Summary
Qui descriviamo un protocollo passo-passo di scioglimento dell'aorta chirurgica nel consolidato modello di topi di costrizione aortica. Questa procedura non solo consente di studiare i meccanismi alla base del rimodellamento inverso ventricolare sinistro e della regressione dell'ipertrofia, ma anche di testare nuove opzioni terapeutiche che potrebbero accelerare il recupero del miocardio.
Abstract
Per comprendere meglio il rimodellamento inverso ventricolare sinistro (LV) (RR), descriviamo un modello di roditore in cui, dopo il rimodellamento lv indotto dalla bande aortica, i topi subiscono RR dopo la rimozione della costrizione aortica. In questo articolo, descriviamo una procedura passo-passo per eseguire uno scioglimento aortico chirurgico minimamente invasivo nei topi. L'ecocardiografia è stata successivamente utilizzata per valutare il grado di ipertrofia cardiaca e disfunzione durante il rimodellamento della LV e RR e per determinare la migliore tempistica per lo scioglimento aortico. Alla fine del protocollo, è stata condotta una valutazione emodinamica terminale della funzione cardiaca e sono stati raccolti campioni per studi istologici. Abbiamo dimostrato che lo scioglimento è associato a tassi di sopravvivenza chirurgica del 70-80%. Inoltre, due settimane dopo lo scioglimento, la significativa riduzione del post-carico ventricolare innesca la regressione dell'ipertrofia ventricolare (~20%) e fibrosi (~26%), recupero della disfunzione diastolica valutata dalla normalizzazione del riempimento ventricolare sinistro e delle pressioni end-diastoliche (E/e' e LVEDP). Lo scioglimento aortico è un utile modello sperimentale per studiare l'LV RR nei roditori. L'estensione del recupero del miocardio è variabile tra i soggetti, quindi, imitando la diversità di RR che si verifica nel contesto clinico, come la sostituzione della valvola aortica. Concludiamo che il modello di bande/scioglimento aortico rappresenta uno strumento prezioso per svelare nuove intuizioni sui meccanismi della RR, vale a dire la regressione dell'ipertrofia cardiaca e il recupero della disfunzione diastolica.
Introduction
La costrizione dell'aorta trasversale o ascendente nel topo è un modello sperimentale ampiamente utilizzato per l'ipertrofia cardiaca indotta dal sovraccarico di pressione, la disfunzione diastolica e sistolica el'insufficienza cardiaca 1,2,3,4. La costrizione aortica porta inizialmente all'ipertrofia concentrica del ventricolo sinistro (LV) compensata per normalizzare lo stress della parete1. Tuttavia, in determinate circostanze, come il sovraccarico cardiaco prolungato, questa ipertrofia è insufficiente a ridurre lo stress della parete, innescando disfunzione diastolica e sistolica (ipertrofia patologica)5. In parallelo, i cambiamenti nella matrice extracellulare (ECM) portano alla deposizione di collagene e al retillo incrociato in un processo noto come fibrosi, che può essere suddiviso in fibrosi sostitutiva e fibrosi reattiva. La fibrosi è, nella maggior parte dei casi, irreversibile e compromette il recupero del miocardio dopo il sollievo dalsovraccarico 6,7. Tuttavia, recenti studi di risonanza magnetica cardiaca hanno rivelato che la fibrosi reattiva è in grado di regredire a lungotermine 8. Complessivamente, fibrosi, ipertrofia e disfunzione cardiaca fanno parte di un processo noto come rimodellamento miocardico che progredisce rapidamente verso l'insufficienza cardiaca (HF).
Comprendere le caratteristiche del rimodellamento miocardico è diventato un obiettivo importante per limitare o invertire la sua progressione, quest'ultimo noto come reverse remodeling (RR). Il termine RR include qualsiasi alterazione miocardica cronicamente invertita da un dato intervento, come la terapia farmacologica (ad esempio, farmaci antipertensivi), la chirurgia valvolare (ad esempio, stenosi aortica) o i dispositivi di assistenza ventricolare (ad esempio, HF cronico). Tuttavia, l'RR è spesso incompleto a causa dell'ipertrofia prevalente o della disfunzione sistolica / diastolica. Pertanto, manca ancora il chiarimento dei meccanismi sottostanti RR e delle nuove strategie terapeutiche, il che è dovuto principalmente all'impossibilità di accedere e studiare il tessuto miocardico umano durante la RR nella maggior parte di questi pazienti.
Per superare questa limitazione, i modelli di roditori hanno svolto un ruolo significativo nel far progredire la nostra comprensione delle vie di segnalazione coinvolte nella progressione HF. Nello specifico, lo scioglimento aortico dei topi con costrizione aortica rappresenta un modello utile per studiare i meccanismi molecolari alla base del rimodellamento avverso dell'LV9 e RR10,11 in quanto consente la raccolta di campioni miocardiali in diversi punti di tempo in queste due fasi. Inoltre, fornisce un'eccellente impostazione sperimentale per testare potenziali nuovi obiettivi in grado di promuovere / accelerare RR. Ad esempio, nel contesto della stenosi aortica, questo modello potrebbe fornire informazioni sui meccanismi molecolari coinvolti nella vasta diversità della risposta miocardica alla base della (in)completezza dell'RR6,12, nonché, la tempistica ottimale per la sostituzione della valvola, che rappresenta una grave lacuna delle conoscenze attuali. In effetti, la tempistica ottimale di questo intervento è oggetto di dibattito, principalmente perché è definita in base all'entità dei gradienti aortici. Diversi studi sostengono che questo punto di tempo potrebbe essere troppo tardi per il recupero del miocardio poiché la fibrosi e la disfunzione diastolica sono spessogià presenti 12.
Per quanto ne sappiamo, questo è l'unico modello animale che riassume il processo di rimodellamento del miocardio e RR che avviene in condizioni come stenosi aortica o ipertensione prima e dopo la sostituzione della valvola o l'insorgenza di farmaci anti-ipertensivi, rispettivamente.
Cercando di affrontare le sfide riassunte sopra, descriviamo un modello animale chirurgico che può essere implementato sia nei topi che nei ratti, affrontando le differenze tra queste due specie. Descriviamo i passaggi principali e i dettagli coinvolti nell'esecuzione di questi interventi chirurgici. Infine, segnalamo i cambiamenti più significativi in atto nell'LV immediatamente prima e in tutto il RR.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi alla Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio (pubblicazione n. 85-23 del NIH, rivista nel 2011) e alla legge portoghese sul benessere degli animali (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Le autorità locali competenti hanno approvato questo protocollo sperimentale (018833). I topi maschi C57B1/J6 di sette settimane sono stati mantenuti in gabbie appropriate, con un ambiente regolare a ciclo chiaro-scuro di 12/12 ore, una temperatura di 22 °C e un'umidità del 60% con accesso all'acqua e un ad libitum dietetico standard.
1. Preparazione del campo chirurgico
- Disinfettare il sito operativo con il 70% di alcol e posizionare una copertura del tavolo della sala operatoria usa e getta sull'area chirurgica.
- Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell'intervento chirurgico.
NOTA: Questa procedura richiede forbici microchir chirurgiche, 2 pinze curve fini, 3 forcep dritte fini, un bisturi, piccole pinze, una forbice sezionata angolata, un supporto per aghi, un aiuto alla legatura ultrafine, 2 emostati e, infine, un sistema di retrazione del fissatore magnetico è altamenteraccomandato (Figura 1A). - Curvare la punta di un ago smussato da 26 G a 90° per un approccio più facile all'aorta. Un ago da 26 G creerà un restringimento aortico di 0,45 mm di diametro (Figura 1B).
- Regolare la temperatura del riscaldante a 37 ± 0,1 °C.
2. Preparazione e intubazione dei topi
- Anestetizzare i giovani topi C57B1/J6 (20-25 g) per inalazione dell'8% di sevoflurane con 0,5 - 1,0 L/min 100% O2 in un tubo del cono.
- Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di prelievo del dito del dito del dito.
- Posizionare il topo a rimostranza dorsale su una piastra inclinata e procedere all'intubazione orotracheale.
- Spostare il mouse sul pad di riscaldamento e collegare rapidamente il tubo orotracheale al ventilatore per avviare la ventilazione meccanica.
- Regolare i parametri del ventilatore a una frequenza di 160 respiri/min e a un volume di marea di 10 mL/kg.
3. Preparazione per l'intervento chirurgico (sia per gli interventi di fasciatura che per lo scioglimento)
- Radere e applicare la crema depilatoria dalla scollatura al livello medio toracico dei topi.
- Applicare gel oftalmico agli occhi degli animali per evitare l'essiccazione dalla cornea.
- Posizionare una sonda rettale e l'ossimetro alla zampa o alla coda per monitorare rispettivamente la temperatura e l'ossigenazione del sangue e la frequenza cardiaca.
NOTA: L'anestesia induce un'ipotermia significativa, pertanto è importante mantenere la normale temperatura corporea durante l'intervento chirurgico per evitare una rapida diminuzione della frequenza cardiaca. - Mantenere l'anestesia con sevoflurane (2,0 - 3,0%). Controllare il corretto livello di anestesia per la mancanza del riflesso del dito del dito del clic.
- Posizionare i topi in decubito laterale destro su un riscaldatore e fissare gli arti al sistema di retrazione del fissatore magnetico con un nastro adesivo per mantenere l'animale nella posizione corretta durante l'intervento chirurgico(Figura 2, Figura 3A).
- Disinfettare il torace del topo con il 70% di alcol seguito da soluzione di providone-iodio.
4. Chirurgia ascendente della fascia aortica
NOTA: per una descrizione dettagliata del protocollo, consultare 2,3,4,13.
- Con una lama monouso, eseguire una piccola incisione cutanea (~ 0,5 cm) sul lato sinistro immediatamente sotto il livello dell'ascella e sezionare la pelle.
- Sezionare delicatamente e separare il muscolo pettorale e altri strati muscolari fino a quando le costole diventano visibili. Utilizzare forcep fini ed evitare di tagliare il muscolo.
- Al microscopio, identificare gli spazi intercostali e aprire una piccola incisione tra il2° e il 3°spazio intercostale con forcep fini.
- Ritrarre le costole posizionando il riavvolgitoretoracico ( Figura 2A).
- Utilizzare piccole forcep per sezionare delicatamente e separare i lobi timici fino a quando l'aorta ascendente diventa visibile.
NOTA: Gli applicatori di cotone devono essere utili in caso di sanguinamento. La salina sterile calda deve essere somministrata per via sottocutanea in caso di sanguinamento significativo (ad esempio, l'arteria mammaria). - Utilizzare piccole forcep per sezionare delicatamente l'aorta.
NOTA: Aorta è considerato sezionato quando non ci sono grassi o altre aderenze intorno ad esso ed è possibile circondare facilmente il vaso con una piccola curva forcep. - Dopo la dissezione aortica, posizionare una legatura di polipropilene 7-0 attorno all'aorta utilizzando l'ausilio alla legatura e le forcep curve(Figura 2B).
- Posizionare l'ago smussato da 26 G parallelo all'aorta (punta puntata verso la testa dei topi)(Figura 2B). Per topi di peso compreso tra 20 e 25 g, questo ago induce una costrizione aortica riproducibile al 65-70%.
- Fare 2 nodi sciolti intorno all'aorta e all'ago da 26 G con l'aiuto di 2 pini(Figura 2B).
- Stringere il nodo 1st e, subito dopo, il2 ° nodo. Confermare brevemente il giusto posizionamento della costrizione e rimuovere rapidamente l'ago per ripristinare il flusso sanguigno aortico. Infine, fare un 3° nodo (gruppo BA).
- Riposizionare il timo e i muscoli nella loro posizione iniziale.
- Eseguire la procedura sham identica alla procedura di costrizione, ma mantenendo la sutura libera intorno all'aorta (gruppo SHAM).
- Tagliare le estremità della sutura e rimuovere il retrattile del torace.
NOTA: Le estremità corte della sutura possono aumentare la probabilità che i nodi si allentno con la pressione aortica, mentre le estremità lunghe rendono la procedura di scioglimento più rischiosa poiché possono verificarsi aderenze tra la sutura e l'atrio sinistro. - Chiudere la parete toracica utilizzando la sutura in polipropilene 6-0 con una sutura semplice interrotta o continua utilizzando il minor numero possibile di punti. Stringere l'ultimo nodo toracico con i polmoni gonfiati all'ispirazione finale pizzicando il deflusso del ventilatore per 2s per gonfiare i polmoni.
- Chiudere la pelle con una sutura 6-0 seta/polipropilene in un motivo di sutura continuo.
NOTE: Se viene utilizzato un ventilatore più recente, è possibile programmarlo per fermarsi in ispirazione (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Assistenza post-operatoria
- Applicare la soluzione di providone-iodio sul sito di sutura della pelle.
- Per una corretta analgesia, somministrare buprenorfina per via sottocutanea 0,1 mg/kg, due volte al giorno, fino a quando l'animale non si riprende completamente (di solito 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico).
- Iniettare soluzione salina sterile intraperitonealmente per prevenire la disidratazione in caso di sanguinamento significativo durante l'intervento chirurgico.
- Spegnere l'anestesia (senza distiziare il topo) e attendere che l'animale recuperi i riflessi (i movimenti dei baffi sono un segnale di risveglio) e inizia a respirare spontaneamente.
- Rimuovere la cannula tracheale.
- Lasciare che l'animale si riprenda in un'incubatrice a 37 °C.
- Riportare l'animale in una stanza del ciclo chiaro / scuro di 12 ore dopo il pieno recupero.
6. Chirurgia di scioglimento aortico
- Sette settimane dopo, eseguire lo scioglimento dell'aorta in metà degli animali BA e rimuovere la sutura sciolta dalla metà dei topi SHAM, dando origine a 2 nuovi gruppi - scioglimento (DEB) e scioglimento shama (DESHAM), rispettivamente. DESHAM rappresenta il controllo per il gruppo DEB (Figura 4).
- Ripetere tutti i passaggi da 2.1 a 3.6 sopra menzionati.
- Sezionare delicatamente i tessuti, le aderenze e la fibrosi intorno all'aorta fino a quando la sua costrizione diventa visibile.
- Sezionare attentamente l'aorta e separare la sutura dall'aorta. Tagliare la sutura con forbici angolate a molla con un sondaggio(Figura 3B).
- Chiudere la parete toracica utilizzando la sutura in polipropilene 6-0 con una sutura semplice interrotta o continua utilizzando il numero minimo di punti possibile.
NOTA: Prova a stringere l'ultima sutura toracica quando i polmoni sono gonfiati per evitare lo pneumotorace. - Chiudere la pelle con una sutura 6-0 seta/polipropilene in un motivo di sutura continuo.
- Eseguire tutte le procedure di assistenza post-operatoria come menzionato al 5.
- Sacrifica gli animali 2 settimane dopo.
7. Ecocardiografia per valutare la funzione cardiaca e l'ipertrofia ventricolare sinistra in vivo
- Eseguire l'esame ecocardiografico ogni 2-3 settimane per seguire la progressione dell'ipertrofia e della funzione cardiaca.
- Anestetizzare gli animali, come descritto, per inalazione del 5% di sevoflurane con un cono del naso. Regolare il livello di anestesia diminuendolo al 2,5%.
- Radere e applicare la crema depilatoria dalla scollatura al livello medio del torace.
- Posizionare l'animale su una pastiglia riscaldante e posizionare gli elettrodi ECG. Assicura una buona traccia ECG e mantieni la frequenza cardiaca tra 300 e 350 battiti / min.
- Monitorare la temperatura (~37 °C).
- Applicare il gel eco e posizionare l'animale al decubito laterale sinistro.
- Avviare l'ecocardiografo e regolare le impostazioni.
- Posizionare una sonda ad ultrasuoni sul torace.
- Valutare il gradiente di pressione attraverso la fascia a 7 e 2 settimane dopo l'intervento chirurgico di bande e scioglimento, rispettivamente. Posizionare la sonda sull'asse lungo LV e posizionare il fascio sopra aorta. Premere il tasto PW per attivare l'ecocardiografia Doppler ad onda pulsata. Dopo sette settimane di bande, i gradienti aortici saranno > 25 mmHg negli animali fasciati.
- Registra immagini guidate bidimensionali di aorta che mostrano la presenza o l'assenza della costrizione aorta ascendente per visualizzare anatomicamente l'efficacia della bandettatura e dello scioglimento.
NOTA: È possibile visualizzare il flusso turbolento a livello di costrizione se la modalità colore è disponibile. - Valutare l'ipertrofia posizionando la sonda su un asse corto LV, a livello dei muscoli papillari, e premere il tracciamento in modalità M per visualizzare la parete anteriore LV (LVAW), il diametro LV (LVD) e la parete posteriore LV (LVPW) in diastole (D) e sistole (S)(Figura 5).
- Valutare la funzione sistolica, calcolare la frazione di espulsione e l'accorciamento frazionato comedescritto in precedenza 14,15.
- Valutare la funzione diastolica di 1) determinare il picco di Doppler ad onda pulsata della velocità del flusso mitralico precoce e tardivo (onde E e A, rispettivamente) usando una vista apicale a 4 camere apicale appena sopra i foglioline mitraliche; 2) registrazione delle velocità diastolica precoce del miocardio anulare mitralico laterale (E') e del picco sistolico (S') utilizzando la TDI pulsata e la vista apicale a 4 camere apicale(figura 5).
- Registrare almeno tre heartbeat consecutivi in ogni valutazione dei parametri. Questi valori saranno successivamente mediati.
8. Valutazione emodinamica
- Alla fine del protocollo ( Figura4), eseguire l'ecocardiografia finale, come descritto al punto 7, prima della valutazione emodinamica terminale.
- Ripetere i passaggi da 2.1 a 3.6.
- Cannulate la vena giugulare destra e perfondete la soluzione salina sterile a 64 mL/kg/h.
- Ruotare leggermente l'animale sul lato sinistro e fare un'incisione cutanea a livello dell'appendice xifoide.
- Separare la pelle dal muscolo con le forcep o con una forbice.
- Fare un'incisione laterale tra le costole sinistra a livello dell'appendice xifoide.
- Eseguire una toracotomia laterale sinistra per esporre completamente il cuore.
NOTA: Per evitare sanguinamenti e danni polmonari, inserire un batuffolo di cotone nella cavità toracica e spingere delicatamente il polmone inserendo due hemostat sul lato destro e sinistro del luogo per tagliare. - Preriripidi i cateteri ad anello P-V in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Calibrare il catetere (impostazione, impostazione del canale, scegliere il canale corretto per pressione e volume, unità).
- Inserire un catetere apicamente nel LV e assicurarsi che i sensori di volume siano posizionati tra la valvola aortica e l'apice. I volumi possono essere valutati mediante ecocardiografia(figura 5). La visualizzazione dei loop pressione-volume aiuta a confermare il corretto posizionamento del catetere (Figura 6).
- Consentire all'animale di stabilizzare 20-30 minuti senza cambiamenti significativi nella forma dei loop pressione-volume.
- Con la ventilazione sospesa alla scadenza finale, acquisire registrazioni di base (Figura 6). Acquisire continuamente dati a 1.000 Hz per essere successivamente analizzati off-line da software appropriato.
- Calcolare la conduzione parallela dopo il bolo salino ipertonico (10%, 10 μL).
- Mentre anestetizzò, sacrifica l'animale per esanguinamento, raccogli e centrifuga il sangue.
- Infine, le accise e raccogliere il cuore. Pesare separatamente il cuore, la sinistra e il ventricolo destro e conservare immediatamente i campioni in azoto liquido o formalina per successivi studi molecolari o istologici, rispettivamente.
9. Procedura di bande/scioglimento aortico nei ratti
- Eseguire bande aortiche in giovane Wistar (70-90 g) usando un ago da 22 G e legatura in polipropilene 6-0 per restringere l'aorta.
- Garantire procedure anestetiche e analgesiche adeguate con rispettivamente il 3-4% di sevoflurane e 0,05 mg/kg di buprenorfina.
- Durante l'ecocardiografia, assicurare una frequenza cardiaca sempre superiore a 300 frequenza /min (idealmente tra 300 e 350).
- Prima del passaggio 8.9, sezionare delicatamente l'aorta del ratto, posizionare una sonda di flusso intorno ad essa per misurare l'uscita cardiaca. L'uso della sonda a flusso aortica è la procedura gold standard per i ratti.
- Per la valutazione emodinamica, cannulato la vena giugulare o femorale per la somministrazione di liquidi (32 mL/kg/h).
- Sostituire il catetere pressione-volume SPR-1035 con l'SPR-847 o l'SPR-838, le cui dimensioni si adattano meglio alle dimensioni ventricolari del ratto.
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Representative Results
Sopravvivenza post-operatoria e tardiva
La sopravvivenza perioperatoria della procedura di banda è dell'80% e la mortalità durante il primo mese è in genere <20%. Come accennato in precedenza, il successo della chirurgia di scioglimento dipende fortemente da quanto fosse invasivo l'intervento chirurgico precedente. Dopo una curva di apprendimento, il tasso di mortalità durante le procedure di scioglimento è di circa il 25%. Per questo la mortalità spiega principalmente i decessi durante la procedura chirurgica, inclusa la rottura dell'aorta o dell'atrio sinistro (nei ratti, il tasso di sopravvivenza è più alto in entrambe le procedure chirurgiche).
Fasciatura aortica e rimodellamento miocardico
Il successo della costrizione aortica è stato verificato dall'aumento della pressione sistolica finale LV (LVESP) e dalle velocità di flusso aortico doppler >2,5 m/s, che corrisponde a un gradiente di pressione di 25 mmHg utilizzando l'equazione di Bernoulli modificata (Figura 5). Rispetto ai topi SHAM, l'ipertrofia lv indotta da bande valutate dall'aumento della massa LV (tabella1 e figura 5)e la funzione diastolica compromessa evidente da pressioni di riempimento più elevate (rapporto tra la velocità di picco mitralica del riempimento precoce (E) e la velocità anulare mitrale diastolica precoce (E'), (E/e'), e la pressione end-diastolica ventricolare sinistra (LVEDP) e il rilassamento prolungato (t, Tabella 1, Figura 5e Figura 6) entro 7 settimane. La frazione di espulsione era ancora conservata in questa fase della malattia.
Istologicamente, sette settimane di bande aortiche hanno indotto una significativa ipertrofia cardiomiocitaria e fibrosi (Figura 7).
Sbandamento aortico e rimodellamento inverso miocardico
Nei topi sottoposti a scioglimento, la corretta rimozione della stenosi aortica è stata verificata dalle velocità echo Doppler(tabella 1 e figura 5). Nel complesso, lo scioglimento ha promosso una significativa diminuzione del carico post-carico (diminuzione della LVESP) e dell'ipertrofia LV (valutata per morfometria, ecocardiografia e istologia). Inoltre, la Abbiamo osservato la normalizzazione della funzione diastolica e delle velocità aortiche(tabella 1, figura 5, figura 6e figura 7).
Tabella 1: Cambiamenti morfofunzionali del ventricolo sinistro valutati mediante ecocardiografia ed emodinamica.
| Passaggi critici | consiglio |
| Invasività della chirurgia di fasciatura |
È importante evitare: ● occlusione prolungata dell'aorta ascendente durante la legatura, che può portare a edema polmonare e attivazione di vie infiammatorie in grado di influenzare il fenotipo e la gravità della malattia15 ● sanguinamento dell'arteria mammaria che, se non tempestivamente aggirato, può portare a una diminuzione della pressione sanguigna e promuovere maggiori quantità di fibrosi quando si riapri il torace (scioglimento); ● danneggiare pleura e polmoni dei topi; Mini toracotomia laterale sinistra per fasciatura e scioglimento (stesso luogo; presente studio) vs toracotomia laterale sinistra per la fasciatura e sternotomia per l'intervento di scioglimento11: ● il primo è meno invasivo e ha un breve tempo di recupero, che migliora il successo dell'emodinamica a torace aperto eseguita due settimane dopo. Tuttavia, l'uso della stessa posizione per riapro il torace può aumentare il numero di complicazioni dovute ad aderenze (intorno all'atrio sinistro, all'arteria polmonare, ecc.). Supera questo problema avendo un'attenzione extra durante la procedura di banding. |
| Internalizzazione sutura |
Può essere prevenuto utilizzando: ● due suture di bande affiancate16; ● seta al posto del polipropilene11; ● clip in titanio o o-ring intorno all'aorta per indurre la sua costrizione21; ● doppio loop-clip thecnique15; ● polsino gonfiabile per effettuare bande aortiche sopracoronarie22. |
| Parametri fisiologici |
Durante l'intervento chirurgico è importante monitorare: ● frequenza cardiaca; ● ossigenazione del sangue, mantenendola al di sopra del 90% (specialmente durante la manupilazione dell'aorta); ● anestesia, mantenendola alla dose più bassa possibile senza infliggere disagio all'animale. |
Tabella 2: Fasi critiche del protocollo.
Figura 1: Strumenti chirurgici ultra fini utilizzati per le procedure di bande e di scioglimento. (A) 2 portaaghi e una lama bisturi; 2 cateteri per l'intubazione dei topi e una forbice; un bisturi, 2 forcep curve, un aiuto di legatura, una forbice microchirurgica, 3 forcette dritte; (B) e ago 26G e ago 26G smussato curvo per adattarsi correttamente alla piccola apertura toracica dei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Procedura di bande aortica. (A) L'approccio toracico all'aorta ascendente eseguito con l'aiuto di un sistema di retrazione del fissatore magnetico (sono visibili 3 retrattori). (B) L'aorta ascendente è chiaramente sezionata e visibile. L'ago smussato e la sutura in polipropilene 6-0 sono posizionati nella posizione giusta per eseguire la fascia aortica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Procedura di scioglimento aortico. (A) Il mouse è posto in un sistema di retrazione magnetica, che rappresenta un pratico strumento per ritrarre i muscoli e i tessuti. Il mouse è intubato per la ventilazione meccanica. Una sonda rettale controlla la temperatura e un ossimetro viene posizionato sulla zampa destra dei topi per monitorare l'ossigenazione del sangue durante l'intervento chirurgico. La fibrosi e il tessuto aderente vengono accuratamente rimossi intorno all'aorta e alla sutura, per poter tagliare la sutura (B) e (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Progettazione sperimentale del protocollo per topi. Il rimodellamento miocardico (rosso) e il rimodellamento inverso (verde) sono mostrati in basso insieme a tutte le attività di valutazione. Da notare che la chirurgia di scioglimento può dare origine a due gruppi di animali con distinti gradi di rimodellamento inverso. Pertanto, abbiamo ottenuto il mouse DEB con recupero miocardico completo (DEB-COMP) e incompleto (DEB-INCOM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione ecocardiografica della struttura e della funzione cardiaca. (A) Velocità del flusso aortico; (B) Massa LV; (C) Dimensioni ventricolari (diametro LV, LVD) e spessore della parete (parete posteriore LV, parete anteriore LVPW e LV, LVAW); (D) Flusso trasmittente (picco dell'onda doppler dell'impulso di velocità del flusso mitralico tardivo, A, e picco dell'onda doppler pulsata della velocità del flusso mitralico precoce, E) e (E) Velocità del tessuto anulare mitrale tardo diastolica, A'; velocità precoce del tessuto anulare mitrale diastolico, velocità del tessuto anulare mitralica E' e sistolica, S'). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Circuiti rappresentativi pressione-volume per gruppi SHAM, BA e DEB. I dati sono stati continuamente acquisiti a 1000 Hz e successivamente analizzati off-line dal software PVAN. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Ipertrofia miocardica e fibrosi valutate istologicamente. (A) Ipertrofia del ventricolo sinistro valutata dall'area sezionale dei cardiomiociti delle sezioni macchiate di ematossilina-eosina (HE) (5 μm) di SHAM (n = 17), BA (n = 14) e gruppo DEB (n = 12). (B) Fibrosi interstiziale ventricolare sinistra e immagini rappresentative di sezioni macchiate di Sirio Rosso (5 μm) da SHAM (n = 17), BA (n = 13) e DEB (n = 12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il modello proposto nel presente documento imita il processo di rimodellamento dell'LV e RR dopo la fasciatura e lo scioglimento aortici, rispettivamente. Pertanto, rappresenta un ottimo modello sperimentale per far progredire le nostre conoscenze sui meccanismi molecolari coinvolti nel rimodellamento avverso della LV e per testare nuove strategie terapeutiche in grado di indurre il recupero miocardico di questi pazienti. Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi su come creare un modello animale roditore di bande aortiche e disbandamento con una tecnica chirurgica minimamente invasiva e altamente conservativa per ridurre il trauma chirurgico.
La fase più critica del protocollo è correlata al grado di aggressività chirurgica durante la fasciatura aortica. Il successo del successivo intervento di scioglimento aortico dipende enormemente da una procedura di bandezione minimamente invasiva che evita aggressività tissutale e fibrosi intorno all'aorta e, pertanto, è obbligatorio un approccio meno invasivo(tabella 2). L'internalizzazione della sutura è associata a meno ipertrofia LV e a una migliore funzionecardiaca 16 (tabella 2)e rende impossibile eseguire la procedura di scioglimento senza causare una rottura aortica. Nel presente studio, abbiamo cercato di usare la seta, poiché crea più tessuto cicatriziale nel sito di bande, innescando un grado più stabile di sovraccarico di pressione. Tuttavia, nelle nostre mani, l'intervento di scioglimento era più impegnativo quando la seta è stata utilizzata poiché è un filo multifilamento che rende la sua rimozione totale dall'aorta più difficile. Tuttavia, si tratta di questioni tecniche che dipendono ampiamente dal protocollo e dall'operatore, e queste variazioni, tipo di sutura, non sono incompatibili con le buone pratiche tecniche e i risultati riproduttivi. Il monitoraggio dei parametri fisiologici durante la banda e soprattutto durante lo scioglimento è obbligatorio per il successo dell'implementazione del modello(tabella 2).
Nel 1991, Rockman et al., descrisse la costrizione trasversale dell'aorta (TAC) nel topo per la prima volta4. Da allora è uscita una notevole quantità di documenti che forniscono numerose versioni di questa procedura con variazioni per quanto riguarda l'età/ dimensioneanimale 17,il background genetico dei topi18,il diametro dell'ago / costrizione19,il materiale utilizzato per la fasciatura, la posizione aortica della fasciatura, la durata della fascia19 e loscioglimento 11. Tutte queste alternative metodologiche sono valide purché realizzino gli obiettivi di ogni studio. Tuttavia, dovremmo sottolineare che la progressione della malattia verso l'insufficienza cardiaca è più veloce e quindi RR è più incompleto quando si seleziona: 1) durate di bande più lunghe, 2) più pesanti / anzianii topi 20 e 3) diametro dell'ago più piccolo utilizzato per la costrizione aortica (percentuale più alta di costrizione aortica)16.
La durata della fasciatura e lo scioglimento hanno un impatto significativo sulla fase della malattia e, quindi, sul recupero durante la RR. Allo stesso modo, la scelta del giusto tempismo per lo scioglimento è obbligatoria per adattarsi alla gravità della malattia prevista. I risultati osservati nel nostro studio sono in conformità con l'animale pre-esistenza11,21 e studi sull'uomo22, ad eccezione dell'ipertrofia dei cardiomiociti, dove alcuni studi hanno mostrato la sua normalizzazione10,21 e altri la sua regressione parziale23. Inoltre, studi hanno dimostrato che la regressione della fibrosi può verificarsi a lungo termine (70 mesi per i pazienti umani)24. I risultati sembrano dipendere dalla tecnica utilizzata per affrontare la fibrosi25. Recentemente, Treibel et al. Hanno descritto che la regressione della massa LV dopo l'AVR può essere guidata da 1) regressione della matrice da sola, dove il volume extracellulare si riduce; 2) regressione cellulare da sola, dove aumenta il volume extracellulare; 3) o da una regressione proporzionale nei compartimenti cellulari e matriciale, dove il volume extracellulare è invariato22. Questi autori hanno concluso che, dopo l'AVR, mentre la fibrosi diffusa e l'ipertrofia cellulare miocardica regredivano, la fibrosi focale non si risolve. Pertanto, la fibrosi interstiziale diffusa, valutata in base al volume della matrice, è un potenziale bersaglio terapeutico. Nel nostro studio, la riduzione della fibrosi sembra verificarsi entro 2 settimane dalla RR e prima della normalizzazione dell'ipertrofia dei cardiomiociti. Inoltre, sacrificare gli animali 2 settimane dopo lo scioglimento è stato il momento perfetto per ottenere la diversità ventricolare tra il gruppo DEB, vale a dire gli animali con persistenza della disfunzione diastolica (DEB-INCOM) e altri con completa inversione di massa LV e miglioramento della funzione diastolica (DEB-COM). Inoltre, non appena 2 settimane dopo lo scioglimento, abbiamo precedentemente mostrato significativi cambiamenti ventricolari destro nel gruppo di bande che si riprendono parzialmente dopo lo scioglimento26, mentre Bjornstad et al.
La procedura chirurgica di banding / scioglimento può essere eseguita anche nei ratti26, tuttavia, alcune differenze dovrebbero essere evidenziate. A causa delle sue dimensioni più grandi, i ratti hanno più strati muscolari rispetto ai topi che diminuiscono la visualizzazione aortica e ostacolano il posizionamento della legatura intorno all'aorta. D'altra parte, il rischio di danneggiare tessuti e organi adiacenti, come atri o polmoni, è ridotto al minimo. Per superare il problema dell'internalizzazione delle suture abbiamo usato una legatura in polipropilene più grande nei ratti per tenere stretto l'aorta (6.0 invece di 7.0 polipropilene).
A causa della manipolazione dell'aorta, la chirurgia di scioglimento potrebbe ridurre la produzione cardiaca imponendo un carico post-carico aggiuntivo sulla LV e quindi compromettere il sistema circolatorio e respiratorio. Rispetto ai topi, i ratti sembrano essere più resistenti al periodo anestetico più esteso e quindi sono più facili da mantenere controllati i parametri respiratori fisiologici durante il lungo intervento chirurgico di scioglimento. Nei ratti, lo sviluppo dell'ipertrofia LV è più veloce dei topi, ma ci vuole più tempo per progredire verso l'insufficienza cardiaca. Pertanto, l'intervento chirurgico di scioglimento può essere eseguito tra 5-9 settimane dopo la procedura di bande senza compromettere la frazione di espulsione26.
La principale limitazione del modello animale di bande /scioglimento è l'esigente abilità e tecnica microchirurgica dell'operatore, che di solito richiede una lunga curva di apprendimento per eseguire l'intervento chirurgico di scioglimento. Un'altra limitazione è l'impossibilità di eseguire un'emodinamica toracica ravvicinata nel topo e nel ratto, che sarà più fisiologica. Tuttavia, utilizzando questo metodo è obbligatorio inserire il catetere dall'arteria carotidea destra a LV che, in questo caso particolare, non è fattibile poiché negli animali fasciati l'aorta ascendente è ristretta prima dei rami carotide. Inoltre, nel mouse, non siamo stati in grado di misurare la contrattilità indipendente dal carico (ESPVR) e i parametri diastolici (pendenza dell'EDPVR) eseguendo la manovra di occlusione vena cava, un parametro importante per un'adeguata caratterizzazione della funzione miocardica. Abbiamo trovato questa manovra difficile da eseguire nei topi con costrizione aorta ascendente a causa delle loro piccole dimensioni (20-25g).
La futura applicazione del modello animale di fasciatura/scioglimento include lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici alle malattie del miocardio e la caratterizzazione delle vie che sono alla base del processo di rimodellamento della LV e RR.
In conclusione, questo modello clinicamente rilevante consente di caratterizzare temporalmente e meccanicamente la progressione verso HF, nonché il suo recupero poiché consente la raccolta di campioni miocardici in diverse fasi del rimodellamento miocardico e RR. Inoltre, si rivela un utile modello sperimentale per testare strategie terapeutiche volte al recupero del cuore che fallisce.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), l'Unione europea, quadro de referência estratégico nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) per il finanziamento dell'unità di ricerca UnIC (UID/IC/00051/2013). Questo progetto è sostenuto da FEDER attraverso COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), il progetto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), sostenuto dal programma operativo regionale Norte Portugal (NORTE 2020), nell'ambito dell'accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), il progetto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), sostenuto dai Fondi strutturali e di investimento europei, il programma operativo regionale di Lisbona 2020. Daniela Miranda-Silva e Patrícia Rodrigues sono finanziate da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) con borse di studio (SFRH/BD/87556/2012 e SFRH/BD/96026/2013 rispettivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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