представляют среднее значение SEM, где n 5. р-л; 0,05, Манн-Уитни U Test. (D) Представитель потока цитометрии интрасосудистой (I.V.; фторофор 1) и интерстициальной (I.S.; фторофор 2) нейтрофилов в процентах от общего количества CD45й клеток в обработанных легких 24 ч после кислотной травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Односторонняя острая травма легких является саморазрешимым. (A) Представитель Н И Е гистологии (10x) левых легких, полученных от наивных мышей (0 ч) или мышей 24, 48, 72 ч после травмы, наряду с соответствующим правого легкого из той же мыши (Шкала бар 250 мкм). (B) Представитель потока цитометрии альвеолярных нейтрофилов (Ly6Gи CD11b)полученные из всего легких промывки в процентах от общего CD45и клеток в наивных (0 ч) мышей или мышей 24, 48 и 72 ч после травмы кислоты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Метод внутрибронхиального зависания, описанный здесь, использует селективную канистрацию левого основного бронха, чтобы привить HCl в левое легкое, что приводит к односторонней и самоограниченной острого повреждения легких. Эта модель травмы муринкислоты тесно представляет воспалительные реакции, гистопатология, и физиологическая дисфункция видели в человека ARDS, где желудочной кислоты аспирации является общим осадки или фактор4. Воздействие рурин дыхательных путей к низкому рН HCl приводит к повышенной проницаемости альвеолярно-капиллярного барьера, альвеолярного отека и глубокого нейтрофила инфильтрации в месте повреждения. Эти события не наблюдаются в неповрежденном правом легком. Кроме того, эта модель производит быстрые воспалительные реакции, которые достигают пика в течение 24 ч после зависания кислоты, и разделяет изменения в экспрессии генов с человеческим ARDS, такие как дифференциальная экспрессия фосфолипаса D изоформы10.
Хотя эта доклиническая модель мурин воспроизводит многие особенности ARDS на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях, она не полностью резюмирует человека ARDS. Определение ARDS включает в себя двустороннее участие легких3, в то время как метод зависания описаны здесь результаты по замыслу в односторонней болезни легких. Кроме того, животные не требуют непрерывной механической вентиляции легких, неподвижности или парентеральной седации. Результаты, представленные здесь (vide supra) и в других местах6,9,11,12,13 показывают, что односторонние кислоты индуцированной травмы легких воспроизводит большинство патологических признаков ARDS, предоставляя уникальную возможность использовать правое легкое в качестве внутреннего контроля и изучить фазу разрешения этого заболевания. Таким образом, обсуждаемая здесь модель модели ARDS патобиология, но также позволяет механистическое исследование фундаментальных реакций легочной ткани на травмы и механизмы разрешения, которые могут быть актуальны для решения этой важной болезни.
Загоняние HCl представляет собой прямую острую травму легких, поэтому это моделирование аспектов патофизиологии, связанные с аспирационным пневмонитом. Кроме того, начальное оскорбление левого легкого в этой модели генерируется с использованием стерильных HCl, а не бактерий нагруженные содержимое желудка видели в некоторых человеческих событий аспирации, которые также могут привести к пневмонии14. У людей, аспирация патогенных бактерий может привести к вторичной бактериальной пневмонии, которая усугубляет острый воспалительный ответ, продлевая начальную травму легких и повышение восприимчивости пациента к развитию ARDS14. Это потенциальное ограничение было решено следователями намеренно внушать патогенные бактерии Escherichia coli (E. coli)15 после стерильной HCl. Кроме того, этот метод был использован для исследования патогенных опосредовано воспаление; односторонняя бактериальная пневмония может быть вызвана селективной зависанием левых легких бактерий, таких как E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, и Streptococcus pneumoniae18 . Самоограниченная модель острой травмы легких, описанная здесь, также может быть использована для изучения искусственной травмы легких, вызванной вентилятором (VILI), важной причиной повышенной смертности у человека ARDS19. Экспериментальные модели животных VILI обычно включают механическую вентиляцию у наивных мышей с приливными объемами, которые намного выше, чем то, что клинически используется, чтобы вызвать травму легких (15 мл/кг; см. предыдущую работу20,21). К более клинически релевантной модели VILI, зависление внутрибронхиальной кислоты как описано здесь, может быть использовано сперва для того чтобы навести нелетальную травму легкя после этого механической вентиляцией на приливных томах внутри клинического ряда (6-12 mL/kg). Эта гипотетическая модель животных может позволить следователям изучать VILI клинически значимым образом после разработки и проверки. Вместе эти модели мурин подчеркивают универсальность селективного метода интрабронхиальной завистывания для генерации односторонних оскорблений легких, которые напоминают патологии, связанные с заболеваниями легких человека.
Помимо селективного зависания различных вредных веществ в левое легкое, техника внутрибронхиального зависания после трахеостомы не требует длительной подготовки, длительного времени процедуры или сложного оборудования, а в опытных руках вызывает минимальное бедствие для животных. Несмотря на это, несколько проблем могут возникнуть во время селективной процедуры зависания HCl, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Неправильная канитуляция левого основного ствола бронхов может привести к двусторонней травмы легких, что снижает выживаемость экспериментальных мышей и путает использование правого легкого в качестве невредимого внутреннего контроля. Этого можно избежать, прогулив катетер достаточно к левому легкому во время канистры, пока сопротивление не будет достигнуто. После инъекции HCl, болюс воздуха должны быть введены, катетер быстро удалены, и хирургическая доска доведено вертикально под углом 60 ". Эти шаги имеют решающее значение для обеспечения того, чтобы кислота достигает дистальных дыхательных путей левого легкого и предотвращает рефлюкс кислоты в правое легкое и трахею, которые могут привести к проксимальной травмы. В течение 24 ч после зависания, травма в левом легком диффузно с обширным отеком легких, затрагивающих как дистальные и проксимальные левое легкое.
Во время развития метода у взрослых 8-12 недель мышей, 2,5 мл/кг внутрибронхиального HCl производится существенное, но сублетальной острой травмы легких; более низкие дозы HCl не привели к воспроизводимым и однородным травмам легких. Хотя мы не выполнили эту модель в младших (например, 3-6 недель) или пожилых мышей (например, 10-14 месяцев), мы ожидаем, что вес на основе дозирования HCl приведет к травме легких фенотип похож на то, что отмечается в 8-12 недель ных мышей. Мы рекомендуем следователям титрат HCl дозы для достижения желаемой степени травмы легких до выполнения экспериментов с мышами на крайности веса.
Эта селективная процедура завлечения кислоты предлагает нелетальную модель мурин ы воспаления стерильной ткани, которая уменьшает потребность в поддерживающей помощи, такой как механическая вентиляция легких. При длительном выживании раненых мышей, вызванных кислотой воспаление имеет достаточно времени, чтобы саморазосластвия. Разрешение фазы этой модели был использован для выявления временно регулируется эндогенных биоактивных липидов посредников, называемых специализированных про-разрешения посредников (SPMs), таких как липоксин A4 (LXA4), марезин 1 (MaR1), и resolvins6 ,11,12,16. Администрирование экзогенных SPM для раненых мышей ускоряет разрешение кислотной индуцированной травмы легких путем увлажнения воспалительных механизмов и содействия катаbasisизм поврежденной ткани легких. Эти SPM способствовать очистке альвеолярного отека12, увеличить эвнероцитоз апоптотические нейтрофилы набранных макрофагов16, и ускорить реэпителиализации дыхательных путей и альвеолы12 для уменьшения сосудистых утечки и гипоксии тканей. В модели патогена индуцированной травмы легких, 15-эпи-ресолвин D1 также выставлены противомикробные действия через увеличение бактериального фагоцитоза макрофагов и расширение бактериального зазора из инфицированного легких16. Изучение этих эндогенных механизмов разрешения дает представление о потенциальных новых терапевтических стратегий для пациентов с ARDS5.
Для лучшего изучения пространственно-временной регуляции механизмов разрешения необходимы экспериментальные модели in vivo. Острые модели травмы легких должны включать в себя соответствующие острые воспалительные реакции и дисфункцию органов с участием принимающего разрешения содействия молекулярных и клеточных процессов. Эти механизмы можно количественно оценивать с помощью установленных индексов разрешения22. Селективный метод внутрибронхиальной завистывания для генерации одностороннего острого повреждения легких оказался полезным в этой связи для зонда эндогенных посредников и путей разрешения. Будущие исследования, которые углубляют наше понимание этих активных процессов разрешения имеют обещание ведущих к терапевтическим агонисты, которые имитируют биодействия эндогенных липидов посредников для повышения разрешения воспаления и смягчения заболеваемости и смертность от ARDS и других важных заболеваний легких.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джозефа Мизгерда за его вклад в разработку избирательного внутрибронхического метода, а также за его полезные замечания и обзор рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов P01GM095467 (B.D.L.) и K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D.
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S.
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
