Summary
ここでは、大動脈収縮の確立されたマウスモデルにおける外科的大動脈デベンディングのステップバイステッププロトコルについて説明する。この手順は、左心室逆リモデリングと肥大の回帰の基礎となるメカニズムを研究するだけでなく、心筋回復を加速させる可能性のある新しい治療オプションをテストすることができます。
Abstract
左心室(LV)逆リモデリング(RR)をよりよく理解するために、大動脈バンディング誘発LVリモデリングの後、マウスが大動脈収縮の除去時にRRを受けるというげっ歯類モデルについて説明する。本論文では、マウスにおいて低侵襲の外科的大動脈デバディングを行うためのステップバイステップの手順について述べた。心エコー検査は、その後、LVリモデリングおよびRR中の心臓肥大および機能不全の程度を評価し、大動脈断層切り替えのための最良のタイミングを決定するために使用された。プロトコルの最後に、心機能の終末血力学的評価を行い、組織学的研究のためにサンプルを採取した。我々は、デベンディングが70〜80%の外科的生存率に関連していることを示した。さらに、退出後2週間後に、心室後負荷の有意な減少が心室肥大の退縮を引き起こす(〜20%)そして線維症(〜26%)、左心室充填および末方拡張期圧(E/e'およびLVEDP)の正常化によって評価される拡張期機能不全の回復。大動脈デベンディングは、げっ歯類のLV RRを研究するのに有用な実験モデルです。心筋回復の程度は被験者間で可変であり、したがって、大動脈弁置換のような臨床的文脈で生じるRRの多様性を模倣する。我々は、大動脈バンディング/デバンディングモデルは、RRのメカニズム、すなわち心臓肥大の退行および拡張機能不全の回復に関する新たな洞察を解明するための貴重なツールを表していると結論付ける。
Introduction
マウスにおける横方向または上昇大大体の収縮は、圧力過負荷誘発心肥大、拡張期および収縮期機能不全および心不全1、2、3、4に対する広く使用される実験モデルである。大動脈収縮は、初期状態で補った左心室(LV)の同心性肥大を招き、壁応力1を正常化する。しかしながら、長期の心臓過負荷などの特定の状況下では、この肥大は壁ストレスを減少させるのに不十分であり、拡張期および収縮期機能不全(病理学的肥大)5を引き起こす。並行して、細胞外マトリックス(ECM)の変化は、線維症として知られているプロセスでコラーゲン沈着および架橋をもたらし、これは置換線維症および反応性線維症に細分することができる。線維症は、ほとんどの場合、不可逆的であり、過負荷リリーフ6、7後の心筋回復を妥協する。しかしながら、最近の心臓磁気共鳴画像法の研究では、反応性線維症が長期8で退行することが明らかになった。全体として、線維症、肥大および心臓機能不全は、心不全(HF)に向かって急速に進行する心筋リモデリングとして知られているプロセスの一部である。
心筋リモデリングの特徴を理解することは、その進行を制限または逆転させる主要な目的となっており、後者はリバースリモデリング(RR)と呼ばれます。用語RRは、所定の介入によって慢性的に逆転した任意の心筋変化、そのような薬理学的療法(例えば、高血圧薬)、弁手術(例えば、大動脈狭窄症)または心室補助装置(例えば、慢性HF)を含む。しかし、RRは、多くの場合、優勢な肥大または収縮期/拡張期機能不全のために不完全である。したがって、RRの基礎となるメカニズムおよび新しい治療戦略の明確化はまだ欠落しており、これは主にこれらの患者のほとんどにおいてRR中のヒト心筋組織へのアクセスと研究が不可能であることによるものである。
この制限を克服するために、げっ歯類モデルはHF進行に関与するシグナル伝達経路の理解を進める上で重要な役割を果たしてきました。具体的には、大動脈狭窄を有するマウスの大動脈デバンディングは、これら2つの段階で異なる時点での心筋サンプルの収集を可能にする、逆筋LVリモデリング9およびRR10,11の下にある分子メカニズムを研究するのに有用なモデルを表す。さらに、RRを促進/加速できる潜在的な新規ターゲットをテストするための優れた実験的設定を提供します。例えば、大動脈狭窄の文脈では、このモデルは、RR6、12の(in)完全性の根底にある膨大な多様性の心筋応答に関与する分子メカニズムに関する情報を提供するかもしれないし、弁置換のための最適なタイミングは、現在の知識の大きな欠点を表す。実際、この介入の最適なタイミングは、主に大動脈勾配の大きさに基づいて定義されているため、議論の対象です。いくつかの研究は、線維症と拡張期機能不全が既に存在することが多いので、この時点は心筋回復には遅すぎるかもしれないと提唱しています。
私たちの知る限りでは、これは、弁置換前後または抗高血圧薬の発症前後の大動脈狭窄または高血圧などの条件で起こっている心筋リモデリングとRRの両方のプロセスを再現する唯一の動物モデルです。
上記の課題に取り組むために、マウスとラットの両方で実施できる外科用動物モデルについて説明し、これら2つの種の違いに対処する。これらの手術を行う際の主な手順と詳細について説明します。最後に、RRの直前とRR全体でLVで起こっている最も重要な変更を報告します。
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Protocol
すべての動物実験は、実験動物のケアと使用のためのガイド(NIH出版第85-23号、改訂2011)および動物福祉に関するポルトガルの法律(DL 129/92、DL 197/96;P 1131/97)。管轄の地方自治体は、この実験プロトコル(018833)を承認しました。7週齢の雄C57B1/J6マウスは、定期的な12/12時間の明暗サイクル環境、22°Cの温度と60%の湿度で水にアクセスし、標準的な食事のアドリビタムで、適切なケージに維持されました。
1. 手術場の準備
- 70%アルコールで操作部位を消毒し、手術領域の上に使い捨て手術室のテーブルカバーを置きます。
- 手術前にすべての器具を殺菌してください。
注:この手順は、マイクロ外科用ハサミ、2細かい湾曲した鉗子、3つの細かいストレート鉗子、メス、小さな鉗子、斜めのディスセクターはさみ、針ホルダー、超微細結紮助剤、2の止結剤、そして最後に磁気固定子の引き込みシステムを強く推奨する(図1A)。 - 大間への容易なアプローチのために90°に26 G鈍い針の先端をカーブ。26G針は直径0.45mmの大動脈狭幅を作成する(図1B)。
- 暖房パッドの温度を37±0.1 °Cに調整してください。
2. マウスの調製と挿管
- 若いC57B1/J6マウス(20-25g)を、コーンチューブ内で0.5~1.0 L/min 100%O2で8%セボフルランを吸入して麻酔をします。
- つま先ピンチ離脱反射を使用して麻酔の深さを確認してください。
- 傾斜プレートの下底の不用さにマウスを置き、耳内挿管に進みます。
- マウスを加熱パッドに移動し、耳通りの管を人工呼吸器に素早く接続して、機械換気を開始します。
- 換気装置のパラメータを160呼吸/分の周波数と10 mL/kgの潮流量に調整します。
3. 手術の準備(バンディング手術とデバンディング手術の両方)
- マウスの中胸レベルにネックラインから脱毛クリームを剃り、塗布します。
- 角膜から乾燥を防ぐために、動物の目に眼科ゲルを適用します。
- 直腸プローブとオキシメーターを足または尾に置き、それぞれ温度と血液酸素化、心拍数を監視します。
注:麻酔は、重要な低体温を誘発し、従って、心拍数の急激な低下を避けるために、手術中に正常な体温を維持することが重要である。 - セボフルラン(2.0〜3.0%)で麻酔を維持する。つま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の正しいレベルを確認してください。
- マウスを右横の褥瘡に入れ、手術中に動物を正しい位置に保つためにテープで磁気固定子引き込みシステムに手足を固定する(図2、図3A)。
- 70%のアルコールでマウスの胸を消毒し、続いてプロビドネ-ヨウ素溶液を消毒します。
4. 昇順大動脈バンディング手術
メモ: プロトコルの詳細については、2、3、4、13を参照してください。
- 使い捨てブレードを使用して、腋窩レベルのすぐ下の左側に小さな(約0.5cm)の皮膚切開を行い、皮膚を解剖します。
- 肋骨が見えるまで、胸筋と他の筋肉層を穏やかに解剖し、分離する。細かい鉗子を使用し、筋肉を切断しないでください。
- 顕微鏡下で、肋間空間を特定し、微細な鉗子で第2と 第3の 肋間空間の間に小さな切開を開きます。
- 胸部リトラクタを配置してリブを引き込む(図2A)。
- 小さな鉗子を使用して、大オルタの上昇が見えるまで、胸腺葉を穏やかに解剖し、分離します。
注意:コットンアプリケーターは、出血の場合に便利でなければなりません。温かい生殖不能食節は、著しい出血の場合に皮下に与えられるべきです(例えば、乳腺動脈)。 - 小さな鉗子を使って大オルタを優しく解剖する。
注:大オルタは、周囲に脂肪やその他の癒着がなく、小さなカーブ鉗子で血管を簡単に囲む可能性がある場合に解剖されると考えられます。 - 大動脈解離後、結紮助剤と湾曲した鉗子を用いて大動脈の周囲に7-0ポリプロピレン合字を配置する(図2B)。
- 鈍い26G針を大間(先端はマウスの頭部に向けて向いている)に平行に配置する(図2B)。20-25 gの体重のマウスの場合、この針は再現性の65-70%大動脈収縮を誘発する。
- 大間と26G針の周りに2つの鉗子の助けを借りて2つの緩い結び目を作る(図2B)。
- 1stノットを締め、その後すぐに2番目のノットを締めます。収縮の正しい位置を簡単に確認し、速やかに大動脈血流を回復するために針を取り除く。最後に、3番目の結び目(BAグループ)を作ります。
- 胸腺と筋肉を初期位置に再配置します。
- 狭窄手順と同じシャム手順を実行しますが、大間(SHAM基)の周りに縫合糸を緩く保ちます。
- 縫合糸の端を切り、胸のレトラクタを取り外します。
注: 短い縫合端の端部は大動脈圧で結び目が緩む確率を高める一方、長い端は縫合糸と左心房の間に付着が起こり得るので、デバディング手順を危険にする。 - 可能な限り最も少ない数のステッチを使用して、単純な中断または連続縫合糸で6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して胸壁を閉じます。2sが肺を再膨張させるために人工呼吸器の流出をつまんで、最後の胸の結び目を最後のインスピレーションで膨らませて締めます。
- 連続縫合パターンで6-0シルク/ポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。
注:より新しい人工呼吸器を使用する場合は、インスピレーションで一時停止するようにプログラムすることができます(セットアップ-高度な一時停止-インスピレーション)
5. 術後ケア
- 皮膚縫合部位にプロビドネ-ヨウ素溶液を塗布する。
- 適切な鎮痛のために、ブプレノルフィンを皮下0.1mg/kg、1日2回、動物が完全に回復するまで投与する(通常、手術後2〜3日)。
- 手術中に著しい出血が起きた場合の脱水を防ぐために、腹腔内に無菌生理的な生理を注入する。
- 麻酔をオフにし(マウスを脱挿せずに)、動物が反射神経を回復するまで待ち(ウィスカーの動きは覚醒信号です)、自発的に呼吸を始めます。
- 気管カニューレを取り外します。
- 37°Cでインキュベーターで動物を回復させてください。
- 完全な回復後、12時間の明暗サイクルルームに動物を戻します。
6. 大動脈の骨抜き手術
- 7週間後、BA動物の半分で大石のデバンディングを行い、SHAMマウスの半分から緩い縫合糸を取り除き、それぞれ2つの新しいグループ(DEBING(DEB)とデバンディングSHAMA(DESHAM)を生み出します。デシャムは DEB グループの制御を表します (図 4)。
- 上記の手順 2.1 ~ 3.6 を繰り返します。
- 組織、接着、および大器官の周りの線維化を、その狭窄が見えるまで穏やかに解剖する。
- 慎重に大オルタを解剖し、大間から縫合糸を分離します。縫合糸を斜みのあるワンプローブスプリングハサミで切ります(図3B)。
- 可能なステッチの最小数を使用して、単純な中断または連続縫合糸で6-0ポリプロピレン縫合糸を使用して胸壁を閉じます。
注:気胸を避けるために肺が膨張したときに最後の胸の縫合糸を締めてみてください。 - 連続縫合パターンで6-0シルク/ポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。
- 5で述べたように、すべての術後のケア手順を実行します。
- 2週間後に動物を犠牲にしてください。
7. 心エコー検査は、生体内の心機能および左心室肥大を評価する
- 2~3週間ごとに心エコー検査を行い、肥大および心機能の進行に従います。
- 動物を麻酔し、鼻コーンで5%セボフルランを吸入することによって、記載されている。麻酔レベルを2.5%に下げることで調整してください。
- ネックラインから中胸レベルに脱毛クリームを塗ります。
- 動物を加熱パッドの上に置き、ECG電極を置きます。良好な心電図のトレースを保証し、300〜350拍/分の間の心拍数を維持します。
- 温度(37°C)を監視します。
- エコーゲルを塗布し、動物を左横デキュビタスに配置します。
- 心エコーを開始し、設定を調整します。
- 超音波プローブを胸郭の上に置きます。
- バンディング手術とデバンディング手術後7週間と2週間でバンド全体の圧力勾配を評価します。プローブをLVの長い軸に置き、大オルタの上にビームを置きます。ボタンPWを押して、パルス波ドップラー心エコー検査を有効にします。7週間のバンディングの後、大動脈勾配はバンド動物で>25 mmHgになります。
- バンディングおよびデバンディングの有効性を解剖学的に可視化する上昇大オルタ収縮の有無を示す大オルタの2次元のガイド付き画像を記録する。
注: カラーモードが使用可能な場合、収縮レベルで乱流を可視化することができます。 - プローブをLV短軸、乳頭筋レベルに配置し、Mモードトレースを押して、LV前壁(LVAW)、LV直径(LVD)およびLV後壁(LVPW)をダイズストール(D)および収縮期(S)で可視化することによって肥大を評価する(図5)。
- 収縮期関数を評価し、前述の14,15のように放出分数と分数短縮を計算する。
- 1)僧帽弁リーフレットのすぐ上の頂点4室の叙語的なビューを使用して、初期および後期の僧帽流速度(E波とA波)のパルス波ドップラーのピークを決定することによって拡張期関数を評価する。2)パルスTDIおよびアプリカル4チャンバーの素端図を用いて、横方向の僧帽環状心筋初期の拡張期(E')およびピーク収縮期(S')速度を記録する(図5)。
- 各パラメーター評価に対して、3 つ以上の連続したハートビートを記録します。これらの値は、その後平均化されます。
8. 血行力学的評価
- プロトコルの最後(図4)では、末端血行力評価の前に、7に記載されているように、最終的な心エコー検査を行う。
- ステップ 2.1 ~ 3.6 を繰り返します。
- 右頸静脈をカニュレートし、滅菌生理食糸を64 mL/kg/hで浸透させる。
- 動物を左側に少し回転させ、xiphoid付録のレベルで皮膚切開を行います。
- 鉗子またははさみで筋肉から皮膚を分離します。
- 左肋骨間をxiphoidの付録レベルで横切りする。
- 心臓を完全に露出させるために左横胸部の胸部を行う。
注:出血や肺の損傷を避けるために、胸腔に綿棒を挿入し、肺を軽く押しながら、切断する場所の右側と左側に2つの止血を挿入します。 - P-Vループカテーテルを水浴中の37°Cで予熱します。
- カテーテルをキャリブレーションします(セットアップ、チャンネル設定、圧力と音量、単位に対して正しいチャンネルを選択)。
- カテーテルを遠心からLVに挿入し、大動脈弁と頂点の間にボリュームセンサが配置されていることを確認します。体積は心エコー検査で評価できます(図5)。圧力容積ループの可視化は、カテーテルの正しい位置を確認するのに役立ちます(図6)。
- 圧力量ループの形状を大きく変えることなく、動物が20〜30分安定するようにします。
- 換気が終了期日に中断された状態で、ベースライン記録を取得する(図6)。1,000 Hzでデータを継続的に取得し、適切なソフトウェアによってその後、オフラインで分析されます。
- ハイパートニック生理的な生理的なボーラス(10%、10 μL)後の並列コンダクタンスを計算します。
- 麻酔をしながら、血液を排泄し、収集し、遠心分離することによって動物を犠牲にします。
- 最後に、物品を食い物にして、心を集める。心臓、左、右心室を別々に重み付けし、その後の分子または組織学的研究のために、すぐに液体窒素またはホルマリンにサンプルを保存します。
ラットにおける大動脈バンディング/デバンディング手順
- 22G針と6-0ポリプロピレン合字を使用して、大動脈を収縮させる若いウィスター(70-90g)で大動脈バンディングを行います。
- セボフルランの3〜4%とブプレノルフィンの0.05mg/kgで適切な麻酔および鎮痛手順を確認してください。
- 心エコー検査中、心拍数は常に300以上の心拍数/分(理想的には300〜350の間)を保証します。
- ステップ8.9の前に、ラット大オルタを穏やかに解剖し、その周りにフロープローブを置き、心拍出量を測定する。大動脈フロープローブの使用は、ラットのゴールドスタンダード手順です。
- 血行力学的評価のために、流体投与のために頸静脈または大腿静脈をカニューレ(32 mL/kg/h)する。
- 圧力体積カテーテルSPR-1035をSPR-847またはSPR-838に交換し、そのサイズはラット心室の寸法に適しています。
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Representative Results
術後および後期生存
バンディング手順の周術期生存率は80%であり、最初の月の死亡率は典型的には<20%である。前述のように、骨抜き手術の成功は、以前の手術がどれほど侵襲的であったかによって大きく異なります。学習曲線の後、デベンディング手順中の死亡率は約25%です。この死亡率のアカウントは、大動脈または左心房破裂を含む手術処置中の主に死亡する(ラットでは、両方の外科的処置において生存率が高い)。
大動脈バンディングと心筋リモデリング
大動脈収縮の成功は、LV末端収縮圧(LVESP)の上昇とドップラー大動脈流速>2.5m/s、変更されたベルヌウリ方程式を用いて25mmHgの圧力勾配に相当する(図5)によって検証された。SHAMマウスと比較して、LV質量の増加(表1 および 図5)によって評価されるLV肥大のバンディング誘導と、より高い充填圧力(早期充填の僧帽弁ピーク速度の割合(E)と早期の拡張期僧帽環速度(E')、(E/e')、および左心室エンド拡張体圧(LVP)および弛緩(EDP) 表 1、 図 5、および図 6) を 7 週間以内に示します。この病気のこの段階では、吐出率はまだ保存されていた。
組織学的には、7週間の大動脈バンディングが重要な心筋細胞肥大および線維症を誘発した(図7)。
大動脈デバディングと心筋逆改造
デバンディングを受けたマウスでは、大動脈狭窄の除去に成功し、エコードップラー速度で検証した(表1および図5)。全体として、デバンディングは後負荷の有意な減少(LVESPの減少)およびLV肥大(穿刺、心エコー検査、および構造学によって評価される)を促進した。さらに、拡張期関数と大動脈速度の正規化を観察しました (表1,図5,図6,図7)。
表1:心エコー検査およびヘモダイナミクスによって評価される左心室形態機能変化。
| 重要なステップ | 助言 |
| バンディング手術の侵襲性 |
以下の点を避けることは重要です。 ●結紮中に上昇大オルタの長時間閉塞が起こるため、これは、肺浮腫および表現型および疾患の重症度に影響を及ぼし得る炎症性経路の活性化につながる可能性がある ●タイムリーに回避されていない場合、血圧の低下につながる可能性があり、胸郭を再び開くときに線維症の高い量を促進することができる乳腺動脈の出血(デカンディング); ●マウス胸膜炎と肺にダメージを与える。 ミニは、バンディングとデバンディング(同じ場所;現在の研究)対バンディングのための左横回裂術と骨抜き手術のための子宮摘出術のための横回し術術を残しました11: ●最初は侵襲性が低く、回復時間が短く、2週間後に行われたオープンチェスト血行力の成功を改善します。決して、胸部を再び開くために同じ位置を使用すると、癒着(左心房、肺動脈などの周り)による合併症の数を増やすことができます。バンディング手順中に余分に注意を払うことによって、この問題を克服します。 |
| 縫合の内部化 |
以下を使用して防止できます。 ● 2つのバンディング縫合糸を並べて16; ●ポリプロピレン11の代わりにシルク。 ●チタンクリップまたは大麦の周りのOリングは、その収縮を誘導する21; ●ダブルループクリップテニケ15; ●インフレータブルカフは、上腕大動脈バンディング22を行う。 |
| 生理学的パラメータ |
手術中に監視することが重要です。 ●心拍数; ●血液酸素化、90%以上(特に大間の成血中)を超えて保つ。 ●麻酔は、動物に不快感を与えることなく、可能な限り最低の用量でそれを維持する。 |
表 2: プロトコルの重要な手順。
図1:バンディングおよびデバンディング手順に使用される超微細な手術器具。(A)2針ホルダーとメスの刃。マウスの挿管とはさみのための2カテーテル;メス、2湾曲した鉗子、結紮援助、マイクロ外科用はさみ、3つのまっすぐな鉗子;(B)と26G針を、マウスの小さな胸部開口部に適切にフィットするように26G針を鈍らせた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:大動脈バンディング手順(A)磁気固定子引き込みシステムの助けを借りて行われる昇順大動脈への胸部アプローチ(3リトラクタが目に見える)。(B)昇順大オルタは、はっきりと解剖され、目に見える。鈍い針およびポリプロピレン縫合糸6-0は大動脈バンディングを行うために正しい位置に置かれる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 大動脈デバディング法. (A) マウスは磁気後退システムに入れられ、筋肉や組織を引っ込める便利なツールを表しています。マウスは、機械的換気のために挿管されています。直腸プローブは温度を制御し、オキシメーターは右マウスの足に置かれ、手術中の血液酸素を監視します。線維症および付着組織は、大大間および縫合糸の周囲を注意深く除去し、縫合線(B)および(C)を切断することができるようにする。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウスの実験プロトコル設計 心筋リモデリング(赤)と逆改造(緑)は、すべての評価タスクと一緒に下部に示されています。注意点として、デベンディング手術は、逆改造の明確な程度を持つ動物の2つのグループを生み出すことができます。このように、完全な(DEB-COMP)と不完全な(DEB-INCOM)心筋回復を用いてDEBマウスを得た。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:心臓の構造と機能の心エコー評価( A) 大動脈流速;(B) LV質量;(C)心室寸法(LV直径、LVD)と壁の厚さ(LV後壁、LVPWおよびLV前壁、LVAW);(D)トランスメラル流動(後期僧帽流速のパルスドップラー波のピーク、A、および初期の僧帽流速度のパルスドップラー波のピーク、E)および(E)心筋速度(後期拡張期僧帽環状組織速度、A';初期の拡張期ミトラル環状組織速度、E'およびシストリック・マノリック・ラネラ・ラニティ)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:SHAM、BA、およびDEBグループの代表的な圧力量ループ データは1000 Hzで継続的に取得され、その後PVANソフトウェアによってオフラインで分析されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:心筋肥大および線維症は組織学的に評価した。(A)SHAM(n=17)、BA(n=14)およびDEB群(n=12)からヘマトキシリン・エオシン(HE)染色切片(5μm)の心筋細胞断面領域によって評価された左心室肥大。(B) 左心室間質線維症およびSHAM(n =17)、BA(n = 13)およびDEB(n = 12)からのレッドシリウス染色切片(5μm)の代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書で提案されるモデルは、それぞれ大動脈バンディングおよびデバンディング後のLVリモデリングおよびRRのプロセスを模倣する。したがって、有害なLVリモデリングに関与する分子機構に関する我々の知識を進め、これらの患者の心筋回復を誘導することができる新しい治療戦略をテストするための優れた実験モデルを表しています。このプロトコルは、外科的外傷を軽減するために、低侵襲で非常に保守的な外科技術で大動脈バンディングおよびデバンディングのげっ歯類動物モデルを作成する方法の詳細を説明する。
プロトコルの最も重要なステップは、大動脈バンディング中の外科的侵略の程度に関連しています。その後の大動脈デバンディング手術の成功は、大動脈の周りの組織の攻撃性と線維症を回避する低侵襲バンディング手順に非常に依存し、したがって、より低侵襲なアプローチが必須である(表2)。縫合の内在化は、より少ないLV肥大およびより良い心機能16(表2)と関連しており、大動脈破裂を引き起こさずに骨抜き処置を行うことが不可能になる。今回の研究では、バンディング部位でより多くの瘢痕組織を作り出し、より安定した圧力過負荷を引き起こすため、シルクを使用しようとしました。しかし、私たちの手では、シルクがマルチフィラメントワイヤーであるため、大間からの完全な除去がより困難であるため、デダンディング手術はより厳しかったです。それにもかかわらず、これらは広くプロトコルとオペレータに依存する技術的な問題であり、これらの変動、縫合の種類は、良好な技術的慣行および生殖結果と互換性がありません。バンディング中、特にデバンディング中の生理学的パラメータモニタリングは、モデル実装の成功のために必須である(表2)。
1991年、ロックマンら、初めてマウスに横大間収縮(TAC)を記載した4.それ以来、かなりの量の論文が出てきた動物の年齢/サイズ17に関するバリエーションを有するこの手順の多数のバージョン、マウスの遺伝的背景18、針/収縮の直径19、バンディングに使用される材料、バンディングの大動脈位置、バンディング19とデバンディング11の持続時間。これらの方法論的な選択肢はすべて、各研究の目的を果たす限り有効です。しかし、心不全に向かう疾患の進行はより速く、したがって選択時にRRはより不完全であることを強調すべきである:1)より長いバンディング持続時間、2)マウス20および3)大動脈収縮に使用されるより小さい針径(大動脈収縮の高い割合)16。
バンディングの持続時間およびデバンディングは、疾患の段階に大きく影響し、したがって、RR中の回復。同様に、デベンディングのための適切なタイミングを選択することは、想定される疾患の重症度に適応するために必須です。我々の研究で観察された結果は、存在前動物11、21およびヒト研究22に従い、心筋細胞肥大を除き、いくつかの研究は、その正常化10、21および他の部分回帰23を示した。 また、研究は、線維症の退行が長期(ヒト患者の場合は70ヶ月)24で起こり得る。結果は、線維症25に対処するために使用される技術に依存しているようです。最近、Treibelらは、T1マッピング22との心臓血管磁気共鳴を用いて、大動脈弁置換術後の大動脈狭窄患者における細胞(筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、赤血球)と細胞外(ECM、血漿)コンパートメントとを区別することができた。彼らは、AVRに続くLV質量の回帰は、細胞外容積が減少する1)行列回帰だけで駆動することができることを説明した。2)細胞内の回帰のみ, 細胞外の容積が増加する場所;3)細胞およびマトリックス区画における比例回帰により、細胞外容積が変化しない22.これらの著者らは、AVRに続いて、びまん性線維症および心筋細胞肥大の後退が、焦点線維症は解決しないと結論付けた。したがって、拡散間質線維化は、マトリックス体積によって評価されるように、潜在的な治療標的である。我々の研究では、線維症の減少は、RRの2週間以内および心筋細胞肥大の正常化の前に起こるようです。また、デバンディングの2週間後に動物を犠牲にすることは、DEB群、すなわち拡張期機能不全持続性(DEB-INCOM)および完全なLV質量逆転および拡張期機能改善(DEB-COM)を有する動物の間で心室多様性を得るのに最適なタイミングであった。さらに、デバンディング後2週間で、我々は以前に26を回収した後に部分的に回復するバンディング群の有意な右室変化を示したが、ビョルンスタッドらは胎児遺伝子発現の正常化を報告したが、同じ時間枠内の心筋リモデリングを示す。
バンディング/デバンディングの外科的処置はラット26でも行うことができるが、いくつかの違いが強調されるべきである。その大きなサイズのために、ラットは大動脈の視覚化を減少させ、大動脈の周りの合字の位置を妨げるマウスよりも多くの筋肉層を有する。一方、アトリアや肺などの隣接する組織や臓器に損傷を与えるリスクは最小限に抑えられます。縫合体内在化の問題を克服するために、ラットでより大きなポリプロピレン合字を使用して大腸をしっかりと保持しました(7.0ポリプロピレンではなく6.0)。
大大脳の操作のために、デベンディング手術は、LVに追加の後負荷を課すことによって心拍出量を減少させ、したがって循環および呼吸器系を損なう可能性がある。マウスと比較すると、ラットはより長い麻酔期間に対してより耐性があるように見えるので、長い骨抜き手術中に制御される生理学的呼吸パラメータを維持することが容易である。ラットでは、LV肥大の発達はマウスよりも速いが、心不全に進行するのに時間がかかる。したがって、デバンディング手術は、駆出画26を損なうことなく、バンディング処置後5〜9週間の間に行うことができる。
バンディング/デバンディング動物モデルの主な制限は、通常、デバンディング手術を達成するために長い学習曲線を必要とするオペレータの要求の厳しい微小外科的スキルと技術です。もう一つの制限は、より生理学的となるマウスとラットで近い胸の血液力学を行うことが不可能である。しかし、この方法を用いることによって、右頸動脈からLVにカテーテルを挿入することが義務付けされ、この特定の場合には大動脈を上昇させる動物が頸動脈枝の前に収縮するので実現不可能である。またマウスでは、心筋機能の適切な特性評価のための重要なパラメータである大静脈閉塞操縦を行うことにより、負荷非依存性(ESPVR)および拡張期パラメータ(EDPVRの傾き)を測定できませんでした。この操縦は、サイズが小さいため、大石狭窄を有するマウスでは行いにくいことがわかった(20~25g)。
バンディング/デバンディング動物モデルの将来の応用には、心筋疾患に対する新しい治療アプローチの開発と、LVリモデリングおよびRRのプロセスの根本となる経路の特徴付けが含まれる。
結論として、この臨床的に関連するモデルは、心筋リモデリングおよびRRの異なる段階で心筋サンプルの収集を可能にするので、HFに向かって進行を時間的および機械的に特徴付けることを可能にする。さらに、障害のある心臓の回復を目的とした治療戦略をテストするための有用な実験モデルであることが証明される。
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Disclosures
著者には利益相反はない。
Acknowledgments
著者らは、ポルトガル科学技術財団(FCT)、欧州連合、クエロ・デリメンシア・エストラテジコ・ナシオナル(QREN)、フンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)、プログラム・オペラシオナル・ファクタレス・デ・コンペティティビダード(COMPETE)に感謝する。このプロジェクトは、COMPETEERによってサポートされています COMPETE2020 – プログラムオペラシオナルコンペティティビダーデEインテルナシオナリザサン(POCI)、プロジェクトDOCNET(NORTE-01-0145-FEDER-000003)、ノルテポルトガル地域運用プログラム(NORTE 2020)、ポルトガル2020パートナーシップ、合意の下で、 欧州地域開発基金(ERDF)を通じて、リスボンの地域運用プログラムである欧州構造投資ファンドが支援するプロジェクトNETDIAMOND(POCI-01-0145-FEDER-016385)を通じて行います。ダニエラ・ミランダ=シルバとパティシア・ロドリゲスは、フェローシップ助成金(SFRH/BD/87556/2012およびSFRH/BD/96026/2013)によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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