Summary
このプロトコルは、自由に動くマウスの2つの脳領域に9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイの構築について説明する。また、オプトシリコンプローブを複数の目的で安全に回収・再利用する方法も実証されています。
Abstract
多地域の神経記録は、複数の脳領域間の微細な時間スケールの相互作用を理解するために重要な情報を提供することができます。しかし、従来のマイクロドライブ設計では、単一または複数の領域から記録する電極の1種類のみを使用することが可能で、単一ユニットまたは深度プロファイル記録の収率が制限されます。また、多くの場合、電極記録と光遺伝学的ツールを組み合わせて経路や細胞タイプの特定の活性を標的にする機能を制限します。ここでは、収量を最適化するためにマウスを自由に移動するためのハイブリッドマイクロドライブアレイと、マイクロドライブアレイの製造と再利用の説明を示します。現在の設計は自由に動くマウスで同時に2つの異なった脳区域に埋め込まれる9つのテトロデスおよび1つのオプトシリコンの調査を採用する。テトロデスおよび光シリコンプローブは、ユニットおよび振動活性の収率を最大化するために、脳内の背筋軸に沿って独立して調整可能です。このマイクロドライブアレイには、光のセットアップが組み込まれ、光遺伝学的操作を媒次化して、長距離神経回路の局所または細胞型固有の応答と機能を調べることもできます。さらに、オプトシリコンプローブは、各実験後に安全に回収し、再利用することができます。マイクロドライブアレイは3Dプリント部品で構成されているため、様々な設定に合わせてマイクロドライブの設計を簡単に変更できます。最初に説明したマイクロドライブアレイの設計と光遺伝学実験用のシリコンプローブに光ファイバを取り付ける方法、続いてテトロードバンドルの製造とアレイのマウス脳への移植方法について説明します。光遺伝学的刺激と組み合わせた局所視野電位とユニットスパイクの記録はまた、自由に動くマウスにおけるマイクロドライブアレイシステムの実現可能性を実証する。
Introduction
ニューロン活動が学習や記憶などの認知プロセスをどのようにサポートしているかを理解することは、異なる脳領域が動的にどのように相互作用するかを調べていくうえで重要です。認知タスクの根底にある神経活動のダイナミクスを解明するために、マイクロドライブアレイ1、2、3、の助けを借りて自由に動く動物において、大規模な細胞外電気生理学が行われてきた。 4.過去20年間で、いくつかのタイプのマイクロドライブアレイは、ラット5、6、7、8およびマウス9の複数の脳領域に電極を移植するために開発された。10歳,11歳,12.それにもかかわらず、現在のマイクロドライブの設計は、一般的に複数のプローブタイプの使用を許可していない、研究者は、特定の利点と制限を持つ単一の電極タイプを選択することを余儀なくされています。例えば、テトロード配列は、後部海馬CA11、13などの人口密度の高い脳領域に適していますが、シリコンプローブは解剖学的接続を研究するためのより良い幾何学的プロファイルを与えます14 ,15.
テトロデスとシリコンプローブは、多くの場合、生体内慢性記録に使用され、それぞれが独自の長所と短所を持っています。テトロデスは、費用対効果と機械的剛性に加えて、単一の電極16、17よりも優れた単一ユニット絶縁で重要な利点を有することが証明されています。彼らはまた、マイクロドライブ8、18、19、20と組み合わせると、単一ユニット活動のより高い収率を提供します。神経回路21の機能を理解するために同時に記録されたニューロンの数を増やすることが不可欠である。例えば、時間関連の22細胞や報酬コーディング23細胞などの機能的に異種細胞タイプの小さな集団を調査するためには、多数の細胞が必要である。スパイクシーケンス13、24、25のデコード品質を向上させるためには、はるかに高いセル番号が必要です。
しかし、テトロデスは、皮質や視床など、空間的に分布する細胞を記録する上で欠点がある。テトロデスとは対照的に、シリコンプローブは、局所的な電界電位(LFP)の空間分布および相互作用を提供し、局所構造14,26内のスパイク活動を提供することができる。マルチシャンクシリコンプローブは、記録部数をさらに増やし、単一または隣接する構造27間で記録を可能にする。しかし、このようなアレイは、テトロデスに比べて電極部位の位置決めにおいて柔軟性が低い。さらに、高密度プローブでは、tetrodes28、29、30によって取得されたデータをミラーリングするために、隣接チャネルのアクションポテンシャルに関する情報を抽出するために、複雑なスパイクソートアルゴリズムが必要です。したがって、単一ユニットの全体的な収率は、多くの場合、テトロデスよりも低いです。さらに、シリコンプローブは、その脆弱性と高コストのために不利です。したがって、テトロデス対シリコンプローブの選択は、記録の目的に依存し、記録部位で高い単一単位または空間プロファイリングの高い収率を得るかどうかが優先されるかどうかが問題である。
神経活動を記録することに加えて、光遺伝学的操作は、特定の細胞の種類や経路が神経回路機能にどのように寄与するかを調べる神経科学のより強力なツールの一つとなっています13,31, 32、33.しかし、光遺伝学的実験は、光源34、35、36に光ファイバコネクタを取り付けるためにマイクロドライブアレイ設計に追加の考慮を必要とする。多くの場合、光ファイバを接続するには比較的大きな力が必要であり、脳内のプローブの機械的シフトにつながる可能性があります。したがって、従来のマイクロドライブアレイに埋め込み型光ファイバを組み合わせるのは簡単な作業ではありません。
上記の理由から、研究者は、電極の種類の選択を最適化するか、記録の目的に応じて光ファイバを埋め込む必要がある。例えばテトロデスは海馬1、13においてより高い単位収率を達成するために使用され、シリコンプローブは中間内皮質(MEC)37などの皮質領域の層深度プロファイルを調製するために使用される。現在、テトロデスとシリコンプローブの同時移植のためのマイクロドライブは、ラット5,11について報告されていた。しかし、マイクロドライブの重量、マウスヘッド上のスペースの限り、異なるプローブを採用するようにマイクロドライブを設計するための空間要件のために、マウスに複数のテトロデスとシリコンプローブを埋め込むことは非常に困難です。マイクロドライブなしでシリコンプローブを埋め込むことは可能であるが、この手順はプローブの調整を可能にせず、シリコンプローブ回収12、38の成功率を低下させる。さらに、光遺伝学的実験は、マイクロドライブアレイ設計に追加の考慮事項を必要とします。このプロトコルは、自由に動くマウスで慢性記録用のマイクロドライブアレイを構築して移植する方法を示し、9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にする。このマイクロドライブの配列はまたシリコン調査の光遺伝学的実験そして回復を促進する。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、テキサス大学サウスウェスタン医療センターの機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. マイクロドライブアレイ部品の準備
- 歯科用モデル樹脂を使用して3Dプリンタを使用してマイクロドライブアレイ部品を印刷します(図1A,B)。個々の 3D プリント レイヤーの厚さが 50 μm 未満であることを確認して、印刷された部品の小さな穴を明確かつ実行可能に保ちます。
注:マイクロドライブアレイは、(図1C)、(1)テトロデス用のマイクロドライブネジ9本とシリコンプローブ用ネジ1本を含むマイクロドライブアレイの本体で構成されています(図1Ca-d)。下部のオプトシリコンプローブのテトロードバンドルと穴の調整は、標的脳領域の座標に依存します(図1Cd)。(2)シリコンプローブまたはオプトロードを取り付けるシャトル(図1Ce)。(3)シリコンプローブコネクタを保持するプローブ電気ネクタマウント(図1Cf);(4)光ファイバコネクタを差し込む/抜くときに埋め込まれた光シリコンプローブの望ましくない動きを防ぐために、体の中央部分にクランプするファイバーフェルールホルダー(図1Cg)。(5)マイクロドライブアレイに物理的および電気的シールドを提供するシールドコーン(図1Ch)。マイクロドライブアレイの総重量は、シールドコーンを含む5.9gです(表1)。印刷部品に穴が詰まっている場合は、ドリルビットを使用して穴をドリルアウトします:内部穴の#76、テトロードマイクロドライブネジ用の外側の穴の#68、テトロードマイクロドライブスクリューサポーター穴の#71、下部のガイドポストの穴の#77体。 - マイクロドライブアレイ本体へのガイドポストの挿入。
- 26Gaステンレス鋼線の2つの16ミリメートルの長さをカットします。ロータリーグラインダーを使用してワイヤチップをそっと研ぎます。
- 本体の底部穴にワイヤーを挿入します(図2A)。ガイドポストを確保するために、体の底部にシアノクリレート接着剤の少量を適用します。
2. オプトシリコンプローブ調製
- シリコンプローブ用のマイクロドライブネジを準備します。
注:シリコンプローブのマイクロドライブネジは、サポートチューブをサポートするカスタムネジ(300μmピッチ)とL字型チューブ(図2B)で構成されています。- マイクロドライブヘッド用の金型を準備します(図2C)。金型を構築するには、マイクロドライブの3Dプリントプラスチックパターンを用意します(図2Ca)。次に、パターンの周りにテープを入れて時間壁を作った後に液体シリコーンゲルを注ぎます。そっと振って気泡を取り出し、硬化するまで待ってから、パターンからシリコーンゲル型を取り除きます(図2Cb)。
- ロータリーグラインダーを使用して、23Gステンレスワイヤーの18 mmと9.5 mmの長さをカットします。歯科アクリルの接着性を高めるために回転式粉砕機でワイヤーの上の2-3ミリメートルを粗くする。
- 1つのカスタムネジを取り、歯科アクリルとの摩擦を減らすためにシリコンオイルの少量を適用します。ワイヤーとカスタムスクリューを金型にセットします。
- ワイヤーとネジの周りの気泡を除去するために、注射器を使用して金型に歯科アクリルを注ぎます。気泡汚染はマイクロドライブを壊れやすくします。歯科用アクリルが完全に硬化するまで待ってから、型からマイクロドライブネジを取り外します。ペンチを使用して60°の角度に長いワイヤー先端の6ミリメートルを曲げます。
- マイクロドライブネジ(ひび割れ、気泡、摩擦など)の品質を確認して、ネジを回転させます。摩擦が大きい場合は、マイクロドライブネジと組み合わせるカスタマイズされたドライバチップを備えた電動スクリュードライバを使用して滑らかになるまでネジを回転させます。
- マイクロドライブネジをマイクロドライブアレイ本体に取り付け、ネジを回してスムーズに上下に動くかどうかを確認します。ねじのねじは、本体の穴にネジを挿入すると自動的に作成されます。
- シャトルを準備します(図3Aa)。
- 鋭いはさみを使用して、ポリエーターケトン(PEEK)チューブの2つの5ミリメートルの長さをカットします。シャトルの両側にチューブを合わせます。エポキシを使用してチューブとシャトルを接着します。
- ガイドポストに少量のシリコンオイルを塗布します。マイクロドライブアレイ本体のガイドポストに挿入して、シャトルの品質を確認してください。シャトルが過度の摩擦なしでスムーズに移動することを確認してください。
- オプトロードを準備する(図3Ab)。光遺伝学的実験が必要ない場合、このステップはスキップできます。
- ルビーカッターを使用して光ファイバの長さを21mmに切ります。繊維先端を粉砕して、先端を平らにして光沢のあるようにします。
- 光ファイバをシリコンプローブの前面にそっと置きます。繊維先端は電極の部位の上に200-300 μm置かれる。透明なテープで繊維を一時的に保持します。
- 少量のエポキシを使用して、シリコンプローブのベースに光ファイバを接着します。エポキシが完全に治癒するまで、少なくとも5時間待ちます。
注:電極部と同じ側に光ファイバを取り付けることをお勧めします。裏面に繊維を取り付けることで、光が記録部に正しく照らされなくなる場合があります。
- シャトルをシリコンプローブ(図3Ac)に取り付けます:シリコンプローブのベースの背面に少量のエポキシを塗布します。シャトルの底部をシリコンプローブのベースに取り付け、エポキシの初期硬化時にシャトルとシリコンプローブベースの間の隙間が形成されないように、2~3分間静かに位置を保つ。エポキシが完全に治癒するまで、少なくとも5時間待ちます。
- 顕微鏡下の本体のガイドポストにシャトルチューブを慎重に挿入します(図3B)。この手順の間に、細かいピンセットでシャトルの溝を保持します。
- マイクロドライブネジをネジ穴に差し込みます。シャトルヘッドの溝にL字型ワイヤーの先端を差し込んでシリコンプローブとマイクロドライブスクリューを取り付け(図3C)。
- プローブ電気コネクタホルダーをマイクロドライブアレイ本体に取り付けます(図3D)。
- 2 本の#0ネジを 3.5 mm のねじ長に切ります。バリを取り除くための先端を粉砕します。
- プローブコンテナーホルダーを本体に置きます。シリコンプローブの電気コネクタをホルダーに取り付けます。
- エポキシを使用してホルダー内のシリコンプローブコネクタを固定し、シリコンプローブの回収手順を可能にするためにマイクロドライブアレイ本体に接着しないようにしてください。ネジを挿入して、プローブ・コネクター・ホルダーを保持します。
- フェルールホルダーをオプトシリコンプローブとマイクロドライブアレイ本体(図3D)に取り付けます。
- 2本の#0ネジを6mmのネジ長に切ります。バリを取り除くための先端を粉砕します。
- 2つの#0機械ねじナットの外側を粉砕し、2.5〜3.0 mmの外径の小さな六ックスナットを作り、重量とスペースを減らします。
- ネジをホルダーのコンポーネントAに挿入します。エポキシを使用してネジヘッドを接着します。
- 部品AとBに少量のシリコングリースを塗布し、本体との摩擦を低減します。コンポーネント A を本文に挿入し、逆ピンセットを使用して一時的に保持します。
- コンポーネント B をコンポーネント A のネジに配置します。カスタマイズしたナットをネジに通します。ペンチを使用してナットを締め、ボディのフェルールホルダーを固定します。
- 繊維フェルールホルダー(成分B)の溝に繊維フェルールを挿入します。ファイバーフェルールがホルダーから4~5mm引き出されていることを確認します。
- フェルールとホルダー溝の間に少量のエポキシを塗布します。エポキシが完全に硬化するまで待ち、フェルールが動かないように確認します。マイクロドライブスクリューを回す前にナットを緩めて、シャトルとフェルールホルダーでスムーズな動きを確認してください。
- プローブの動作距離を確認します。シャトルチューブがガイドポストに関連付けられている間、フェルールホルダーが一番上の位置にあるときに、プローブ先端が完全にボディに引き込まれたことを確認します。最大作業距離は、シリコーンプローブと標的脳領域の長さによって決定されます。
- マイクロドライブネジが緩んでいる場合は、ネジの周りに少量の歯科アクリルを塗布し、サポート用のネジを追加します。硬化したら、ネジを回転させて、締め付けと安定性を確認します。
3. テトロードの準備
注: この手順は、以前に公開された記事 8、19、20、39に似ています。
- テトロード用のマイクロドライブネジを準備します。テトロードのマイクロドライブは、カスタム加工されたネジと23 Gチューブ(図2B)で構成されています。この手順はセクション 2.1 に似ています。
- 内部に5.5ミルのワイヤーを持っている30 Gステンレス鋼の管の束を作る。この場合、合計9個の30Gチューブ(8個の記録テトロデと1つの基準電極)を用いた。
- ドライブ本体の底部から30Gバンドルを通し、本体に20Gの薄肉チューブで固定します。ロータリーグラインダーでバンドルの底部をトリミングし、先端を均一にし、フラッシュします。30Gチューブの上部をロータリーグラインダーでトリムし、30Gチューブが本体から約0.5mm突き出るようにします。
- 5.5ミルポリイミド絶縁チューブを30Gチューブにロードします。テトロードワイヤを準備し、32チャンネルの電気インターフェイスボード(EIB)にロードします。最終的な精密切断の前にインピーダンステスターとの電気的な接続を確認してください。
- 金めっき液で250~350 kΩに下がった電極先端インピーダンス。スーパーグルーですべてのテトロデを修正します。
- ポリイミドチューブとテトロードの間に過度の隙間をシールと潤滑用の鉱物油で埋めます。アース線を EIB にルーティングします。
注:必要に応じて、光ファイバはテトロードワイヤ12に沿って統合することができます。
4. シールドコーンの取り付け
- 印刷されたコーンの内側にシルバー導電シールド塗料を塗装します。マイクロドライブアレイを円間の内側に置きます(図3E)。
- 2 本の#0ネジを 3.5 mm のねじ長に切ります。コンネの外側からネジを固定し、マイクロドライブアレイを所定の位置に保持します。
- シールドコーンを電気的に接続するには、ネジヘッドの周りに銀色の塗料を塗布します。アース線とコーン間の電気的接続を確認します。マイクロドライブアレイ本体とシールドコーンの間に少量のエポキシを塗布し、しっかりと本体を取り付けます。
注:シールドコーンを準備するもう1つの方法は、アルミテープ40(図3F)を使用することです。まず、アルミ箔を紙に貼り付けた後、遮蔽コーン用のパターンペーパーを用意する(図3Fa)。次に、用紙を転がし、少量のシアノクリレート接着剤を用いてマイクロドライブ本体に取り付ける(図3Fb)。この円間の重量は0.72gで、マイクロドライブアレイの総重量は4.7gに減少します(表1)。
5. インプラント手術
注:この手順は、デュアルサイト移植のために、以前に公開された記事18、39、41から変更されます。手術後の回復を早くするために、マイクロドライブインプラントの動物の重量が25gを超えるようにしてください。
- 準備
- アースネジを準備するには、シルバーワイヤーをスカルネジに取り付け、銀色の塗料を塗布します。次に、銀の塗料を使用して、ワイヤーの反対側に金のピンを取り付けます。
- マイクロドライブ・アレイをステレオタクティック・デバイスに保持するドライブ・ホールディング・アダプターを準備します。エポキシを使用して、男性のコネタをステンレスハンドルに取り付けます。接続機とステンレスハンドルの位置合わせがまっすぐであることを確認します。
- 記録後に組織学的確認が必要な場合は、シリコンプローブ38のテトロデスまたは裏側にDi-Iを適用する。
- シリコンプローブを下げて、所望の深さにします。ペンチを使用してフェルールホルダーのナットを緩め、シリコンプローブのマイクロドライブスクリューを回してシリコンプローブ(オプトシリコンプローブ)を下げ、ナットを固定してフェルールホルダーを固定します。海馬領域CA1とMECのシリコンプローブにテトロデスを埋め込む場合、テトロードカニューレとシリコンプローブの先端との間の距離は3〜4mmです。
- 麻酔マウス(0.8%~1.5%イソフラン)を立体装置にセットします。マウスの麻酔状態は、つま先ピンチ反射の不在によって確認される。乾燥を防ぐために目に透明なointmentを適用します。強い外科的光暴露から保護するために箔の部分で目をカバーします。
- 毛皮を剃った後、ヨウ素とイソプロパノールでマウスの頭皮を消毒します。標準的な外科はさみを使用して頭皮に1.5〜2.0 cmの切開を行い、皮下にリドカインを塗布した後、綿棒を使用して頭蓋骨の上の組織を取り除きます。
- マウスヘッドをステレオタキスティックツールに合わせます。ブレグマとラムダの高さの差が 100 μm 未満であることを確認します。アトラスを使用して開頭術の場所を決定し、殺菌された鉛筆でこれらの場所をマークします。
- 頭蓋骨のネジ(直径0.8mm、糸音0.200mm)を1.5回転(0.3mm)回転させて、0.5mmドリルビットを使用して頭蓋骨に8~11個の穴を開けた後、外科用ピンセットとドライバーを使用してアンカーします。
注:前頭頭蓋骨の2~4穴、頭頂頭蓋の両側に2~3個の穴、頭蓋間頭蓋骨の1~2個の穴が推奨されます。 - 頭間骨に穴を開けた後、1ターン(0.2mm)回転させてアースネジを穴に取り付けます。この穴が骨を通って脳の場合に浸透しないことを確認します。それ以外の場合は、小脳信号が記録を汚染します。インピーダンスメーターを使用して、アースネジとスカルスクリューの間の1kHzでインピーダンスが20 kΩ未満であることを確認します。
注: インピーダンスが大きいほど、録音中にモーションアーティファクトが導入されます。 - マークされた場所で開頭術を実行します。硬膜はマウスにそのまま残すことができます。
- アースネジのオスピンとマイクロドライブアレイのアースコネクタを接続します。アースネジとシールドの間を測定して、インピーダンスメーターを使用して接続性を確認します。
- マイクロドライブアレイをアダプターにセットし、ステレオタックスデバイスにセットし、シリコンプローブを目的の深さまでゆっくりと下げてください。シリコンプローブを脳に挿入する際に、テトロードバンドルが脳表面の上に置かれ、マイクロドライブアレイの内側に置かれていることを確認します(図4A)。
- シリコンプローブとテトロードバンドルの面積を密封するためにシリコングリースを慎重に塗布します(図4B)。20G針の先端に少量のシリコングリースを入れ、針を使用してプローブの周りにグリースを適用します。シリコングリースがプローブの周囲を完全に覆い、歯科用アクリルが電極/プローブの上または下に流れないように、この手順を繰り返します。グリースが電極部位に触れないように注意してください、そうでなければ、それは劇的に記録部位のインピーダンスを増加させるでしょう。
- 歯科用アクリルを適用して、マイクロドライブアレイを頭蓋骨の固定ネジに固定します。
注:アクリルの硬化中に発生する過度の熱を避けるために、3層に歯科アクリルを適用することをお勧めします。 - マイクロドライブ・アレイからアダプターを慎重に取り外します。脱水を防ぐために、1 mLのPBSを皮下に注入する。鎮痛治療として皮下に5mg/kgメロキシカムを注入する。
- シリコンプローブコネクタをテープで覆い、電気的な接続の中に汚れが入らないようにします。マイクロドライブアレイをプラスチックパラフィンフィルムで覆い、所定の位置にテープで留めています。
- 3日間の適切な鎮痛治療を投与する(例えば、1日1回2mg/kgメロキシカムの皮下注射)。テトロード調整を開始する前に、回復に 3 ~ 5 日を許可します。回復期間後に埋め込まれたマウスを図4Cに示す。
6. シリコンプローブの回収(図4D)
- ケタミン(75mg/kg)とデキスメデトミジン(1mg/kg)麻酔薬を腹腔内に注入し、つま先ピンチ反射がないことを確認した。フードを使用して心臓を通して4%パラホルムアルデヒドを直接浸透させ、麻酔マウスを修正します。げっ歯類の外科的方法は、前述の42である。
- ペンチを使用してフェルールホルダーのナットを緩めます。次に、調整ネジを回して慎重に本体の上部に移動し、シリコンプローブをマイクロドライブアレイ本体の内部に向かって完全に引き込みます。ナットを固定して、プローブを一番上の位置に保持します。
- 横から頭蓋骨を割って、下からマウスの脳を取り出します。マイクロドライブアレイは動物から分離されました。
- シリコンプローブを駆動するL字型マイクロドライブスクリューを完全に取り外します。ペンチを使用してフェルールホルダーのナットを緩めて取り出します。フェルールホルダーの部品Aを取り出します。
- プローブコネクタのマウントを外し、ドライブ本体から取り外します。プローブコネクタマウントがマイクロドライブアレイ本体から外れていることを確認します。
- シャトルの上部をピンセットで保持し、マイクロドライブアレイからシリコンプローブアセンブリを慎重にスライドさせます。
- 少なくとも1日、コンタクトレンズクリーナー(まず酵素で、次に3%過酸化水素)でプローブチップを清掃します。顕微鏡下のイソプロパノールパッドを使用して、電極先端を慎重に拭きます。プローブは、静的なストレージ ボックスに保管します。
注:シャトルおよびプローブコネクターの台紙はシリコンプローブに取り付けられたままで、次の注入で再利用できます。
注:一部のシリコンプローブは過酸化水素では許容できません。この場合、プロテオ溶解酵素のみを含むコンタクトレンズ溶液を用いる。 - マイクロドライブアレイ本体を次の手術に再利用するには、細かい先端ドリルとニッパーを組み合わせて歯科用アクリルを取り外します。次いで、取り出した歯科用アクリルをアセトンに浸漬して頭蓋骨ネジを回収する。アセトンはマイクロドライブアレイのプラスチック部品を溶解します。
- メスを使用してマイクロドライブ本体とシールドコーンの間のエポキシを取り除きます。
注:マイクロドライブが壊れていない場合は、次の手術のために追加の部品を再び印刷する必要はありません。
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Representative Results
マイクロドライブアレイは5日以内に構築された。マイクロドライブ調製のタイムラインを表2に示す。このマイクロドライブを用いて、9個のテトロデスと1つのシリコンプローブをマウスの海馬CA1およびMECに移植した[21週齢/29g体重オスpOxr1-Cre(C57BL/6背景)]。このトランスジェニックマウスは、MEC層IIIピラミッド型ニューロン中のCreを発現する。マウスをAAV5-DIO-ChR2-YFPの200 nL(力価:7.7 x 1012 gc/mL)を電極インプラントの10週間前にMECに注入した。LFPはローパスフィルタ(1~500Hz)を使用して記録され、ハイパスフィルタ(0.8~5kHz)を使用してスパイクユニットを検出しました。光刺激(λ=450nm)は、ファイバコネクタの端部で測定された10.6mW強度で1ミリ秒のパルス幅を用いて行った。テトロード記録用の基準電極を専用テトロード線を用いて白質に配置した。シリコンプローブ記録の基準は、プローブのトップチャンネルとして設定した。
テトロード調整後、リニアトラック(図5A)とオープンフィールド(図5B)で動作性能をテストした。いずれの実験でも、マウスは約30分間自由に探索した(図5Aa,b,c;図 5Ba,b,c)。電気生理学的信号は、記録セッション全体を通して重度のモーション関連ノイズなしで正常に記録されました(図5Ad,e;図 5Bd,e)次に、CA143に突出するMEC層IIIニューロンを刺激するためにMECで光刺激を行った(図6A)。自発的なスパイク活動(図6B,C)およびLFP(図6D)は、マウスが眠っているときにテトロデスおよびシリコンプローブから記録した。テトロデスに記録されたLFPは大きな波紋活性を示し、すべてのテトロデスがCA1ピラミッド状細胞層の近傍に位置していることを示唆した。光誘発応答性活性はMECで最初に観察され、次いでCA1で13〜18ミリ秒の待ち時間が認められた(図6E)。
図1:マイクロドライブ・アレイの概要。(A)マイクロドライブアレイの骨格図を、テトロード側(a)およびシリコンプローブ側(b)から。(B)ロードされたマイクロドライブアレイの実際の画像は、テトロード側(a)およびシリコンプローブ側(b)から見た。マイクロドライブアレイは、パネル(b)の治具ステージに配置されます。(C)個別の3Dプリントマイクロドライブアレイパーツ。(a-d)4つの異なる角度から見たマイクロドライブアレイ本体(a:テトロード側面図、b:シリコンプローブサイドビュー、c:トップビュー、d:ボトムビュー)。パネル (c) の破線の拡大図を図 2Aに示します。(e) シリコンプローブを保持し、調整を可能にするシャトル。シリコンプローブは、パネル(e)の破線に取り付けられています。(f) 32チャンネルのシリコンプローブコネクタを保持するプローブコネクタホルダー。(g)光ファイバフェルールホルダーは、光源でファイバコネクタを差し込む/抜くときにプローブの動きを防ぐために光ファイバフェルールを保持します。この部品は[パネル(g)とコンポーネントAとB]の2つのコンポーネントで構成されています。(h) 導電性材料で塗装する際に物理的および電気的なシールドを提供する印刷されたシールドコーン。コーンウィンドウは、マイクロドライブアレイの準備中に構造の内部を見る機能を可能にし、最終的にはテープまたは3Dプリント材料で覆われます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:本体のガイドポストとマイクロドライブネジの準備。(A)準備後のガイド。(a)図1Ccに示すマイクロドライブアレイ本体の拡大図。(b) 体の穴に挿入後をガイドします。(B)マイクロドライブスクリュー設計。(a) 300 μm ピッチのカスタムネジ、支持チューブ、および L 字型チューブで構成されるシリコンプローブ用マイクロドライブスクリュー。(b) 160 μm ピッチのカスタムネジと 30 G のステンレスガイドチューブで構成されるテトロード用マイクロドライブスクリュー。(C)マイクロドライブねじの上部部分の製造:(a)マイクロドライブねじ用の反金型の3Dプリントパターンの調製。写真は、シリコンプローブマイクロドライブスクリューのパターンを示しています。(b)アンチモールドパターン(a)及びシリコンゴム材料を用いて作られた金型。組み立てられたマイクロドライブねじは、カスタムネジとワイヤー/チューブを挿入し、各井戸に歯科用アクリルを注ぐことによって製造されます。インセット:金型の井戸の拡大図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロドライブアレイアセンブリ。(A)オプトシリコンプローブの調製。(a) シャトルにプラスチック製ガイドチューブを2本取り付けます。(b) 光ファイバをシリコンプローブに接着する。(c) シャトルをオプトシリコンプローブに取り付ける。この写真では、シャトルの底部(破線)がシリコンプローブのベース[(b))の裏側]に取り付けられています。シャトルとシリコンプローブシャンクは平行にする必要があります。(B)マイクロドライブアレイ本体のガイドポストにオプトシリコンプローブシャトルアセンブリをロードします。(C)プローブが完全に本体に引き込まれる場合(a)、および駆動体内の最下部(b)に位置付けされた場合のシリコンプローブマイクロドライブの相対位置。L字型ワイヤーはシャトルの溝に挿入される。(D)ファイバ フェルール ホルダーとプローブ コネクタ マウントの分解図。(E)シールドコーンが付属。導電性材料は、コーンの内側に塗装されています。(F)紙とアルミテープを使用した代替シールドコーン。(a) パターンペーパー。(b) 3Dプリント版に比べて1.1gの重量を削減する、付属の代替シールドコーン。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:シリコンプローブの手術および回収中にプローブをシールする。(A)マイクロドライブアレイと頭蓋骨の頭蓋骨は、シリコングリースを塗布する前に行う。このとき、シリコンプローブを約2mm脳に挿入します。(B)シリコンプローブとテトロードバンドルの周りにシリコングリースを塗布し、歯科用アクリルからプローブを保護します。(C)回復期間後に慢性的に移植されたマウスは、マウスが歩いているとき(a)、グルーミング(b)、およびカウンターバランシングプーリシステム(c)で記録ケーブルに接続したとき。(D)回収されたシリコンプローブは、(a)前後(b)洗浄液に浸漬する。(a)中の生体組織は、洗浄プロセス(b)後に除去される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:海馬CA1における同時四分性/シリコンプローブ記録の例と、行動マウスからの中間内皮質(MEC)。(A)線形トラック上の録音。(a) 再コーディングに使用される線形トラック。(b) 軌道上で約30分間のマウス探査の軌道。(c) 線形トラックの動作性能(d-e)テトロード(d)およびシリコンプローブ(e)からの代表的なLFP記録。(B)開いているフィールドでの録画。(a) 再コーディングに使用されるオープンフィールドチャンバ。(b) 室内で約30分間のマウス探査の軌道。(c) オープンフィールドでの行動パフォーマンス(d,e)テトロード(d)およびシリコンプローブ(e)からの代表的なLFP記録。LEDは、マウスの位置を記録するためにヘッドアンプに取り付けられています。線形トラックおよび開いた部屋は静電気騒音を減らすために電気地面と接続される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:CA1とMECにおける同時記録と光遺伝学的刺激の代表的な結果。(A)注射4週間後のAAV5-DIO-ChR2-YFPの発現。後部MECから後部CA1に軸を投影するMEC層IIIピラミッド型ニューロン。破線:オリ、地層オリエンス。プライ, 層ピラミッド;ラッド、層放射。モル、層ラクノサム分子。(B)テトロデスの1つからの代表的なスパイク記録。(a) テトロードから記録されたスパイクの2Dクラスター投影。(b)(a)の破線で示される3つのクラスターの平均スパイク波形の例。(C)シリコンプローブ電極部の1つからの代表スパイク記録。(a) スパイク主成分の2Dクラスタ投影。(b) 3つのクラスターの平均スパイク波形の例。スパイク クラスタ(ピンクと緑)はノイズ クラスタ (青) から分離されます。(B,C) のクラスターは、KlustaKwik ソフトウェアを使用して計算されます。(D)CA1(a)のテトロデスとMEC(b)のシリコンプローブから同時に記録された自発的LFPの痕跡。黒い矢印は、(C)に示す(B)およびシリコンプローブ電極部に示す四球を示す。(E)CA1(a)のテトロデスとMEC(b)のシリコンプローブからのパルス光学刺激(10.6mW、1ミリ秒、充填赤い矢印)に対するLFP応答。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| グラム/1 | 数 | 合計 [グラム] | ||
| 本体 | 1.25 | 1 | 1.25 | |
| シャトル | 0.04 | 1 | 0.04 | |
| プローブ・コネクター・マウント | 0.19 | 1 | 0.19 | |
| ファイバーフェルールホルダー | 0.1 | 1 | 0.1 | |
| シールドコーン | 1.82 | 1 | 1.82 | (0.72)* |
| 導電性ペースト | 0.2 | 1 | 0.2 | |
| 機械ねじ(#00、2mm)、EIBを保持する | 0.05 | 2 | 0.1 | |
| 機械ねじ(#0-80、3.5 mm) | 0.06 | 4 | 0.24 | |
| 機械ねじ(#0-80、6mm) | 0.09 | 2 | 0.18 | |
| ナット | 0.03 | 2 | 0.06 | |
| マイクロドライブ(テトロード) | 0.05 | 9 | 0.45 | |
| マイクロドライブ(シリコンプローブ) | 0.29 | 1 | 0.29 | |
| シリコンプローブ | 0.28 | 1 | 0.28 | |
| 電気インターフェイスボード | 0.6 | 1 | 0.6 | |
| 合計 | 5.8 | (4.7)* | ||
表1:各マイクロドライブアレイ部の個々の重量。マイクロドライブアレイの総重量は、保護コーンをエポキシで固定した後5.9gであった(*紙とアルミテープを使用して代替シールドコーンを使用する場合)。
| 手順 | 時間 |
| マイクロドライブの準備 | |
| 3D部品印刷 | 1 日 |
| オプトロード準備 | |
| マイクロドライブヘッド用の金型を準備する | 1日* |
| マイクロドライブヘッドの準備 | 3 時間 |
| 光ファイバの取り付け | 3 時間 |
| シャトルの取り付け | 3 時間 |
| テトロード準備 | |
| マイクロドライブヘッド用の金型を準備する | 1日* |
| マイクロドライブヘッドの準備 | 3 時間 |
| テトロードワイヤのロード | 1 日 |
| シールドコーンの取り付け | |
| 塗装シールド塗料 | 一晩* |
| マイクロドライブ本体への取り付け | 3 時間 |
| *これらの手順は並列に行うことができます | |
表2:マイクロドライブ調製のタイムライン。3D部品印刷は、シリコーンゴム/歯科アクリル/エポキシの硬化を待ち、テトロードワイヤーをロードすると、マイクロドライブアレイの準備の時間の大半を、合計4〜5日かかります。
補足ファイル:補足ファイルには、.sldprt と .stl 形式の両方の 5 つのマイクロドライブ パーツの 3D モデル データが含まれています。元の3Dモデルファイルは、ソフトウェアSolidworks2003で作成されました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、独立した調節可能な四位体と自由に振る舞うマウスのシリコンプローブを使用して、2つの脳領域からの神経活動の記録を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイを構築し、移植する方法を示す。また、光遺伝学的実験と実験後のシリコンプローブの回収を示す。調整可能なシリコンプローブ33またはオプトシリコンプローブ36の移植は、マウスで以前に実証されていますが、このプロトコルは、同時テトローデアレイとオプトシリコンプローブ移植において明確な利点を有し、柔軟に対応します。埋め込まれた調査のタイプの選択。埋め込まれたプローブの種類は、マルチシャンクプローブ27、44または超密度ニューロピクセル21、45などの実験の目的に応じて切り替えることができる。注入7の調整および角度は必要に応じて3Dオブジェクト設計段階で容易に変更することができる。例えば、海馬46、内皮質47、前頭前皮質48、扁桃体49などの記憶関連の脳構造全体の学習タスク中に、デュアルサイトまたはトリプルサイト記録が可能です。そして皮質50をcingulate.
インプラントおよび記録を成功させるための重要な手順がいくつかある。シリコンベースのプローブの脆弱性により、組み立て時にマイクロドライブアレイに対する機械的振動や衝撃を最小限に抑える必要があります。たとえば、ドリルを使用して詰まった穴を開けるには、シリコンプローブをマイクロドライブアレイにロードする前に終了する必要があります。また、マイクロドライブアレイの構築やインプラント手術の際に各工程で接地接続を慎重にチェックし、記録されたデータの安定性を確保することを強調する必要があります。地面への不安定または高インピーダンス接続は、録音セッション中に重いノイズとモーション関連のアーティファクトを引き起こします。安定した記録のために、脳組織はインプラント手術によって悪影響を受けるので、電極のドリフトを避けるために手術後1〜2週間待つすることをお勧めします。しかし、シリコンプローブの信号品質は、以前の経験に基づいて外科的外傷から1〜2週間後に回復します。他のマウスによる埋め込みマイクロドライブアレイの損傷を防ぐために、シングルハウジングを使用することをお勧めします。光遺伝学的実験では、ほとんどのシリコンプローブが光刺激51に応答して光アーティファクトを誘導し、他のプローブは光アーティファクトを最小限に抑えるように設計されている(写真アーティファクトが減少している)ことに注意することが重要です。市販されているシリコンプローブ)。
マイクロドライブアレイ(5.9g)の重量は、前の記事12、53で説明した典型的なマイクロドライブよりも重く、主にマイクロドライブアレイ本体(総重量の約21%)、シールドコーン(約31%)、および金属部品(ネジ)ナッツ:~22%)。適切な体重を持つマウスは早期に回復する傾向があるため、インプラント手術には25g(C57BL/6マウス54,55)以上の重さのマウスを使用することをお勧めします。このため、このマイクロドライブアレイは、若年マウスにとって最良の解決策ではないかもしれません。マウスの体重の5%~10%であるデバイスは、インプラント12、56(この57のサポート公開されたデータはありませんが)のために許容されるガイドが多いが、このマイクロドライブアレイの体重の約24%の重量を量る25gマウス(以下に説明する代替円根を用いた場合〜19%)。
しかし、移植された成体マウスは、自由に動き回り、ホームケージの中を飛び回ることができました。同様のマイクロドライブアレイ重量(〜4.5g)を移植したマウスは、食品制限13、17の下でも行動タスク(線形迷路タスク)を行うことが以前に示されている。重量の欠点は、記録中に問題ではなく、カウンターウェイトバランスシステム18、34、58またはヘッドポストシステム59がマイクロドライブアレイをサポートするように。さらに、マイクロドライブアレイの総重量は、高さを下げたり、シールドコーンの厚さを小さくしたり、より小さなネジを使用するように設計を変更することで低減できます。
現在の3D印刷材料を使用して、シールドコーンの厚さを最大0.3mm(現在の厚さ〜0.6mmから)まで減らすことができます。テトロードワイヤーがまだ覆われている限り、円板の高さは~5mm減らすことができます。テトロードワイヤの露出は、ワイヤの破損や長期記録の故障になります。あるいは、紙とアルミニウムテープを使用してシールドコーンを調製すると、円間重量を約0.7g(総重量の約15%、元のマイクロドライブアレイの総重量から20%削減)に減らすことができます。しかし、これらは体力とのトレードオフです。さらに、マイクロドライブ(現在のシールドコーン:4.2 x 4.0 x 2.6 cm=長軸xマイナー軸x高さ)のサイズは、動物ケージの上部から提供される場合、食料や水のアクセスを妨げる可能性があります。ケージの床または側壁から提供されている限り、マイクロドライブは、食事、飲酒、グルーミング、飼育、またはネスト60などのマウスの自然な行動を妨げません。
結論として、このマイクロドライブプロトコルは、研究者に、長距離神経回路のダイナミクスと機能を理解するために、自由に動くマウスの複数の脳領域から記録するための柔軟な選択肢を提供します。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会海外研究フェローシップ協会(HO)、奨学金プログラム(TK)、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラム(TK)、脳研究財団(TK)、教員科学技術取得、および一部の支援を受けています。リテンションプログラム(TK)、脳行動研究財団(TK)、住友財団研究助成金(JY)、NARSAD若手研究者研究助成金(JY)。私たちは、原稿の準備中に貴重なコメントや提案のためにW.マークスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #00-90 screw | J.I. Morris | #00-90-1/8 | EIB screws |
| #0-80 nut | Small Parts | B00DGB7CT2 | brass nut for holding fiber ferrule holder |
| #0-80 screw | Small Parts | B000FMZ57G | brass machine screw for probe connector mount, fiber ferrule holder, and shielding cone |
| 22 Ga polyetheretherketone tubes | Small Parts | SLPT-22-24 | for attaching to the shuttle, 0.025 inches inner diameter |
| 23 Ga stainless tubing | Small Parts | HTX-23R | for tetrode |
| 23 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-23R-24-10 | for L-shape/support wire |
| 26 Ga stainless wire | Small Parts | GWX-0200 | for guide-posts |
| 30 Ga stainless wire | Small Parts | HTX-30R | for tetrode |
| 3-D CAD software package | Dassault Systèmes | SolidWorks 2003 | |
| 3D printer | FormLab | Form2 | |
| 5.5mil polyimide insulating tubes | HPC Medical | 72113900001-012 | |
| aluminum foil tape | Tyco | Tyco Adhesives 617022 Aluminum Foil Tape | for the alternative shielding cone |
| conductive paste | YSHIELD | HSF54 | for shielding cone |
| customized screws for silicon-probe microdrive | AMT | UNM1.25-HalfMoon | half-moon stainless screw, 1.5 mm diameter, 300 µm thread pitch |
| customized screws for tetrode microdrive | AMT | Yamamoto_0000-160_9mm | slotted stainless screw, 0.5 mm diameter, 160 µm thread pitch, custom-made to order for our design |
| dental acrylic | Stoelting | 51459 | |
| dental model resin | FormLab | RS-F2-DMBE-02 | |
| Dremel rotary tool | Dremel | model 800 | a grinder |
| drill bit | Fine Science Tool | 19007-05 | |
| electric interface board | Neuralynx | EIB-36-Narrow | |
| epoxy | Devcon | GLU-735.90 | 5 minutes epoxy |
| eye ointment | Dechra | Puralube Ophthalmic Ointment | to prevent mice eyes from drying during surgery |
| fiber polishing sheet | Thorlabs | LFG5P | for polishing the optical fiber |
| fine tweezers | Protech International | 15-368 | for loading/recovering the silicon probe |
| gold pins | Neuralynx | EIB Pins Small | |
| ground wire | A-M Systems | 781500 | 0.010 inch bare silver wire |
| headstage preamp | Neuralynx | HS-36 | |
| impedance meter | BAK electronics | Model IMP-2 | 1 kHz testing frequency |
| mineral oil | ZONA | 36-105 | for lubricating screws and wires |
| optical fiber | Doric | MFC_200/260-0.22_50mm_ZF1.25(G)_FLT | |
| Recording system | Neuralynx | Digital Lynx 4SX | |
| ruby fiber scribe | Thorlabs | S90R | for cleaving the optical fiber |
| silicon grease | Fine Science Tool | 29051-45 | |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-Edge-5mm-20-177 | Fig. 3, 4A, 4B, 5 |
| silicon probe | Neuronexus | A1x32-6mm-50-177 | Fig. 4C |
| silicon probe washing solution | Alcon | AL10078844 | contact lens cleaner |
| silicone lubber | Smooth-On | Dragon Skin 10 FAST | for preparation of microdrive mold |
| silver paint | GC electronic | 22-023 | silver print II coating, used for ground wires |
| skull screw | Otto Frei | 2647-10AC | 0.8 mm diameter, 0.200 mm thread pitch |
| standard surgical scissors | ROBOZ | RS-5880 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf | Model 942 | |
| super glue | Loctite | LOC230992 | for applying to guide-posts |
| surgical tweezers | ROBOZ | RS-5135 | |
| Tetrode Twister | Jun Yamamoto | TT-01 | |
| tetrode wires | Sandvik | PX000004 |
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