Summary
Aquí se describe un protocolo paso a paso de la desbanding aorta quirúrgica en el modelo bien establecido de ratones de constricción aórtica. Este procedimiento no sólo permite estudiar los mecanismos que son la base del remodelado inverso del ventrículo izquierdo y la regresión de la hipertrofia, sino también probar nuevas opciones terapéuticas que podrían acelerar la recuperación miocárdica.
Abstract
Para comprender mejor la remodelación inversa (RR) del ventrículo izquierdo (VI), describimos un modelo de roedor en el que, después de la remodelación del VI inducida por bandas aórticas, los ratones se someten a RR tras la eliminación de la constricción aórtica. En este papel, describimos un procedimiento paso a paso para realizar una debanding aórtica quirúrgica como mínimo invasor en ratones. La ecocardiografía fue utilizada posteriormente para evaluar el grado de hipertrofia y disfunción cardíaca durante la remodelación del VI y el RR y para determinar el mejor momento para la desbandización aórtica. Al final del protocolo, se realizó una evaluación hemodinámica terminal de la función cardíaca y se recogieron muestras para estudios histológicos. Mostramos que la desbandificación está asociada a tasas de supervivencia quirúrgicas de 70-80%. Además, dos semanas después de la desbandificación, la reducción significativa de la poscarga ventricular desencadena la regresión de la hipertrofia ventricular (~20%) y fibrosis (~26%), recuperación de la disfunción diastólica evaluada por la normalización del llenado ventricular izquierdo y las presiones diastólicas finales (E/e' y LVEDP). La desbandización aórtica es un modelo experimental útil para estudiar el RR del VI en roedores. El grado de recuperación miocárdica es variable entre los sujetos, por lo tanto, imitando la diversidad de RR que ocurre en el contexto clínico, como el reemplazo de la válvula aórtica. Concluimos que el modelo aórtico de las bandas/de la debanding representa una herramienta valiosa para desentrañar penetraciones nuevas en los mecanismos del RR, a saber la regresión de la hipertrofia cardiaca y la recuperación de la disfunción diastólica.
Introduction
La constricción de la aorta transversal o ascendente en el ratón es un modelo experimental ampliamente utilizado para la hipertrofia cardíaca inducida por sobrecarga de presión, la disfunción diastólica y sistólica y la insuficiencia cardíaca1,2,3,4. La constricción aórtica conduce inicialmente a una hipertrofia concéntrica compensada del ventrículo izquierdo (VI) para normalizar el estrés de la pared1. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, como la sobrecarga cardíaca prolongada, esta hipertrofia es insuficiente para disminuir el estrés de la pared, desencadenando disfunción diastólica y sistólica (hipertrofia patológica)5. En paralelo, los cambios en la matriz extracelular (MECE) conducen a la deposición de colágeno y reticulado en un proceso conocido como fibrosis, que se puede subdividir en fibrosis de reemplazo y fibrosis reactiva. La fibrosis es, en la mayoría de los casos, irreversible y compromete la recuperación miocárdica después del alivio de la sobrecarga6,7. Sin embargo, estudios recientes de resonancia magnética cardíaca revelaron que la fibrosis reactiva es capaz de retroceder a largo plazo8. En conjunto, la fibrosis, la hipertrofia y la disfunción cardíaca son parte de un proceso conocido como remodelación miocárdica que progresa rápidamente hacia la insuficiencia cardíaca (IC).
La comprensión de las características de la remodelación miocárdica se ha convertido en un objetivo importante para limitar o revertir su progresión, esta última conocida como remodelación inversa (RR). El término RR incluye cualquier alteración miocárdica crónicamente revertida por una intervención dada, como la terapia farmacológica (p. ej., medicación antihipertensiva), la cirugía valvular (p. ej., estenosis aórtica) o los dispositivos de asistencia ventricular (p. ej., IC crónica). Sin embargo, el RR es a menudo incompleto debido a la hipertrofia predominante o a la disfunción sistólica/diastólica. Así, la clarificación de los mecanismos subyacentes del RR y de las estrategias terapéuticas nuevas todavía falta, que es sobre todo debido a la imposibilidad de acceder y de estudiar el tejido del miocardio humano durante rr en la mayor parte de estos pacientes.
Para superar esta limitación, los modelos de roedores han desempeñado un papel importante en el avance de nuestra comprensión de las vías de señalización involucradas en la progresión de la IC. En concreto, la desbandización aórtica de ratones con constricción aórtica representa un modelo útil para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la remodelación adversa del VI9 y RR10,11 ya que permite la recogida de muestras miocárdicas en diferentes momentos de estas dos fases. Además, proporciona un excelente entorno experimental para probar posibles objetivos novedosos que pueden promover /acelerar rr. Por ejemplo, en el contexto de la estenosis aórtica, este modelo podría proporcionar información sobre los mecanismos moleculares involucrados en la gran diversidad de la respuesta miocárdica subyacente a la (in)integridad del RR6,12,así como, el momento óptimo para el reemplazo valvular, lo que representa una deficiencia importante del conocimiento actual. De hecho, el momento óptimo para esta intervención es objeto de debate, principalmente porque se define en función de la magnitud de los gradientes aórticos. Varios estudios defienden que este punto de tiempo podría ser demasiado tarde para la recuperación miocárdica, ya que la fibrosis y la disfunción diastólica a menudo ya están presentes12.
A nuestro conocimiento, éste es el único modelo animal que recapitula el proceso de la remodelación del miocardio y del RR que ocurre en condiciones tales como estenosis aórtica o hipertensión antes y después del reemplazo de la válvula o el inicio de la medicación antihipertensiva, respectivamente.
Buscando abordar los desafíos resumidos anteriormente, describimos un modelo animal quirúrgico que se puede implementar tanto en ratones como en ratas, abordando las diferencias entre estas dos especies. Describimos los principales pasos y detalles involucrados en la realización de estas cirugías. Finalmente, relatamos los cambios más significativos que ocurrieron en el VI inmediatamente antes y a lo largo del RR.
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Protocol
Todos los experimentos con animales cumplen con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicación de los NIH nº 85-23, revisada en 2011) y la ley portuguesa sobre bienestar animal (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). Las autoridades locales competentes aprobaron este protocolo experimental (018833). Los ratones machos C57B1/J6 de siete semanas de edad se mantuvieron en jaulas apropiadas, con un ambiente regular de ciclo claro-oscuro de 12/12 h, una temperatura de 22 °C y un 60% de humedad con acceso al agua y una dieta estándar ad libitum.
1. Preparación del campo quirúrgico
- Desinfecte el sitio de la operación con un 70% de alcohol y coloque una cubierta de mesa de quirófano desechable sobre el área quirúrgica.
- Esterilice todos los instrumentos antes de la cirugía.
NOTA: Este procedimiento requiere tijeras micro quirúrgicas, 2 fórceps curvos finos, 3 fórceps rectos finos, un bisturí, pequeños fórceps, una tijera disectora en ángulo, un soporte de aguja, una ayuda de ligadura ultrafina, 2 hemóstatos y, por último, un sistema de retracción fijador magnético es muy recomendable (Figura 1A). - Curva la punta de una aguja embotada de 26 G a 90° para un acercamiento más fácil a la aorta. Una aguja de 26 G creará un estrechamiento aórtico de 0,45 mm de diámetro (Figura 1B).
- Ajuste la temperatura de la almohadilla térmica a 37 ± 0,1 °C.
2. Preparación e intubación de ratones
- Anestesiar ratones jóvenes C57B1/J6 (20-25 g) por inhalación de sevoflurano al 8% con 0,5 - 1,0 L/min 100%O2 en un tubo cónico.
- Compruebe la profundidad de la anestesia usando el reflejo de abstinencia del pellizco del dedo deldo deldo deldo del sistema.
- Coloque el ratón en la reclinación dorsal en una placa inclinada y proceda a la intubación orotraqueal.
- Mueva el ratón a la almohadilla térmica y conecte rápidamente el tubo orotraqueal al ventilador para iniciar la ventilación mecánica.
- Ajuste los parámetros del ventilador a una frecuencia de 160 respiraciones/min y un volumen corriente de 10 mL/kg.
3. Preparación para la cirugía (tanto para cirugías de anillamiento como de desbandificación)
- Afeitarse y aplicar la crema depilatoria desde el escote hasta la mitad del pecho de los ratones.
- Aplique gel oftálmico en los ojos de los animales para evitar que se seque la córnea.
- Coloque una sonda rectal y el oxímetro en la pata o la cola para controlar la temperatura y la oxigenación de la sangre, y la frecuencia cardíaca, respectivamente.
NOTA: La anestesia induce hipotermia significativa, por lo tanto, es importante mantener la temperatura corporal normal durante la cirugía para evitar una rápida disminución de la frecuencia cardíaca. - Mantener la anestesia con sevoflurano (2.0 - 3.0%). Compruebe el nivel correcto de anestesia por la falta del reflejo de dedo del dedo deldo deldo del usuario.
- Coloque los ratones en decúbito lateral derecho sobre una almohadilla térmica y asegure las extremidades al sistema de retracción del fijador magnético con una cinta adhesiva para mantener al animal en la posición correcta durante la cirugía(Figura 2, Figura 3A).
- Desinfecte el pecho del ratón con alcohol al 70% seguido de una solución de providona yodada.
4. Cirugía de bandas aórticas ascendentes
NOTA: Para una descripción detallada del protocolo, consulte 2,3,4,13.
- Con una cuchilla desechable, realice una pequeña (~ 0.5 cm) incisión en la piel en el lado izquierdo inmediatamente debajo del nivel de axila y diseccione la piel.
- Diseccione y separe suavemente el músculo pectoral y otras capas musculares hasta que las costillas se vuelvan visibles. Use pórceps finos y evite cortar el músculo.
- Bajo un microscopio, identifique los espacios intercostales y abra una pequeña incisión entre el2º y3º espacio intercostal con pórceps finos.
- Retraer las costillas colocando el retractor torácico (Figura 2A).
- Use pequeños fórceps para diseccionar suavemente y separar los lóbulos tímicos hasta que la aorta ascendente se vuelva visible.
NOTA: Los aplicadores de algodón deben ser útiles en caso de sangrado. La solución salina estéril caliente debe administrarse por vía subcutánea en caso de sangrado significativo (por ejemplo, la arteria mamaria). - Use pequeños pórceps para diseccionar suavemente la aorta.
NOTA: Se considera que la aorta está diseccionada cuando no hay grasa u otras adherencias a su alrededor y es posible rodear fácilmente el vaso con una pequeña curva de fórceps. - Después de la disección aórtica, coloque una ligadura de polipropileno 7-0 alrededor de la aorta mediante el uso de ayuda de ligadura y fórceps curvos(Figura 2B).
- Coloque la aguja embotada de 26 G paralela a la aorta (punta apuntando hacia la cabeza de los ratones) (Figura 2B). Para los ratones que pesan 20-25 g, esta aguja induce una constricción aórtica reproducible del 65-70%.
- Hacer 2 nudos sueltos alrededor de la aorta y la aguja de 26 G con la ayuda de 2 fórceps (Figura 2B).
- Apriete el1º nudo y, rápidamente después, el2º nudo. Confirme brevemente el posicionamiento correcto de la constricción y retire rápidamente la aguja para restaurar el flujo sanguíneo aórtico. Finalmente, haz un nudo3 rd (grupo BA).
- Reposicionar el timo y los músculos en su posición inicial.
- Realice el procedimiento simulado idéntico al procedimiento de constricción, pero manteniendo la sutura suelta alrededor de la aorta (grupo SHAM).
- Cortar los extremos de la sutura y retirar el retractor torácico.
NOTA: Los extremos cortos de la sutura pueden aumentar la probabilidad de que los nudos se aflojen con la presión aórtica, mientras que los extremos largos hacen que el procedimiento de desbanding sea más riesgoso ya que pueden producirse adherencias entre la sutura y la aurícula izquierda. - Cierre la pared torácica usando la sutura de polipropileno 6-0 con una simple sutura interrumpida o continua utilizando el menor número posible de puntos de sutura. Apriete el último nudo torácico con los pulmones inflados al final de la inspiración al pellizcar la salida del ventilador durante 2s para volver a inflar los pulmones.
- Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continua.
NOTAS: Si se utiliza un ventilador más reciente, es posible programarlo para que se detenga en inspiración (Setup-Advanced-Pause-Inspiration)
5. Atención postoperatoria
- Aplique la solución de providona-yodo en el sitio de la sutura de la piel.
- Para una analgesia adecuada, administrar buprenorfina por vía subcutánea 0,1 mg/kg, dos veces al día, hasta que el animal se recupere por completo (generalmente 2-3 días después de la cirugía).
- Inyecte solución salina estéril por vía intraperitoneal para prevenir la deshidratación en caso de sangrado significativo durante la cirugía.
- Apague la anestesia (sin desintubar el ratón) y espere hasta que el animal recupere los reflejos (los movimientos de los bigotes son una señal de despertar) y comience a respirar espontáneamente.
- Retire la cánula traqueal.
- Dejar que el animal se recupere en una incubadora a 37 °C.
- Devuelva al animal a una sala de ciclo claro/oscuro de 12 h después de la recuperación completa.
6. Cirugía de desbanding aórtico
- Siete semanas más adelante, realice la desbanding de la aorta por la mitad de los animales del BA y quite la sutura floja de la mitad de los ratones del IMPOSTOR, dando lugar a 2 nuevos grupos -- debanding (DEB) y debanding SHAMA (DESHAM), respectivamente. DESHAM representa el control para el grupo DEB (Figura 4).
- Repita todos los pasos 2.1 a 3.6 mencionados anteriormente.
- Diseccione suavemente los tejidos, las adherencias y la fibrosis alrededor de la aorta hasta que su constricción se haga visible.
- Diseccione cuidadosamente la aorta y separe la sutura de la aorta. Corte la sutura con tijeras de resorte angulosas de una sonda (Figura 3B).
- Cierre la pared torácica usando 6-0 sutura de polipropileno con una simple sutura interrumpida o continua usando el mínimo número de puntos de sutura posibles.
NOTA: Trate de apretar la última sutura torácica cuando los pulmones estén inflados para evitar el neumotórax. - Cierre la piel con una sutura de seda/polipropileno 6-0 en un patrón de sutura continua.
- Realice todos los procedimientos de atención postoperatoria como se menciona en 5.
- Sacrificar los animales 2 semanas después.
7. Ecocardiografía para evaluar la función cardíaca y la hipertrofia ventricular izquierda in vivo
- Realizar el examen ecocardiográfico cada 2-3 semanas para seguir la progresión de la hipertrofia y la función cardíaca.
- Anestesiar a los animales, como se describe, por inhalación de sevoflurano al 5% con un cono de la nariz. Ajustar el nivel de anestesia disminuyándolo a 2.5%.
- Afeitarse y aplicar la crema depilatoria desde el escote hasta la mitad del pecho.
- Coloque el animal en una almohadilla térmica y coloque los electrodos de ECG. Asegure un buen rastro de ECG y mantenga el ritmo cardíaco entre 300 y 350 latidos/min.
- Controle la temperatura (~ 37 °C).
- Aplique el gel de eco y coloque al animal en el decúbito lateral izquierdo.
- Inicie el ecocardiógrafo y ajuste la configuración.
- Coloque una sonda de ultrasonido sobre el tórax.
- Evaluar el gradiente de presión a través de las bandas a las 7 y 2 semanas después de la cirugía de bandas y desbandificación, respectivamente. Coloque la sonda en el eje largo del VI y coloque el haz sobre la aorta. Pulse el botón PW para activar la ecocardiografía Doppler de onda pulsada. Después de siete semanas de anillamiento, los gradientes aórticos serán de >25 mmHg en los animales anillados.
- Registre imágenes guiadas bidimensionales de aorta que muestren la presencia o ausencia de la constricción de la aorta ascendente para visualizar anatómicamente la eficacia de las bandas y la desbandificación.
NOTA: Es posible visualizar el flujo turbulento en el nivel de constricción si el modo de color está disponible. - Evaluar la hipertrofia posicionando la sonda en un eje corto del VI, a nivel de los músculos papilares, y pulsar el trazado en modo M para visualizar la pared anterior del VI (DDVI), el diámetro del VI (DVI) y la pared posterior del VI (LVPW) en la diástole (D) y la sístole (S)(Figura 5).
- Evaluar la función sistólica, calcular la fracción de eyección y el acortamiento fraccionario como se describió anteriormente14,15.
- Evaluar la función diastólica por 1) determinar el pico de Doppler de onda pulsada de la velocidad de flujo mitral temprano y tardío (ondas E y A, respectivamente) utilizando una vista apical de 4 cámaras apicales justo encima de las valvas mitrales; 2) registro de las velocidades diastólicas tempranas (E') y sistólicas máximas (S') del miocardio anular mitral lateral utilizando la TDI pulsada y la vista apical de 4 cámaras apicales(Figura 5).
- Registre al menos tres latidos consecutivos en cada evaluación de parámetros. Estos valores se promediarán posteriormente.
8. Evaluación hemodinámica
- Al final del protocolo(Figura 4),realizar la ecocardiografía final, como se describe en 7, antes de la evaluación hemodinámica terminal.
- Repita los pasos 2.1 a 3.6.
- Cannulate la vena yugular derecha y perfunde solución salina estéril a 64 mL/kg/h.
- Gire ligeramente el animal hacia el lado izquierdo y haga una incisión en la piel a nivel del apéndice xifoideo.
- Separe la piel del músculo con las esrórceps o con una tijera.
- Haga una incisión lateral entre las costillas izquierdas a nivel del apéndice xifoides.
- Realice una toracotomía lateral izquierda para exponer el corazón completamente.
NOTA: Para evitar sangrado y daño pulmonar, inserte un hisopo de algodón en la cavidad torácica y empuje el pulmón suavemente mientras inserta dos hemóstatos en el lado derecho e izquierdo del lugar a cortar. - Precalentar los catéteres de asa P-V en un baño de agua a 37 °C.
- Calibrar el catéter (configuración, ajuste del canal, eligió el canal correcto para la presión y el volumen, unidades).
- Inserte un catéter de forma apical en el VI y asegúrese de que los sensores de volumen estén colocados entre la válvula aórtica y el ápice. Los volúmenes pueden ser evaluados por ecocardiografía (Figura 5). La visualización de los bucles presión-volumen ayuda a confirmar el posicionamiento correcto del catéter (Figura 6).
- Permita que el animal se estabilice 20-30 min sin cambios significativos en la forma de los bucles de presión-volumen.
- Con la ventilación suspendida al final de la expiración, adquirir registros de referencia (Figura 6). Adquirir continuamente datos a 1.000 Hz para ser posteriormente analizados fuera de línea por el software adecuado.
- Calcular la conductancia paralela después del bolo salino hipertónico (10%, 10 μL).
- Mientras está anestesiado, sacrifique al animal por exsanguinación, recoja y centrifue la sangre.
- Por último, extirpar y recoger el corazón. Peso el corazón, el ventrículo izquierdo y derecho por separado y almacene inmediatamente las muestras en nitrógeno líquido o formalina para estudios moleculares o histológicos posteriores, respectivamente.
9. Procedimiento de bandas/desbandamiento aórtico en ratas
- Realizar bandas aórticas en Wistar joven (70-90 g) utilizando una aguja de 22 G y ligadura de polipropileno 6-0 para constreñir la aorta.
- Asegurar un adecuado procedimientos anestésicos y analgésicos con 3-4% de sevoflurano y 0,05 mg/kg de buprenorfina, respectivamente.
- Durante la ecocardiografía, asegurar una frecuencia cardíaca siempre por encima de 300 tasa / min (idealmente entre 300 y 350).
- Antes del paso 8.9, diseccione suavemente la aorta de rata, coloque una sonda de flujo alrededor de ella para medir el gasto cardíaco. El uso de la sonda de flujo aórtico es el procedimiento estándar de oro para las ratas.
- Para la evaluación hemodinámica, cannulate la vena yugular o femoral para la administración de líquido (32 mL/kg/h).
- Reemplace el catéter de presión-volumen SPR-1035 por el SPR-847 o SPR-838, cuyos tamaños se adaptan mejor a las dimensiones ventriculares de rata.
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Representative Results
Supervivencia postoperatoria y tardía
La supervivencia perioperatoria del procedimiento de anillamiento es del 80% y la mortalidad durante el primer mes suele ser de <20%. Como se mencionó anteriormente, el éxito de la cirugía de desbandificación depende en gran medida de cuán invasiva fue la cirugía anterior. Después de una curva de aprendizaje, la tasa de mortalidad durante los procedimientos de desbandificación es de alrededor del 25%. Para esta mortalidad se contabilizan principalmente las muertes durante el procedimiento quirúrgico, incluyendo la aorta o la ruptura de la aurícula izquierda (en ratas, la tasa de supervivencia es mayor en ambos procedimientos quirúrgicos).
Bandas aórticas y remodelación miocárdica
El éxito de la constricción aórtica fue verificado por el aumento de la presión sistólica final del VI (PEVI) y por velocidades de flujo aórtico Doppler >2,5 m/s, lo que corresponde a un gradiente de presión de 25 mmHg utilizando la ecuación de Bernoulli modificada (Figura 5). En comparación con los ratones SHAM, las bandas indujeron la hipertrofia del VI evaluada por el aumento de la masa del VI(Tabla 1 y Figura 5)y la alteración de la función diastólica evidente por presiones de llenado más altas (relación de la velocidad máxima mitral del llenado temprano (E) a la velocidad anular mitral diastólica temprana (E'), (E/e'), y la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (LVEDP) y la relajación prolongada (t, Tabla 1, Figura 5y Figura 6)dentro de las 7 semanas. La fracción de la eyección todavía fue preservada en esta etapa de la enfermedad.
Histológicamente, siete semanas de bandas aórticas indujeron hipertrofia y fibrosis cardiomiocitos significativas(Figura 7).
Desbanding aórtico y remodelación inversa miocárdica
En ratones sometidos a desbandificación, se verificó la eliminación exitosa de la estenosis aórtica mediante velocidades doppler de eco(Tabla 1 y Figura 5). En general, la desbandización promovió una disminución significativa de la poscarga (disminución de la PVI) y la hipertrofia del VI (evaluada por morfometría, ecocardiografía e histología). Por otra parte, se observó la normalización de la función diastólica y las velocidades aórticas(Tabla 1, Figura 5, Figura 6,y Figura 7).
Tabla 1: Alteraciones morfofuncionales del ventrículo izquierdo evaluadas por ecocardiografía y por hemodinámica.
| Pasos críticos | consejo |
| Invasividad de la cirugía de bandas |
Es importante evitar: ● oclusión prolongada de la aorta ascendente durante la ligadura, lo que puede conducir a edema pulmonar y activación de vías inflamatorias capaces de influir en el fenotipo y la gravedad de la enfermedad15 ● sangrado de la arteria mamaria que, si no se elude oportunamente, puede conducir a una disminución de la presión arterial y promover mayores cantidades de fibrosis al volver a abrir el tórax (desbandificación); ● dañar la pleura de ratones y los pulmones; Mini toracotomía lateral izquierda para anillamiento y desbandamiento (mismo lugar; presente estudio) vs toracotomía lateral izquierda para el anillamiento y esternotomía para la cirugía de desbandificación11: ● el primero es menos invasivo y tiene un tiempo de recuperación corto, lo que mejora el éxito de la hemodinámica de pecho abierto realizada dos semanas después. Sin embargo, el uso de la misma posición para volver a abrir el pecho puede aumentar el número de complicaciones debido a las adherencias (alrededor de la aurícula izquierda, arteria pulmonar, etc.). Superar este problema por tener extracarefull durante el procedimiento de anillamiento. |
| Internalización de la sutura |
Se puede prevenir mediante el uso de: ● dos suturas de bandas una al lado de la otra16; ● seda en lugar de polipropileno11; ● clips de titanio o una o-anillos alrededor de la aorta para inducir su constricción21; ● double loop-clip thecnique15; ● manguito inflable para realizar bandas aórticas supracoronarias22. |
| Parámetros fisiológicos |
Durante la cirugía es importante monitorear: ● frecuencia cardíaca; ● oxigenación de la sangre, manteniéndola por encima del 90% (especialmente durante la manupilación de la aorta); ● anestesia, manteniéndolo en la dosis más baja posible sin infligir molestias al animal. |
Tabla 2: Pasos críticos del protocolo.
Figura 1: Instrumentos quirúrgicos ultra finos utilizados para los procedimientos de anillamiento y desbandificación. (A)2 porta agujas y una hoja de bisturí; 2 catéteres para intubación de ratones y una tijera; un bisturí, 2 fórceps curvos, una ayuda de ligadura, una tijera microquirúrgica, 3 fórceps rectos; (B)y 26G-aguja y embotado 26G-aguja curvado para adaptarse a los ratones pequeños abertura torácica correctamente. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Procedimiento de bandas aórticas. (A) La aproximación torácica a la aorta ascendente realizada con la ayuda de un sistema de retracción del fijador magnético (3 retractores son visibles). (B)La aorta ascendente está claramente diseccionada y visible. La aguja embotada y la sutura de polipropileno 6-0 se colocan en la posición correcta para realizar las bandas aórticas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Procedimiento de desbanding aórtico. (A) El ratón se coloca en un sistema de retracción magnética, lo que representa una herramienta útil para retraer los músculos y tejidos. El ratón se intuba para la ventilación mecánica. Una sonda rectal controla la temperatura y se coloca un oxímetro en la pata derecha de los ratones para monitorear la oxigenación de la sangre durante la cirugía. La fibrosis y el tejido adherente se eliminan cuidadosamente alrededor de la aorta y la sutura, para poder cortar la sutura(B)y(C). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4:Diseño de protocolo experimental para ratones. La remodelación miocárdica (rojo) y la remodelación inversa (verde) se muestran en la parte inferior junto con todas las tareas de evaluación. Cabe destacar que la cirugía de desbandificación puede dar lugar a dos grupos de animales con distintos grados de remodelación inversa. Así, obtuvimos DEB ratón con recuperación miocárdica completa (DEB-COMP) e incompleta (DEB-INCOM). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 5:Evaluación ecocardiográfica de la estructura y función cardíaca. (A) Velocidadesdel flujo aórtico; (B)Masa del VI; (C)Dimensiones ventriculares (diámetro del VI, DVI) y espesor de la pared (pared posterior del VI, LVPW y pared anterior del VI, DDVI); (D)Flujo transmitral (pico de la onda Doppler de pulso de la velocidad del flujo mitral tardío, A, y pico de la onda Doppler pulsada de la velocidad del flujo mitral temprano, E) y(E)Velocidades mitrales mitrales del tejido (velocidad diastólica tardía del tejido anular mitral, A'; velocidad diastólica temprana del tejido anular mitral, E' y velocidad del tejido anular mitral sistólico, S'). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 6:Bucles de presión-volumen representativos para los grupos SHAM, BA y DEB. Los datos fueron adquiridos continuamente a 1000 Hz y posteriormente analizados fuera de línea por el software PVAN. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 7:Hipertrofia miocárdica y fibrosis evaluada histológicamente. (A)Hipertrofia del ventrículo izquierdo evaluada por cardiomiocitos área seccional de las secciones teñidas de hematoxilina-eosina (HE) (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 14) y grupo DEB (n = 12). (B)Fibrosis intersticial del ventrículo izquierdo e imágenes representativas de secciones rojas teñidas de Sirio (5 μm) de SHAM (n = 17), BA (n = 13) y DEB (n = 12). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
El modelo aquí propuesto imita el proceso de remodelación del VI y RR después de las bandas aórticas y la desbandización, respectivamente. Por lo tanto, representa un excelente modelo experimental para avanzar en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares implicados en la remodelación adversa del VI y para probar nuevas estrategias terapéuticas capaces de inducir la recuperación miocárdica de estos pacientes. Este protocolo detalla los pasos sobre cómo crear un modelo animal de roedor de bandas aórticas y desbanding con una técnica quirúrgica mínimamente invasiva y altamente conservadora para reducir el trauma quirúrgico.
El paso más crítico del protocolo está relacionado con el grado de agresión quirúrgica durante las bandas aórticas. El éxito de la cirugía de desbanding aórtico posterior depende enormemente de un procedimiento de anillamiento mínimamente invasivo que evite la agresión tisular y la fibrosis alrededor de la aorta y, por lo tanto, es obligatorio un abordaje menos invasivo (Tabla 2). La internalización de la sutura se asocia con menos hipertrofia del VI y una mejor función cardíaca16 (Tabla 2)y hace que el procedimiento de desbanding sea imposible de realizar sin causar una ruptura aórtica. En el presente estudio, tratamos de utilizar seda, ya que crea más tejido cicatricial en el sitio de anillamiento, desencadenando un grado más estable de sobrecarga de presión. Sin embargo, en nuestras manos, la cirugía de desbanding fue más exigente cuando se utilizó seda ya que es un alambre multifilamento que hace que su eliminación total de la aorta sea más difícil. Sin embargo, se trata de cuestiones técnicas que son ampliamente dependientes del protocolo y del operador, y estas variaciones, tipo de sutura, no es incompatible con las buenas prácticas técnicas y los resultados reproductivos. La monitorización de los parámetros fisiológicos durante el anillamiento y especialmente durante la desbandificación es obligatoria para el éxito de la implementación del modelo (Tabla 2).
En 1991, Rockman et al., describieron la constricción de aorta transversal (TAC) en ratón por primera vez4. Desde entonces una cantidad considerable de papeles salieron proporcionando numerosas versiones de este procedimiento con variaciones con respecto a la edad/tamaño del animal17,el fondo genético de los ratones18,el diámetro de la aguja/constricción19,el material utilizado para las bandas, la localización aórtica de las bandas, la duración de la anillamiento19 y la desbandación11. Todas estas alternativas metodológicas son válidas siempre y cuando cumplan con los objetivos de cada estudio. Sin embargo, debemos destacar que la progresión de la enfermedad hacia la insuficiencia cardíaca es más rápida y por lo tanto el RR es más incompleto al seleccionar: 1) duraciones de bandas más largas, 2) más pesados/mayores los ratones20 y 3) menor diámetro de aguja utilizado para la constricción aórtica (mayor porcentaje de constricción aórtica)16.
La duración de las bandas y la desbandificación afectan significativamente la etapa de la enfermedad y, por lo tanto, la recuperación durante el RR. Del mismo modo, la elección del momento adecuado para la desbandificación es obligatoria para ajustarse a la gravedad de la enfermedad prevista. Los resultados observados en nuestro estudio están de acuerdo con la preexistencia animal11,21 y los estudios en humanos22,a excepción de la hipertrofia de cardiomiocitos, donde algunos estudios mostraron su normalización10,21 y otros su regresión parcial23. Por otra parte, los estudios han demostrado que, la regresión de la fibrosis puede ocurrir a largo plazo (70 meses para los pacientes humanos)24. Los resultados parecen depender de la técnica utilizada para abordar la fibrosis25. Recientemente, Treibel et al. fueron capaces de diferenciar entre compartimentos celulares (miocitos, fibroblastos, endoteliales, glóbulos rojos) y extracelulares (ECM, plasma sanguíneo) en pacientes con estenosis aórtica después de la sustitución de válvula aórtica (AVR) mediante resonancia magnética cardiovascular con mapeo T122. Se describieron que la regresión de la masa del VI después de la AVR puede ser impulsada por 1) regresión matricial sola, donde el volumen extracelular se reduce; 2) regresión celular sola, donde aumenta el volumen extracelular; 3) o por una regresión proporcional en compartimentos celulares y matriciales, donde el volumen extracelular no ha cambiado22. Estos autores concluyeron que, después de AVR, mientras que la fibrosis difusa y la hipertrofia celular del miocardio regresan, la fibrosis focal no resuelve. Así, la fibrosis intersticial difusa, según lo evaluado por el volumen de la matriz, es una blanco terapéutica potencial. En nuestro estudio, la reducción de la fibrosis parece ocurrir dentro de las 2 semanas de RR y antes de la normalización de la hipertrofia de los cardiomiocitos. Además, el sacrificio de los animales 2 semanas después de la desbandificación fue el momento perfecto para obtener la diversidad ventricular entre el grupo DEB, a saber, los animales con persistencia de disfunción diastólica (DEB-INCOM) y otros con reversión completa de la masa del VI y mejora de la función diastólica (DEB-COM). Por otra parte, tan pronto como 2 semanas después de la desbandificación, hemos mostrado previamente cambios significativos en el ventrículo derecho en el grupo de bandas que se recuperan parcialmente después de la disolución26,mientras que Bjornstad et al. relatan la normalización de la expresión de genes fetales, indicativos de remodelación miocárdica dentro del mismo período de tiempo11.
El procedimiento quirúrgico de anillamiento/desbandamiento también se puede realizar en ratas26,sin embargo, algunas diferencias deben ser destacadas. Debido a su mayor tamaño, las ratas tienen más capas musculares que los ratones, lo que disminuye la visualización aórtica y dificulta la colocación de la ligadura alrededor de la aorta. Por otro lado, se minimiza el riesgo de dañar los tejidos y órganos adyacentes, como las aurículas o los pulmones. Para superar la cuestión de la internalización de la sutura utilizamos una ligadura de polipropileno más grande en ratas para mantener firmemente la aorta (6,0 en lugar de 7,0 polipropileno).
Debido a la manipulación de la aorta, la cirugía de desbandificación podría disminuir el gasto cardíaco al imponer una poscarga adicional en el VI y, por lo tanto, afectar el sistema circulatorio y respiratorio. En comparación con los ratones, las ratas parecen ser más resistentes a un período anestésico más prolongado y, por lo tanto, son más fáciles de mantener los parámetros respiratorios fisiológicos controlados durante la cirugía de desbanding largo. En ratas, el desarrollo de la hipertrofia del VI es más rápido que los ratones, pero tarda más en progresar a la insuficiencia cardíaca. Por lo tanto, la cirugía de desbandificación se puede hacer entre 5-9 semanas después del procedimiento de anillamiento sin comprometer la fracción de eyección26.
La principal limitación del modelo animal de anillamiento/desbandificación es la exigente técnica y habilidades microquirúrgicas del operador, que generalmente requieren una larga curva de aprendizaje para realizar la cirugía de desbandificación. Otra limitación es la imposibilidad de realizar hemodinámica torácica cerrada en ratón y rata, que será más fisiológica. Sin embargo, mediante el uso de este método es obligatorio insertar el catéter desde la arteria carótida derecha hasta el VI lo cual, en este caso particular, no es factible ya que en los animales de anillamiento la aorta ascendente se contrae antes de las ramas carótidas. Por otra parte, en ratón, no pudimos medir la contractilidad independiente de la carga (ESPVR) y los parámetros diastólicos (pendiente de la EDPVR) mediante la realización de la maniobra de oclusión de la vena cava, un parámetro importante para una adecuada caracterización de la función miocárdica. Encontramos esta maniobra difícil de realizar en ratones con constricción de aorta ascendente debido a su pequeño tamaño (20-25g).
La aplicación futura del modelo animal de bandas/desbanding incluye el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos de las enfermedades miocárdicas y la caracterización de las vías que subyacen al proceso de remodelación del VI y RR.
En conclusión, este modelo clínicamente relevante permite caracterizar temporal y mecánicamente la progresión hacia la IC, así como su recuperación, ya que permite la recolección de muestras miocárdicas en diferentes etapas de remodelación miocárdica y RR. Además, demuestra ser un modelo experimental útil para probar estrategias terapéuticas dirigidas a la recuperación del corazón que falla.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT), la Unión Europea, el Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), el Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) y el Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) por financiar la unidad de investigación unIC (UID/IC/00051/2013). Este proyecto cuenta con el apoyo de FEDER a través de COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), el proyecto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoyado por el programa operativo regional Norte Portugal (NORTE 2020), en el marco del acuerdo de asociación Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), el proyecto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoyado por los Fondos Estructurales y de Inversión Europeos, el programa operativo regional de Lisboa 2020. Daniela Miranda-Silva y Patrícia Rodrigues son financiadas por la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) mediante becas (SFRH/BD/87556/2012 y SFRH/BD/96026/2013 respectivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Spears | F.S.T | 18105-03 | To absorb fluids during the surgery |
| Blades | F.S.T | 10011-00 | To perform the skin incision |
| Buprenorphine | Buprelieve | Analgesia drug | |
| Catutery | F.S.T | 18010-00 | To prevent exsanguination |
| Catutery tips | F.S.T | 18010-01 | To prevent exsanguination |
| cotton swab | Johnson's | To absorb fluids during the surgery | |
| Depilatory cream | Veet | To delipate the animal | |
| Disposable operating room table cover | MEDKINE | DYND4030SB | To cover the surgical area |
| Echo probe | Siemens | Sequoia 15L8W | Ultrasound signal aquisition |
| Echocardiograph | Siemens | Acuson Sequoia C512 | Ultrasound signal aquisition |
| End-tidal CO2 monitor | Kent Scientific | CapnoStat | To control expiration gas saturation |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11255-20 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11272-30 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11151-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Forcep/Tweezers | F.S.T | 11152-10 | To dissect the tissues and aorta |
| Gas system | Penlon Sigma Delta | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Hemostats | F.S.T | 13010-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Hemostats | F.S.T | 13011-12 | To hold the suture before tight the aorta |
| Ligation aids | F.S.T | 18062-12 | To place a suture around the aorta |
| Magnetic retractor | F.S.T | 18200-20 | To help keep the animal in a proper position |
| Needle holder | F.S.T | 12503-15 | To suture the animal |
| Needle 26G | B-BRAUN | 4665457 | To serve as a molde of aortic constriction diameter |
| Oxygen | Air Liquide | To anesthesia and mechanical ventilation | |
| Polipropilene suture | Vycril | W8304/W8597 | To suture the animal and to do the constriction |
| Povidone-iodine solution | Betadine® | Skin antiseptic | |
| PowerLab | Millar instruments | ML880 PowerLab 16/30 | PV loop Signal Aquisition |
| Pulse oximeter | Kent Scientific | MouseStat | To control heart rate and blood saturation |
| PVAN software | Millar Instruments | To analyse the haemodynamic data | |
| PV loop cathether | Millar instruments | SPR-1035. 1.4 F | PV loop Signal Aquisition |
| Retractor | F.S.T | 17000-01 | To provide a better overview of the aorta |
| Scalpet handle | F.S.T | 10003-12 | To perform the skin incision |
| Scissors | F.S.T | 15070-08 | To cut the suture in debanding surgery |
| Scissors | F.S.T | 14084-09 | To cut other material during the surgery e.g. suture, papper |
| Sevoflurane | Baxter | 533-CA2L9117 | |
| Temperature control module | Kent Scientific | RightTemp | To control animal corporal temperature |
| Ventilator | Kent Scientific | PhysioSuite | To ventilate the animal |
| Water-bath | Thermo Scientific™ | TSGP02 | To maintain water temperature adequate to heat the P-V loop catethers |
References
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