Summary
الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية إلى الرئة اليسرى في الفئران يؤدي إلى إصابة حادة حادة أحادية ومحدودة ذاتيا ً التي نماذج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة البشرية (ARDS) الناجمة عن شفط حمض المعدة.
Abstract
الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية من حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى القصبات الرئيسية المورين اليسار يسبب إصابة حادة في الأنسجة مع نتائج أمراض الأنسجة مماثلة لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة البشرية (ARDS). الوذمة السنخية الناتجة، وتلف الحاجز الخيفي- الشعري، وتسلل الكريات البيض تؤثر في الغالب على الرئة اليسرى، والحفاظ على الرئة اليمنى كسيطرة غير مصابة والسماح للالحيوانات بالبقاء على قيد الحياة. هذا النموذج من إصابات الرئة الحادة المحدودة ذاتيا تمكن من التحقيق في آليات تحليل الأنسجة، مثل الضامة efferocytosis من العدلات المبرمجة ورد سلامة الحاجز الخيفي الشعري. وقد ساعد هذا النموذج على تحديد الأدوار الهامة لمنبهين القرار، بما في ذلك الوسطاء المتخصصين المؤيدين لحل (SPMs)، وتوفير الأساس لتطوير نهج علاجية جديدة للمرضى الذين يعانون من ARDS.
Introduction
متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) هو سبب مهم لفشل الجهاز التنفسي الحاد1. وهو مرض شائع وقاتل أو معوق يحدث في 10٪ من جميع المرضى الذين أدخلوا إلى وحدات العناية المركزة في جميع أنحاء العالم2. وفقا لتعريف برلين3، يتم تعريف ARDS من قبل بداية حادة من فشل الجهاز التنفسي hypoxemic (<1 أسبوع) والتسلل الرئوي الثنائي على التصوير الإشعاعي للصدر التي لا يفسرها فشل القلب4. يتميز علم الباثوبيولوجيا الكامنة باستجابة التهابية مفرطة. يمكن أن تُصاب الرئة مباشرة، كما هو الحال في الالتهاب الرئوي أو مع شفط حمضالمعدة، أو بشكل غير مباشر، مثل الإنتان أو بعد عمليات نقل الدم المتعددة 4. بعد الإهانة الأولى، يتطور مسببات الأمراض ARDS على ثلاث مراحل: النضحي، التكاثري، والمراحل الليفية1. وتتميز هذه المراحل بآليات متميزة للمناعة والإصلاح الجزيئية والخلوية التي تحدد التكهن لمرضى ARDS. ولا تزال الرعاية الداعمة هي الدعامة الأساسية لمرضى مرضى الـ ARDS؛ حاليا، لا توجد علاجات دوائية فعالة لARDS، لذلك هناك حاجة ملحة لبحث جديد على هذه الحالة المدمرة4.
خلل تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية خلال مرحلة النضحي يساهم في ظهور حاد من ARDS وفشل الجهاز التنفسي المرتبط ة1. وسيط قوي المؤيدة للالتهابات الإشارات ينظم الاستجابات المناعية الأولية، مما يؤدي إلى تعطيل الحاجز الصدغي شعري، وذمة السنخية المنتشرة، وتسلل العدلات إلى موقع إصابة أنسجة الرئة4. في ARDS، إشارات الكبح غير فعالة لالتهاب حاد تستعد لفشل الرئة ويمكن أن تؤخر في الوقت المناسب الكاتاليس من أنسجة الرئة المصابة5. ولهذا الغرض، فإن التحقيق قبل السريريفي في الآليات المحلية للبدء والمؤيدة لحل ARDS قد يكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة. ويتطلب هذا التحقيق إجراء تجريبي محدود ذاتياً في نماذج من الإصابات الحادة في الرئة تشبه إلى حد كبير سمات الإصابة البشرية في الرئة، مما يسمح باستجواب الآليات الكامنة وراء مرحلتي البدء والقرار في إصابات الأنسجة.
ينتج نموذج المورين المعروض هنا إصابة رئوية حادة مباشرة توضح العمليات الباثوبيولوجية الأساسية لـ ARDS النضحي، وهي اضطراب الحاجز الخيفي- الشعري وتسلل العدلات. تعتمد هذه الطريقة على الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية من حمض الهيدروكلوريك من خلال تعليب القصبات الرئيسية اليسرى، وتوطين الإصابة والاستجابة الالتهابية للرئة اليسرى. يمكن استخدام الرئة اليمنى غير المصابة كجهاز تحكم داخلي لتحديد تحديد إصابة الأنسجة والالتهاب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إصابة الرئة من جانب واحد غير مميتة ويكشف عن برنامج قرار. وهذا يوفر نافذة متميزة في حل التهاب الرئة التي يمكن الاستفادة منها لتحديد الوسطاء الذاتيين المؤيدة لحل والآليات الخلوية وفتح سبل علاجية جديدة لARDS التي تؤكد على علم وظائف الأعضاء القرار و الصيدله.
Protocol
وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية أدناه والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في بريغام ومستشفى النساء (البروتوكول #2016N000356).
ملاحظة: تم اتباع تقنية معقمة لجميع إجراءات البقاء على قيد الحياة. تم إنشاء حقل معقم لكل عملية جراحية باستخدام منشفة الستائر المعقمة، في حين ارتدى الجراحون قفازات جراحية معقمة، وقبعات، وأقنعة، ومعاطف مختبر نظيفة. تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف، وتم الحفاظ على العقم باستخدام معقم حبة.
1. إعداد 0.1 N حمض الهيدروكلوريك
- أضف 11 مل من ddH2O إلى زجاجة العنبر. إضافة ببطء 1 مل من 37٪ حمض الهيدروكلوريك (12 N) لإنشاء 1 N حمض الهيدروكلوريك الأسهم العاملة.
تحذير: تأكد من إضافة حمض الهيدروكلوريك في الماء. هذا هو مصدر قلق السلامة لأن إضافة المياه مباشرة إلى حمض يمكن أن يسبب حمض ليغلي ودفقة من الزجاجة. عند التعامل مع حمض الهيدروكلوريك المركز، تأكد من الاحتفاظ بالحمض في غطاء محرك السيارة الكيميائية تنفيس ويتم ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة. - إضافة ببطء 4 مل من الأسهم العاملة حمض الهيدروكلوريك المخففة سابقا في 35 مل من ddH2O في أنبوب مخروطي 50 مل لإنشاء مخزون تجريبي 0.1 N حمض الهيدروكلوريك.
- قياس درجة الحموضة للمخزون التجريبي باستخدام مسبار الرقم الهيدروجيني الإلكتروني بعد معايرة نقطتين باستخدام حلول الرقم الهيدروجيني المنخفض. Titrate إلى درجة الحموضة 1.1 باستخدام حلول الأسهم هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك حسب الحاجة بحيث يكون الحجم النهائي 40 مل.
ملاحظة: قياس قيم درجة الحموضة المنخفضة يمكن أن يكون صعباً. لضمان القياس الدقيق، تأكد من معايرة مسبار الأس الهيدروجيني بشكل صحيح باستخدام معايير درجة الحموضة المنخفضة لتجنب الاستقراء المفرط للقياس. - قبل التجربة مباشرة، قم بتصفية 1-2 مل من مخزون حمض الهيدروكلوريك التجريبي من خلال فلتر معقم قدره 0.22 متر في أنبوب طرد مركزي معقم.
2. انتقائية داخل الشعب الهوائية غرس حمض الهيدروكلوريك
-
إعداد المنطقة الجراحية
- حث التخدير العام عن طريق تقديم الكيتامين (100 ملغ / كغ) وزيلازين (10 ملغ / كغ) عن طريق الحقن داخل اقابي. تأكد من أن الماوس يتم التخدير تماما عن طريق الضغط بلطف غيض من الذيل أو القدم الخلفية. عدم وجود استجابة الانسحاب مطلوب قبل إجراء شق الجلد. إدارة التخدير إضافية boluses، إذا لزم الأمر.
- تسليم 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين تحت الجلد تحت الجلد تحت الجلد تحت سكوف من الرقبة. سوف مسكن ما قبل الجراحة تعزيز تأثير التخدير، وسوف يخفف من الألم قبل وبعد العملية الجراحية الناجمة عن الإجراء.
- استخدم المقصات الكهربائية لحلاقة المنطقة الجراحية بلطف على السطح البطني للماوس، تحت الذقن في منطقة عنق الرحم من الحلق، وذلك باستخدام السكتات الدماغية البطيئة. إزالة الفراء فضفاضة لفضح تماما الجلد الكامنة.
- إعداد المنطقة الجراحية عن طريق مسح الموقع حلق مع 10٪ محلول اليود البوفيدون. بعد تطبيق الحل العقيم، وتنظيف الموقع باستخدام مسحة الكحول isopropyl 70٪. كرر هذه الخطوة 3x.
-
عزل القصبة الهوائية
- ضع الماوس في وضع السوبين على لوحة جراحية نظيفة وغطي الفأر في ستارة جراحية معقمة مع الحفاظ على التعرض للمنطقة الجراحية. تأمين الستائر في مكانها.
- قم بعمل شق طولي بطول 0.5 سم في الجلد فوق القصبة الهوائية والغدد اللعابية. استخدام ملقط مسننة منحنية قليلا لسحب الجلد بعناية وفصل بلطف الغدد اللعابية لفضح عضلات القصبة الهوائية.
- باستخدام ملقط مسننة للتشريح الحاد، دفع بلطف بعيدا العضلات التراغاموية وندف بعيدا اللفافة التي تحيط القصبة الهوائية حتى يتم الكشف عن حلقات الغضروف من القصبة الهوائية تماما.
- استخدم ملقط مسنن منحني بالكامل لرفع القصبة الهوائية وفصل النسيج الضام بين القصبة الهوائية الرجعية واللفافة الرجعية. بمجرد فصل النسيج الضام، يجب أن ينزلق طرف الملقط تماما وراء القصبة الهوائية.
- حافظ على الملقط المنحني خلف القصبة الهوائية وامسك قطعة من الحرير 4-0 مضفر ة بطول 10-15 سم مع أطراف الملقط. سحب خياطة وراء القصبة الهوائية بحيث يكون هناك طول حتى على جانبي.
- مرة واحدة في خياطة في مكان، وسحب بلطف الجانبين من خياطة نحو الجزء الخلفي من الماوس وعقد الجانبين في المكان.
-
استئصال القصبات الرئيسية اليسرى بشكل انتقائي وغرس حمض الهيدروكلوريك
- تناول قسطرة وعائية مقاس 24 G × 3/4 "وأدخل الإبرة، وشطبة، في المنطقة الأمامية من القصبة الهوائية بين الحلقتين الأولى والثانية للالقصبة الهوائية. مرة واحدة يتم تأكيد الإدراج السليم عن طريق التصور المباشر للطرف إبرة في تجويف القصبة الهوائية، وإطلاق سراح خياطة وتقدم قنية على الإبرة وإلى القصبة الهوائية حتى يتم التوصل إلى المقاومة، ثم سحب الإبرة. زاوية اتجاه الإدراج نحو الشعب الهوائية الجذعية الرئيسية اليسرى لغرس انتقائي في الرئةاليسرى.
- بمجرد أن تكون القنية في مكانها، أدرك بقوة منفذ الحقن لمنع القسطرة من التحول.
- باستخدام ماصة P200 ونصائح ماصة P200 معقمة، غرس 2.5 مل / كغ (50 ميكرولتر ل20 غرام ماوس) من معقمة تصفية 0.1 N حمض الهيدروكلوريك في القسطرة، تليها كمية متطابقة من الهواء.
- سحب القسطرة بسرعة ورفع المجلس الجراحي إلى زاوية 60 درجة لمدة 30 ق.
-
إغلاق المنطقة الجراحية
- وضع المجلس الجراحي شقة وإزالة خياطة من وراء القصبة الهوائية.
- استخدم 4-0 غرزة حريرية مضفرة مغلفة بالشمع لإغلاق شق الجلد باستخدام 2-3 غرز.
3. الرعاية بعد العملية الجراحية
- بمجرد إغلاق الشق، ضع الماوس على جانبه الأيسر على وسادة تدفئة دافئة حتى يتعافى الماوس من التخدير. البدء في رصد الماوس للألم ومستوى النشاط قبل إعادته إلى السكن العادي.
ملاحظة: يجب أن تدار البوبرينورفين في 0.1 ملغ / كغ تحت الجلد كل 6-12 ساعة لأول 24 ساعة. إذا كان الألم اختراق مستمر موجود، تمديد نظام مسكن حتى تهدأ الألم.
4. كامل الرئة القصبيات الفيناج (BAL) والكريات البيض المناعية
-
قتل الفأر عن طريق إعطاء 3X جرعة الكيتامين / xylazine المستخدمة في الخطوة 2.1.1.
- للتمييز بين العدلات الخلالية وداخل الأوعية الدموية، حقن عن طريق الوريد الأجسام المضادة Ly6G المسماة بفلوروفور محددة 5 دقائق قبل القتل الرحيم. وينبغي أن تكون هذه التسمية مناسبة للكشف عن طريق قياس التدفق للقناة للتمييز بين العدلات داخل الأوعية الدموية من العدلات الخلالية والسنخية، والتي سيتم وصفها أثناء إعداد الأنسجة مع فلوروفور مختلفة (انظر أدناه).
- وضع الماوس على لوحة جراحية وربط القواطع الأمامية حول حلقة من خياطة الحرير مضفر 2-0.
- اتبع الخطوات 2.2.2-2.2.6. لإعداد القصبة الهوائية للتعليب.
ملاحظة: تأكد من عدم ثقب الحجاب الحاجز لزيادة الضغط المنفخ عبر السنخية أثناء غسل الرئة. انخفاض الامتثال للرئة اليسرى بعد الإصابة، والتي قد تتطلب متطلبات ضغط أعلى عبر السنخية لغسل الرئة. - كانوليت القصبة الهوائية بعد الخطوة 2.3.1، ولكن لا تقدم القسطرة تحت الكارينا. أدخل القسطرة موازية للالقصبة الهوائية.
- مع إدخال القسطرة، اربط الغرزة حول القصبة الهوائية للحفاظ على القسطرة في مكانها.
- غرس وسحب اثنين من aliquots 1 مل على التوالي من الجليد الباردPBS -/- (بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم) مع 0.6 MEDTA باستخدام حقنة 1 سم مكعب. للنماذج المناعية عن طريق قياس التدفق الخلوي، قم بإزالة كل aliquot والعودة إلى أنبوب 5 مل البوليسترين FACS على الجليد.
- لضمان القتل الرحيم، إجراء استئصال الصدر باستخدام مقص الجراحية تليها ثقب القلب. يمكن حصاد الرئتين لمزيد من المعالجة.
- الطرد المركزي بال لمدة 10 دقيقة في 800 غرام في 4 درجة مئوية لبيليه الخلايا.
- Decant supernatant في أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل وaliquot في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. يُحفظ عند -80 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
- إعادة تعليق بيليه الخلية في PBS -/- مع 2٪ FBS لتحليل تفاضلي الكريات البيض عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- للتمييز بين العدلات الخلالية وداخل الأوعية الدموية، قم بإزالة الرئة اليسرى واليمنى بشكل منفصل ومعالجة الرئتين لتدفق قياس السيتومترية كما هو الحال في عبد النور وآخرون 20146.
- وصمة عار تعليق الخلية الناتجة باستخدام الأجسام المضادة FACS مختارة، والتأكد من وصمة عار لLy6G التي هي مترافقة مع فلوروفور مختلفة من الأجسام المضادة Ly6G من الخطوة 4.1.1.
5. تقييم نفاذية الحاجز السنخي باستخدام صبغة إيفان الزرقاء (EBD)
- حقن عن طريق الوريد صبغ إيفان الأزرق (40 ملغ / كغ) 30 دقيقة قبل القتل الرحيم.
- قتل الفأر باستخدام الكيتامين / إكسلازين جرعة زائدة (الخطوة 4.1).
- لقياس سلامة الحاجز السنخي، اتبع الخطوات 4.2-4.9 لجمع BAL.
- نقل 100 ميكرولتر من BALF إلى أسفل واضح 96 جيدا ميكروبليت، جنبا إلى جنب مع 100 درجة مئوية من معايير EBD مكررة. استخدام PBS -/- كفراغ.
- استخدام قارئ لوحة صغيرة لقياس امتصاص BALF في 620 نانومتر و 740 نانومتر. استخدام امتصاص في 740 نانومتر لتصحيح التلوثheme في العينات 7.
- لقياس سلامة حاجز الأوعية الدموية، تتغلغل الرئتين عن طريق حقن ببطء 5 مل من الجليد الباردPBS -/- من خلال البطين الأيمن للقلب. إزالة الرئة اليسرى.
- تجفيف الرئة اليسرى لمدة 72 ساعة عند 58 درجة مئوية لإزالة المياه الزائدة.
- معالجة أنسجة الرئة المجففة كما هو الحال في رادو وChernoff 20138, وقياس الامتصاص في 620 نانومتر و 740 نانومتر.
6. علم أنسجة الرئة
- تُمكن القصبة الهوائية باتباع الخطوات من 4.1 إلى 4.5.
- للضغط على الرئتين في 20 سم H2O، استخدم حامل حلقة ومشبك لرفع حقنة 60 مل مزودة بأنابيب التحكم في الصمام ومليئة بمحلول تثبيتي محدد (على سبيل المثال، تثبيت الزنك) بحيث يكون الغضروف المفصلي للمحلول المصلح 20 سم فوق الرئتين.
- قم بإرفاق الأنابيب بالقسطرة وافتح القيمة. ملء ببطء الرئتين مع المثبت حتى تتوقف عن تضخيم.
- إزالة القسطرة 3/4 من الطريق للخروج من القصبة الهوائية. اربط القصبة الهوائية بخياطة قبل إزالة القسطرة بالكامل لتقليل فقدان المثبت.
- إزالة الرئتين والقلب في كتلة.
ملاحظة: تأكد من عدم ثقب الرئتين أثناء الإزالة للاحتفاظ بالضغط الممزوج بالإصلاح. - إصلاح الرئتين لمدة 24 ساعة في 25 مل من المثبت في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الرئتين الثابتة لفترات 20 دقيقة متسلسلة في PBS -/-، 30٪ الإيثانول، و الإيثانول 50٪.
- بعد الغسيل الأخير، تخزين الرئتين في الإيثانول 70٪ لمعالجة الأنسجة كما هوالحال في Eickmeier وآخرون.
Representative Results
انتقائية داخل الشعب الهوائية حمض الهيدروكلوريك يؤدي إلى إصابة حادة من جانب واحد في الرئة
يتم توضيح طريقة الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية من حمض الهيدروكلوريك في القصبات الرئيسية اليسرى في الشكل 1A. وتنطوي إصابة الرئة الحادة المترتبة على ذلك على الرئة اليسرى بأكملها، وبعد إعطاء الوريد من EBD وضخ الرئة، بقي EBD فقط في الرئة اليسرى (الشكل1B). تم تحديد حجم الدمج في الرئة اليسرى ووجد أنه قد زاد بشكل ملحوظ بالنسبة للغرس الانتقائي الوهمي (الشكل1C؛مقتبس من عبد النور وآخرون 20146). ردا على إصابة الرئة ، تعميم الكريات البيض في الأنسجة الملتهبة. في هذا النموذج، تخضع العدلات الوعائية للهجرة عبر بطانة الرحم إلى الانترستيوم الرئوي المصاب. العدلات الخلالية المتراكمة في الرئة اليسرى 24 ساعة بعد غرس حمض الهيدروكلوريك، على النقيض من الرئة اليمنى حيث لوحظ عدد قليل من العدلات الخلالية (الشكل1D). وتشير هذه النتائج إلى أن طريقة الغرس الرئيسية اليسرى الانتقائية داخل الشعب الهوائية أدت إلى إصابة الرئة الحادة في المورين التي تم توطينها إلى حد كبير في الرئة اليسرى وأنتجت التغيرات المرضية التي ينظر إليها أيضا مع ARDS الإنسان، بما في ذلك زيادة اختراق الحاجز الخيفي والشعرية وتسلل العدلات.
إصابة الرئة الحادة من جانب واحد تمكن من التحقيق في آليات الحل
لدراسة مرحلة الحل من الفئران إصابة الرئة الحادة الناجمة عن حمض يجب أن تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة الإهانة الأولية. متميزة عن حمض الهيدروكلوريك داخل القصبة الهوائية، وغرس في القصبات الرئيسية اليسرى يؤدي فقط إلى إصابة محدودة ذاتيا مع البقاء على قيد الحياة موحدة في الفئران صحية خلاف ذلك. يمكن الحصول على الرئتين من الفئران في نقاط زمنية مبكرة أو لاحقة كما هو الحال في الشكل 2A. الأنسجة الرئوية يظهر إصابة الأنسجة والتهاب على مستوى الجهاز والخلوي مع التهاب النضحي 24 ح بعد الإصابة التي تتميز وذمة السنخية ملحوظ وتسلل العدلات في الرئة اليسرى. لاحظ أنه لا توجد إصابة كبيرة أو تدفق الكريات البيض في الرئة اليمنى السيطرة غير المصابة (الشكل2A). 72 ح بعد الإصابة، يتم تقليل وذمة والتسلل الخلوي بشكل كبير، مما يمثل مرحلة النضحي حل. يمكن رصد العدلات السنخية عن طريق قياس التدفق (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) التي تم الحصول عليها عن طريق غسل الرئة كله. العدلات زيادة في الرئة اليسرى 24 ح بعد الإصابة الأولية وانخفاض كبير في 48 و 72 ح (الشكل2B). إذا تم التحقيق في نقاط زمنية لاحقة، فإن أرقام العدلات تعود إلى خط الأساس ويمكن دراسة الآليات في المراحل اللاحقة من الكاتاليس، مثل الاستجابات الليفية التكاثرية.
الشكل 1: الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية تنتج إصابة الرئة من جانب واحد التي تحددها اختراق حاجز السنخيووالتسلل العدلات. (أ) تمثيل تعليب الشعب الهوائية الرئيسية اليسرى للصفيحة بالخلايا الرئيسية للغرس الانتقائي للحمض الهيدروكلوري كال في الرئة اليسرى. (B) استئصال اليمين (RL) واليسار (LL) الرئتين المعرضة لغرس حمض انتقائية وperfused بعد صبغة إيفان الزرقاء عن طريق الوريد. (ج) التحديد الكمي للصبغة الزرقاء لإيفان الخلالي من الرئة المتجانسة، المنصهرة 24 ساعة بعد إصابة الحمض أو السيطرة الشامية؛ الرقم &a ةيلطاب م القيم تمثل يعني ± SEM، حيث ن ≥ 5. *p < 0.05, Mann-Whitney U Test. (D) قياس التدفق التمثيلي للخلايا داخل الأوعية الدموية (I.V.; fluorophore 1) والخلالي (I.S.; fluorophore 2) العدلات كنسبة مئوية من إجمالي CD45+ الخلايا في الرئة المجهزة 24 ساعة بعد إصابة حمض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إصابة الرئة الحادة من جانب واحد هي الحل الذاتي. (أ) علم الأنسجة H&E التمثيلي (10x) من الرئتين اليسرى التي تم الحصول عليها من الفئران السذاجة (0 ساعة) أو الفئران 24، 48، 72 ساعة بعد الإصابة، جنبا إلى جنب مع الرئة اليمنى المرتبطة من نفس الفأر (شريط مقياس = 250 م). (B) قياس التدفق التمثيلي للالعدلات السنخية (Ly6G+ CD11b+) التي تم الحصول عليها من غسل الرئة كله كنسبة مئوية من إجمالي CD45+ الخلايا في السذاجة (0 ح) الفئران أو الفئران 24، 48، و 72 ح بعد إصابة حمض. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تستخدم طريقة الغرس داخل الشعب الهوائية الموصوفة هنا التعليب الانتقائي للقصبات الرئيسية اليسرى لغرس حمض الهيدروكلوريك في الرئة اليسرى، مما أدى إلى إصابة حادة من جانب واحد وحد ذاتي من البول. هذا النموذج إصابة الرئة حمض المورين يمثل عن كثب الاستجابة الالتهابية، علم أمراض الأنسجة، والخلل الفسيولوجي ينظر في ARDS الإنسان، حيث شفط حمض المعدة هو عامل شائع أو مساهم4. التعرض للمجرى الهوائي إلى درجة الحموضة HCl منخفضة يؤدي إلى زيادة نفاذية الحاجز الخيفي الشعيرات الدموية، وذمة السنخية، وتسلل العدلات العميق في موقع الإصابة. لا يتم ملاحظة هذه الأحداث في الرئة اليمنى غير المصابة. وبالإضافة إلى ذلك، ينتج هذا النموذج استجابات التهابية سريعة تبلغ ذروتها في غضون 24 ساعة بعد غرس الحمض، وتشترك في التغيرات في التعبير الجيني مع ARDS الإنسان، مثل التعبير التفاضلي من phospholipase D isoforms10.
على الرغم من أن هذا النموذج ما قبل السريرية murine يستنسخ العديد من ملامح ARDS على المستويات الجزيئية والخلوية والأنسجة، فإنه لا يلخص تماما ARDS الإنسان. ويشمل تعريف ARDS مشاركة الرئة الثنائية3، في حين أن طريقة الغرس الموصوفة هنا النتائج عن طريق التصميم في أمراض الرئة من جانب واحد. وعلاوة على ذلك، فإن الحيوانات لا تتطلب التهوية الميكانيكية المستمرة، والجمود، أو التخدير عن طريق الصالح. النتائج المعروضة هنا (vide أعلاه) وفي أماكن أخرى6و9و11و12و13 تثبت أن إصابات الرئة الناجمة عن حمض من جانب واحد تستنسخ معظم السمات المرضية لل ARDS مع توفير فرصة فريدة لاستخدام الرئة الصحيحة كرقابة داخلية ودراسة مرحلة حل هذا المرض. وعلى هذا النحو، فإن النموذج الذي نوقش هنا نماذج ARDS pathobiology، ولكن أيضا تمكن التحقيق الآلي من الاستجابات أنسجة الرئة الأساسية للإصابة وآليات الحل التي قد تكون ذات صلة لمعالجة هذا المرض المهم.
غرس حمض الهيدروكلوريك يمثل إصابة الرئة الحادة المباشرة، لذلك هو النمذجة جوانب الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة التهاب الرئة الطموح. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء إهانة الرئة اليسرى الأولية في هذا النموذج باستخدام حمض الهيدروكلوريك المعقمة بدلا من محتويات المعدة المحملة بالبكتيريا ينظر إليها في بعض الأحداث الطموح البشري التي يمكن أن تؤدي أيضا إلى الالتهاب الرئوي14. في البشر ، يمكن أن يؤدي طموح البكتيريا المسببة للأمراض إلى الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي الذي يزيد من تفاقم الاستجابة الالتهابية الحادة ، وإطالة فترة إصابة الرئة الأولية وزيادة قابلية المريض لتطوير ARDS14. وقد تم معالجة هذا القيد المحتمل من قبل المحققين عمدا غرس البكتيريا المسببة للأمراض Escherichia coli (E.coli)15 بعد HCl المعقمة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في مسببات الأمراض بوساطة التهاب. يمكن أن يسبب الالتهاب الرئوي البكتيري من جانب واحد عن طريق غرس الرئة اليسرى انتقائية من البكتيريا، مثل E.القولونية16،17، Pseudomonas aeruginosa16،والعقدية الرئوية 18 . ويمكن أيضا استخدام نموذج إصابة الرئة الحادة المحدودة الذاتي الموصوفة هنا لدراسة إصابات الرئة الناجمة عن التنفس الصناعي (VILI)، وهو سبب هام لزيادة الوفيات في ARDS البشرية19. عادة ما تنطوي النماذج الحيوانية التجريبية من فيلي التهوية الميكانيكية في الفئران السذاجة مع أحجام المد والجزر التي هي أعلى بكثير مما هو يستخدم سريريا للتسبب في إصابة الرئة (> 15 مل / كغ؛ انظر العمل السابق20،21). نحو نموذج أكثر أهمية سريريا من فيلي، يمكن استخدام غرس حمض الشعب الهوائية كما هو موضح هنا أولا للحث على إصابة الرئة غير المميتة تليها التهوية الميكانيكية في أحجام المد والجزر ضمن النطاق السريري (6-12 مل / كغ). هذا النموذج الحيواني الافتراضي قد يسمح للمحققين لدراسة فيلي بطريقة ذات صلة سريريا بمجرد تطويرها والتحقق من صحتها. معا، هذه النماذج مورين تسليط الضوء على براعة طريقة الغرس داخل الشعب الهوائية الانتقائية لتوليد الشتائم الرئة من جانب واحد التي تشبه إلى حد كبير الأمراض المرتبطة بأمراض الرئة البشرية.
بالإضافة إلى السماح بغرس انتقائي لمختلف العوامل الضارة في الرئة اليسرى، فإن تقنية الغرس داخل الشعب الهوائية بعد استئصال القصبة الهوائية لا تتطلب تدريبًا طويلًا، أو وقتًا طويلًا للإجراءات، أو معدات معقدة، وفي أيدي ذوي الخبرة يسبب الحد الأدنى من الضائقة للالحيوانات. على الرغم من ذلك، قد تحدث العديد من المشكلات أثناء إجراء غرس حمض الهيدروكلوريك الانتقائي الذي يمكن أن يؤثر على النتائج التجريبية. يمكن أن يؤدي التعليب غير السليم للقصبات الجذعية الرئيسية اليسرى إلى إصابة الرئة الثنائية التي تقلل من بقاء الفئران التجريبية ويخلط استخدام الرئة اليمنى كتحكم داخلي غير مصاب. ويمكن تجنب ذلك عن طريق صيد القسطرة بما فيه الكفاية نحو الرئة اليسرى أثناء التعليب حتى يتم التوصل إلى المقاومة. بعد حقن حمض الهيدروكلوريك ، يجب حقن بولوس من الهواء ، وإزالة القسطرة بسرعة ، والمجلس الجراحي جلبت تستقيم إلى زاوية 60 درجة. هذه الخطوات حاسمة لضمان وصول الحمض إلى المسالك الهوائية البعيدة للرئة اليسرى ويمنع ارتجاع الحمض في الرئة اليمنى والقصبة الهوائية، والتي قد تسبب إصابة القريبة. في غضون 24 ساعة بعد الغرس، تنتشر الإصابة في الرئة اليسرى مع وذمة رئوية واسعة النطاق، مما يؤثر على كل من الرئة اليسرى البعيدة والقريبة.
أثناء طريقة تطوير في بالغ 8-12 أسبوع فئران قديمة, 2.5 [مل/كغ] من [إين-برونش] [هكل] ينتج جوهريّة بعد [سوبفكت] حادّة رئة إصابة; لم تسفر الجرعات المنخفضة من حمض الهيدروكلوريك عن إصابة رئوية قابلة للاستنساخ ومتجانسة. على الرغم من أننا لم يؤدي هذا النموذج في أصغر سنا (على سبيل المثال، 3-6 أسابيع من العمر) أو الفئران الأكبر سنا (على سبيل المثال، 10-14 شهرا من العمر)، ونحن نتوقع أن التعمّد القائم على الوزن من حمض الهيدروكلوريك سيؤدي إلى النمط الظاهري لإصابة الرئة مماثلة لما لوحظ في الفئران القديمة 8-12 الأسبوع. نوصي بأن المحققين titrate جرعات حمض الهيدروكلوريك لتحقيق الدرجة المطلوبة من إصابة الرئة قبل إجراء تجارب مع الفئران في أقصى درجات الوزن.
يوفر إجراء الغرس الحمضي الانتقائي هذا نموذج ًا غير قاتل من المورين من التهاب الأنسجة المعقمة الذي يقلل من الحاجة إلى الرعاية الداعمة، مثل التهوية الميكانيكية. مع البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الفئران المصابة، والالتهاب الناجم عن حمض لديه ما يكفي من الوقت لحل الذات. وقد استخدمت مرحلة الحل من هذا النموذج لتحديد الوسطاء الدهون النشطة بيولوجيا الذاتية المنظمة زمنيا، ودعا الوسطاء المتخصصة المؤيدة لحل (SPMs)، مثل lipoxin A4 (LXA4)،maresin 1 (MaR1)، وresolveins6 ،11،12،16. إدارة SPMs الخارجية للفئران المصابة يسرع من حل إصابة الرئة الناجمة عن حمض عن طريق تثبيط الآليات الالتهابية وتعزيز الحفز من أنسجة الرئة المصابة. هذه SPMs تعزيز إزالة وذمة السنخية12، وزيادة efferocytosis من العدلات المبرمجة من قبل الضامة المعين16، وتسريع إعادة الظهارة من المسالك الهوائية والحويصلات الهوائية12 للحد من الأوعية الدموية التسرب ونقص الأنسجة. في نموذج من إصابة الرئة الناجمة عن مسببات الأمراض، 15-epi-resolvein D1 عرضت أيضا الإجراءات المضادة للميكروبات من خلال زيادة الفيغوستيرية البكتيرية عن طريق الضامة وتعزيز إزالة البكتيرية من الرئة المصابة16. التحقيق في هذه الآليات حل الذاتية يوفر نظرة ثاقبة في الاستراتيجيات العلاجية الجديدة المحتملة للمرضى الذين يعانون من ARDS5.
لدراسة أفضل تنظيم spatiotime من آليات القرار، في نماذج تجريبية في الجسم الحي هناك حاجة. يجب أن تتضمن نماذج إصابات الرئة الحادة استجابات التهابية حادة ذات صلة وخلل في الأعضاء مع مشاركة قرار المضيف تعزيز العمليات الجزيئية والخلوية. ويمكن تحديد هذه الآليات كميا باستخدام مؤشرات الاستبانة المعمول بها22. وقد ثبت أن طريقة الغرس الانتقائيداخل الشعب الهوائية لتوليد إصابات حادة من جانب واحد في الرئة مفيدة في هذا الصدد للتحقيق في وسطاء الحل المحلي والمسارات. الدراسات المستقبلية التي تعمق فهمنا لعمليات التسوية النشطة هذه لديها وعد بقيادة الناهضات العلاجية التي تحاكي الإجراءات الحيوية لوسطاء الدهون الذاتية لتعزيز حل الالتهاب والتخفيف من الاعتلال ووفيات مرض الأربيد والأمراض الرئوية الهامة الأخرى.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جوزيف ميزجرد على إسهاماته في تطوير الطريقة الانتقائية داخل الشعب الهوائية وعلى تعليقاته المفيدة ومراجعته للمخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح P01GM095467 (B.D.L.) وK08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S. Aspiration Pneumonia. New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
