Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/60043
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

Summary

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

Abstract

הדלקת צהבת B וירוס (HBV) היא בעיה בריאותית גלובלית. עם מעל 350,000,000 אנשים מושפעים ברחבי העולם, זיהום HBV נשאר הגורם המוביל של סרטן הכבד. זוהי דאגה גדולה, במיוחד במדינות מתפתחות. כישלון של מערכת החיסון לטעון תגובה יעילה נגד HBV מוביל לזיהום כרוני. למרות חיסון HBV נוכח ותרופות אנטי ויראליות הרומן נוצרות, מיגור של תאים מאגר הווירוסים נשאר נושא בריאות מרכזי. מתוארים כאן היא שיטה עבור הדור של אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי CD8+ ציטוטוקסיים T לימפוציטים (ctls) נגזר בתאי גזע המושרה pluripotent (iPSCs) (כלומר, ipsc-ctls), אשר יש את היכולת לדכא את שכפול hbv. שכפול HBV הוא המושרה ביעילות בעכברים באמצעות הזרקה הידרודינמית של ביטוי HBV ביטויים, pAAV/HBV 1.2, לתוך הכבד. לאחר מכן, HBV לפני השטח של העכבר הספציפי Ag-iPSC-CTLs הועברו באופן מאמצים, אשר מדכא במידה ניכרת שכפול HBV בכבד ודם, כמו גם מונע ביטוי השטח HBV Ag החרופציטים. שיטה זו מדגימה שכפול HBV בעכברים לאחר הזרקת הידרודינמית והגזע הנגזר של תאים מבוססי Ag האנטי-ויראלי מאפשר לדכא שכפול HBV. פרוטוקול זה מספק שיטה שימושית לטיפול חיסוני HBV.

Introduction

בעקבות זיהום אקוטי, מערכת החיסון האדפטיבית (כלומר, חסינות מוסרית ותאית) שולטת בכמויות הכבד הקשורות ל-HBV. עדיין, מספר אנשים באזורים HBV-אנדמיים לא יכולים לחסל את וירוסים ולאחר מכן להמיר כאנשים כרוניים. יותר מ -25% של חולים כרוניים (> 250 מיליון אנשים) ברחבי העולם לפתח מחלת כבד מתקדמת, וכתוצאה מכך שחמת הכבד ו/או קרצינומה hepatocellular (HCC)1. כתוצאה מכך, מיגור של תאים נגועים בעקשנות נשאר בעיה כללית הבריאות, אף על פי שיש חיסון זמין2 ותרופות אנטי ויראליות רבים נמצאים בשלבי פיתוח. טיפול סטנדרטי עבור זיהום HBV כולל IFN-α, נוקלאוטיד, ונוקלאוטידים אנגיים. לסוכנים אלה יש פעילות אנטי-ויראלית. ישירה ומודולקקים חיסוניים עם זאת, המרה של אנטיגן HBe (Ag)+ מנשאים עם נוגדן נגד Hbe (Ab) ואובדן של סרום hbe deoxyribonucleic חומצה (DNA) להופיע בנפרד כ 20% של חולים מטופלים, ואת כל השליטה החיסונית של הנגיף אומת על ידי מניעת HBsAg הוא לא יותר 5%3. יתר על כן, התגובה לטיפול הוא לעתים קרובות לא עמיד. חיסון נגד רקומביננטי HBs Ag הוא יעיל מאוד במניעת זיהום, אבל החיסון HBs Ag טיפולית אינה יעילה. ברור, תא T בתיווך התגובות החיסונית לשחק תפקיד קריטי בשליטה הזיהום HBV ליקוי בכבד; עם זאת, בחולים כרוניים צהבת, hbv-מגיבים תאים T נמחקים לעתים קרובות, לקוי, או להמיר4,5,6. כתוצאה מכך, אצל אנשים עם זיהום HBV מתמשך, אין ניסיונות לשחזר את החסינות הספציפית HBV (כלומר, החסינות המבוססת על תא T) באמצעות תרופה אנטי ויראלית, ציטוקינים מאפקקים, או חיסון מרפא השיגו הצלחה.

העברת תא המאמצת (פעולה) של תאים T ספציפיים של hbv Ag הוא טיפול יעיל בבימויו של בסופו של דבר לבער את הנותרים hepatocytes wih7,8. פעולה של hbv-ctls ספציפי לתוך העכברים הנגועים hbv הוכח לגרום ארעי, הפטיטיס מתון, וירידה דרמטית של חומצה hbv ריבונוקלאית (RNA) התעתיקים ב hepatocytes. במחקרים אלה, CTLs לא לעכב את שעתוק הגנים HBV אבל הגדילו את השפלה של התעתיקים HBV9. ה-CTLs הספציפי של HBV חשוב למנוע זיהום נגיפי ולתווך את הסיווג של HBV10,11. עבור תרופות מבוססות מעשה, בהרחבת מבחנה של תאים T הספציפי hbv עם פעילות מחודשת גבוהה עבור vivo החדש הוצע להיות שיטה אידיאלית12,13,14; אף על פי כן, הגישות הקיימות מוגבלות לגבי יכולותיהם להפקת, להפריד ולגדול כמויות ואיכויות המתאימות של תאים T HBV ספציפיים מחולים עבור טיפולים פוטנציאליים.

למרות ניסויים קליניים הנוכחי בטיחות, יכולת מעשית, ופעילות טיפולית פוטנציאליים של טיפולים מבוססי תאים באמצעות תאי T מהונדסים הינם ספציפיים HBV וירוס נגוע הנגיף, יש דאגות על ההשפעות שלילי המתרחשים מתוך תגובות אוטואימוניות בגלל החוצה פעילות מניעת קולטן תא T (tcr)15,16, off-היעד הכרה Ag ידי לא ספציפי tcr17 ו על-היעד off-רעילות על-ידי קולטן Ag אריק (רכב) מיכל בן 18 , 19 עם רקמות בריאות. כיום, תאי T ששונו גנטית, אשר יש רק התמדה לטווח קצר ב vivo, הם בדרך כלל ביניים או מאוחר יותר בתאי T. עד כה, בתאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs) הם המקור היחיד הזמין להפקת מספרים גבוהים של תאי T חד-מסוגים בעלי סוג מסוים של ליחיד,20,21,22,23. המושרה PSCs (iPSCs) הם פשוט מומרים מתוך התאים הסומטיים של המטופל באמצעות שימוש התמרה גנטית של מספר גורמים שעתוק. כתוצאה מכך, iPSCs יש מאפיינים דומים כמו אלה של תאי גזע עובריים (ESCs)24. בשל הגמישות והאפשרות ליכולת אינסופית לחדש את העצמי, בנוסף להחלפת רקמות, טיפולים מבוססי iPSC עשוי להיות נרחב להחיל רפואה רגנרטיבית. יתר על כן, הגדודים הבסיסיים iPSCs עשויים לשפר באופן משמעותי את הטיפולים הנוכחיים התא.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להפיק כמות גדולה של CTLs ספציפיים ל-HBV מiPSCs (כלומר, iPSC-CTLs) עבור טיפול חיסוני מבוסס-ACT. היתרונות על טכניקות חלופיות הן ש-iPSC-CTLs ספציפי ל-HBV יש מסוג TCR ופנוטיפים תמימים, שתוצאתו היא פיתוח תאים יותר של זיכרון לאחר הפעולה. הוא הוכיח כי ACT של iPSC ספציפי HBV-CTLs מגביר את הגירה של תאים CD8+ T פונקציונלי בכבד ומפחית את שכפול hbv הן בכבד והן בדם של עכברים מנוהלים. שיטה זו מגלה שימוש פוטנציאלי של אנטי ויראלי iPSC-CTLs הספציפי עבור טיפול חיסוני HBV ניתן להתאים כדי ליצור ויראלי אחרים הספציפי Ag-T תאים לטיפול חיסוני נגיפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טקסס A & M באוניברסיטת בעלי חיים טיפול ועדת הבריאות (IACUC; #2018-0006) והם מתנהלים בהתאם להנחיות של האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה. משתמשים בעכברים בגיל 6 עד 9 שבועות.

1. הדור של CD8+ t ספציפי לiPSCs התאים הספציפיים (IPSC-CD8+ t תאים)

  1. יצירת המבנים הרטרונגיליים
    הערה: TCR α ו β גנים מקושרים עם 2A ברצף היציאה עצמית. הווקטור הרטרויראלי mscv-IRES-dsred (midr) הוא dsred+ 23.
    1. Sub-שיבוט HBs183-191 (flltrilti)-ספציפי A2-מוגבלת האדם-murine היברידית tcr (S183 tcr) גנים (vα 34 ו Vβ28) לתוך midr כדי ליצור את S183 midr לבנות (איור 1A)25.
  2. התמרה רטרונגיפית
    הערה: התאים פלטינום-E (מתחת לשמש) משמשים לאריזת כרטרוירוסים (הנושאים גנים s183 TCR), אשר ישמשו עבור התמרה רטרונגיזציה. התאים שלהם-E הם בתאי האריזה וירוס יעיל בבסיס התאים 293T, אשר פותחו באמצעות מבנים אריזה ייחודי דרך היזם EF1α לבטא חלבון מבנה retroviral יעיל, כולל מחסום, פול, ו ecotropic env.
    1. על צלחת תרבות 100 מ"מ, זרע 3 x 106 כדוריות-E ב 8 מ ל של מדיום התרבות dmem המכיל 10% סרום העוברי (fcs) בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2, 1 יום לפני התפתחות.
    2. ביום 0, העברה של s183 MiDR לבנות לתוך התאים שלהם-E באמצעות הזיהום DNA מגיב25.
    3. ביום 1, זרע 1 x 106 IPSCS (gfp+) לתוך לוחית לפני מצופה ג'לטין התרבות.
    4. בימים 2 – 3, לאסוף המכילים וירוסים-המכיל supernatant מתרבות התאים של שלישי-E כדי לשנות iPSCs עם s183 TCR בנוכחות של 1, 6-dibromohexane פתרון25.
    5. ביום 4, טריזיסיזציה s183 TCR ג'ין-התמרה iPSCs, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ו-seed 3 × 105 iPSCs בצלחת תרבות 100 מ"מ מצופה מראש עם 3 x 106 הקרינה לפני השיא SNL76/7 (irSNL76/7) המזין התאים25.
    6. ביום 5 או 6 של המפגש, טריזיסיזציה של התאים, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ותהליך עבור מיון התא. מיון על תאים חיים, למיין GFP ו-DsRED תאים כפולים-חיוביים (s183 TCR גן התמרה iPSCs) באמצעות סדרן תאים במהירות גבוהה. בדומה לשלב ה1.2.5, התרבות השיתוף משותפת לתאים הממויינים בתאי המזין irSNL76/7 לשימוש עתידי25.
  3. הבידול בתאי iPSC-CD8+ T ייחודיים של hbv
    הערה: התאים OP9-DL1/DL4 סטרומה גם הם משני החריץ DL1 ו-DL4, ושיתוף iPSCs עם הiPSCs יכול לקדם בידול תא מתווך של איתות מדרגה26.
    1. לגדול s183 TCR גנים-התמרה iPSCs (s183/iPSCs) ב OP9-DL1-DL4 תא מונאולייר ב α-בינוני חיוני מינימלי (הגברת) מדיה המכילה 20% סרום בפרה עוברית (FBS)27. כלול murine Flt3 ליגנד (mflt-3l; ריכוז סופי = 5 ng/mL) בתרבות.
    2. ביום 0, seed 0.5 – 1.0 x 105 S183/iPSCs בצלחת התרבות 10 ס"מ שגדלו בעבר עם OP9-DL1-DL4 תאים. ודא שהתאים OP9-DL1-DL4 נמצאים במצב של 80%-90% שליטה.
    3. ביום 5, לשטוף את iPSCs עם 10 מ ל של פוספט מואגור פוספטים (PBS), להוריד את ה-PBS, להוסיף את זה ל-4 מ ל 0.25% טריפסין, ו דגירה בחממה 37 ° c עבור 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף 8 מ ל של מדיה iPSC לסיים את העיכול טריפסין. לצבור את כל פתרונות העיכול המכיל את התאים ואת צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות ב 15 – 30 ° c.
    4. משף את התאים האלה ומשהה מחדש ב -10 מ ל של מדיה iPSC. העבר את ההשעיה התא לצלחת חדשה 10 ס מ פטרי ומודטה בחממה עבור 30 דקות ב 37 ° c.
    5. לאחר 30 דקות, לאסוף את המדיה iPSC המכילה את התאים צף. להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 יקרומטר ולחשב את מספר התא.
    6. זרעים 5 x 105 תאים בצלחת התרבות גדל בעבר OP9-DL1-DL4 תאים עם מצב של 80% – 90% confluent כמתואר בשלב 1.3.1.
      הערה: לגבי בידול תא T, כל 2 – 3 ימים, התאים הנגזרים iPSC צריך לחדש את הזרע עם שכבה טרייה של OP9-DL1-DL4 תאים.
  4. ערכה
    1. שינויים מורפולוגיים בהבחנה iPSCs
      1. צפו בתאים תחת מיקרוסקופ. בימים שונים
        הערה: ביום 5, מושבות יש מאפיינים דמוי עור, המציגות מורפולוגיה קלאסית בצורת ציר הדומה לפיברוזופי העור האנושית וצמיחה מתמשכת בתוך מבחנה. ביום 8, אשכולות עגולים קטנים של תאים מתחילים להופיע.
    2. ניתוח של הבחנה iPSCs על ידי הטקימטריה של זרימה
      1. בימים שונים של תרבות שיתוף, לנתח תאים שנגזרו iPSC כמתואר בעבר25 (איור 1B, ג).
    3. אנליזה פונקציונלית של ההבחנה iPSCs
      1. ביום 28 של שיתוף התרבות, לאסוף את התאים iPSC-CD8+ T מתרבויות דרך לקצור את התאים צף, טריסיזציה שאריות התאים עם 0.25% טריפסין, להשעות מחדש 8 מ ל של ipsc מדיה, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 400 x g ב 15 – 30 ° צ', להסיר את המדיה, לאחר מכן השהה מחדש את התאים ב-10 מ ל של מדיה.
      2. שמור את התאים מחדש מושעה בצלחת 10 ס"מ טריים בחממה 37 ° c עבור 30 דקות ולהרכיב את התאים צף. ואז לשטוף את התאים פעם אחת עם מקור הצטננות.
      3. מודקון 3 x 106 תא T מרוקן הטחול (CD4-CD8-) מ טחולים של H-2 מחלקה אני נוק אאוט, hla-a 2.1-transgenic (hla) עכברים עם 5 μm s183 פפטיד (flltrilti) ב 200 μl של מדיה ב 4 ° c עבור 30 דקות.
      4. הפקת תערובת של תאים iPSC-CD8+ T עם הטחול פעמו עם s183 פפטיד (T תאים: הטחול = 1:4; השתמש 0.75 x 106 תאים T). מודטה את התערובת של תאים ב 37 ° c באינקובטור2 CO עבור 40 h. במהלך האחרון 7 h, להוסיף 4 μL של brefeldin מדולל A לתוך התרבות (הריכוז הסופי של 1, 000x, אשר יהיה מדולל ב-1x מדיה תרבות) כדי לחסום את תהליכי התחבורה במהלך הפעלת התא.
      5. כתם את התאים ולבצע ניתוח ציטומטלי הזרימה של התאיים IFN-γ כפי שמתואר בעבר (איור 2).

2. אינדוקציה של שכפול HBV באמצעות משלוח הידרודינמי של HBV פלסמיד

הערה: המבנה של pAAV/HBV 1.2 נוצר כמתואר לפני9. HBV 1.2 DNA להשלים משולבים pAAV וקטור.

  1. משלוחים הידרודינמיים של HBV פלסמיד דרך וריד הזנב
    1. חום HHD עכברים באמצעות מנורת חום עבור 5 דקות בכלוב כדי להתרחב הווריד הזנב.
    2. לעכב את החיה באמצעות הרחקה, זנבות עכבר נקי עם 70% תרסיס אתנול.
    3. . משלוח פלסאמצע לכבד
    4. מדוד את משקל גוף העכבר באמצעות קנה מידה מדידה.
    5. לדלל 10 μg של HBV פלבאמצע ב 8% המקבילה של מסת הגוף PBS (למשל, 1.6 mL עבור 20 g העכבר). טען מדולל פלמיד ב 3 מ"ל מזרק עם a 26 G × 1⁄2" (0.45 × 12 מ"מ) מחט תת-עורית.
    6. אתר אחד משני ורידים הזנב הרוחבי בשליש האמצעי של הזנב ומקמו את המחט לתוך הווריד לרוחב. ניהול הזריקה המכילה HBV פלבאמצע דרך וריד הזנב בתוך 3-5 s.
  2. קוונפיקציה של viremia מ סרום דם של עכברים נגועים
    הערה: שכפול HBV מתרחש מיום 3 – 35 בנסיוב העכבר. שכפול ה-DNA פסגות ביום 7 ומפחית בהדרגה. ה-DNA HBV אינו מתנקה מהנסיוב עד היום 35.
    1. אוסף של נסיוב דם מעכברים נגועים
      1. לאסוף כ 0.1 mL של דם בצינור מיקרוצנטריפוגה מכל עכבר על 3, 5, 7, ו 10 ימים לאחר זיהום על-ידי דימום מסלולית רטרו ב שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL, לאחר מכן דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 20 דקות.
      2. צנטריפוגה את המדגם ב 6,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את הסרום supernatant לאחר צנטריפוגה.
    2. לטהר את הדנ א מנסיוב הדם באמצעות ערכת החילוץ הזמין מסחרית DNA לאחר ההמלצות של היצרן. בקצרה, lyse את התאים בעמודה מבוססת סיליקה, לבצע את שוטף, ולחלץ DNA על ידי הוספת 100% אתנול לעמודה להתחמק ו תפרידו ב 6000 x g עבור 1 דקות. elute ה-DNA ב 50 μl של מים חינם RNase.
    3. השתמש 100 ng של ה-DNA HBV מ הימנעות עבור ניתוח PCR בזמן אמת. השתמש בצבעי היסוד ובבדיקות הבאות: קדימה 5 ' טאגגונגג 3 '; הפוך 5 ' GCACAGCGCTTGT 3 '; . בדיקת מלאי 5
      1. השתמש הגנום HBV המכיל פלפמיד (pAAV/HBV 1.2) עבור עקומת רגיל לבצע PCR בזמן אמת בנפח כולל של 10 μL (איור 3).
    4. הגדר את תגובת ה-PCR בנפח כולל של 10 μL כפי שמוצג בטבלה 1.
    5. הגדר את התוכנית ה-PCR בתוך הציקלמטרנר כפי שמוצג בטבלה 2. שיעור המעבר לטמפרטורה מתוכנת הוא 20 ° צ'/s לדנטורציה/ריפוי ו-5 ° צ'/s עבור סיומת. מדוד את הזריחה בסוף שלב הריפוי עבור כל מחזור לניטור PCR בזמן אמת.

3. הפחתת שכפול HBV על-ידי פעולה של ויראלי-iPSC-CD8+ T מיוחדים בתאי

  1. העברת תאים המאמצת (ACT)
    1. להבדיל s183/iPSCs (1.3.7) על התאים OP9-DL1-DL4 מסטרומה בנוכחות mFlt-3L ו מיל -7 עבור 8 ימים כמתואר בסעיף 1.3.
    2. ביום 22, לאסוף את התאים iPSC-CD8+ T מלוחית 10 ס מ עם טריפסין, ולאחר מכן לשטוף ולהשעות מחדש כל צלחת 10 ס מ ב 10 mL של מדיה חדשה. הוסיפו את התאים לצלחת טרייה בגודל 10 ס מ וחזרו לחממה למשך 30 דקות כאשר נעשה זאת בסעיף 1.3. לאחר 30 דקות, לאסוף תאים צף.
    3. השתמש מסננת ניילון 70 יקרומטר כדי לעבור תאים כדי למנוע אשכולות תאים ולספור את מספר התא. להתאים את התאים לריכוז של 1.5 x 107 תאים/mL בתמיסה הקרה PBS ולהשתמש 70 יקרומטר ניילון מסננת לעבור תאים כדי למנוע אשכולות תא שוב אם יש צורך. שמור על התאים בקרח עד לפעולה.
    4. הכנס את השעיית התאים 200 μL (3 x 106 תאים) לתוך 4 – 6 עכברי השבוע בני hhd דרך הווריד הזנב.
  2. אינדוקציה של שכפול HBV
    1. ביום 14 לאחר העברת התא, לבצע את המסירה הידרודינמית של HBV פלבאמצע דרך הווריד הזנב כפי שמתואר בסעיף 2.1.
  3. חלבון וירוס זיהוי מהכבד הנגוע
    1. הקריבו עכברים בימים 3, 5, 7, 14, ו -21 לאחר ההדבקה. עבור המתת חסד, בכל כלוב, להשתמש 1 – 2 L של פחמן דו חמצני (CO2) בשלב הראשון. כאשר בעל החיים מפתח את אובדן התודעה, השג את שיעור הזרימה2 בסביבות 4 – 5 L/Min. בצע המתת חסד באמצעות שאיפת CO2 .
    2. הפרד את הכבד על ידי חיתוך העור פני השטח של צפק ניצול מספריים מלקחיים וקצת גרירת הכבד בחזרה כדי לחשוף את העור הפנימי רירית חלל הצפק. לאסוף ולגזור דגימות כבד (אורך x רוחב x גובה = 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ x 0.3 ס"מ) של העכברים הנגועים כדי להתאים בקלות לתוך הקלטת הטבעה לחסום בתוך 10% המאגר ניטרלי פורמלין עבור 4 – 24 h.
    3. Decalcify הכבד סמלסוססינג 2.5 M של חומצה פורמית; לשטוף את קסילן עבור 3 דקות, לשטוף 2x ב 100% אתנול, לשטוף 2x ב 95% אתנול, לשטוף 2x במים מיוים (די) עבור 2 דקות, ואז decalcify דגימות הכבד ב 1 מ"מ חומצה ethylenediאצטט (edta) בהתאמה. טיפול בטמפרטורה תת-רותחת (90 ° c) למשך 20 דקות.
    4. לצנן את רקמות הכבד קבוע עבור 30 דקות. לשטוף את הרקמות עם 1x PBS עבור 4 דקות ולהטביע את הרקמות ב פרפין. מייבשים את הרקמות בסדרה של ריכוזים גוברת של אתנול להחליף את המים, ולאחר מכן לטבול בטבילה קסילן להטביע את הרקמות חדרו לתוך גושי שעווה. הפוך שינוי אנכי ואופקי אחיד עבור כתמים. הכן 4 מקטעי יקרומטר עם מיקרוטומה הזזה.
    5. העבירו את הקטעים דרך המעבר החוצה ומעבר המים בעזרת קסילן ואתנול, ולאחר מכן בצעו כתמים אימונולוקסילאוריזציה של הסעיפים.
    6. כתם את הסעיפים עם 200 μL של משטח HBV נוגדן ספציפי ל-Ag (1:100 דילול בפתרון חסימת). מודיית את הסעיפים עם הנוגדן עבור 2 h ב RT ב 75% – 100% החדר מחולל לחות, ולשטוף 5x ב-1x PBS עבור 5 דקות.
    7. השתמש מגיב אנטי לדעוך המכיל 4 ', 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI) עבור כתמים גרעיניים כדי להכתים את השקופיות. להוסיף את coverslip עם כ 300 μL של פתרון DAPI מדולל מכתים (300 nM ב-1x PBS) ולאמת את כל coverslip מכוסה. שמרו את השקופיות בחשכה ב -4 ° צ' עד לבדיקה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
  4. הסתננות תאים דלקתיים עכברים נגועים
    1. הקרבת עכברים כמתואר בשלב 3.3.1. לאסוף את הכבד ולעשות סעיפים כמתואר בשלב 3.3.4.
    2. הכתם את המקטע עם המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) כדי להעריך חדירה של תאים דלקתיים לתוך הכבד.
    3. אחסן שקופיות בחשכה ב-4 ° צ' עד לניתוח נוסף במיקרוסקופ פלורסנט.
    4. הדמיה השקופיות תחת מיקרוסקופ זריחה כדי לזהות חדירה של תאים דלקתיים לתוך הכבד (איור 4).
  5. DNA HBV זיהוי של הכבד הנגוע
    1. בידוד של דנ א נגיפי.
    2. המתת חסד עכברים לאסוף את דגימות הכבד לפי סעיף 3.3.
    3. Lyse את רקמות הכבד ב-Nonindet P-40 (NP-40) מאגר לליזה (50 mM טריס-HCL, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40) המכיל קוקטייל פרוטאז מעכבי.
    4. צנטריפוגה בקצרה ב 16,000 x g כדי להסיר את גרעיני ופסולת התא.
    5. מודקת cytoplasmic ליפוסט with מmicrococcal נוקלאז (נוקלאז S7; 150 יחידות/mL) ו-cacl2 (5 מ"מ) ב 37 ° צ' עבור 90 דקות כדי לבזות את חומצת הגרעין מחוץ נוקלאואואפידים (ncs).
    6. הפוך את נוקלאז S7 על ידי תוספת של 10 מ"מ edta.
    7. מזרז את נוקלאואוקאפסידים עם פוליאתילן גליקול (יתד), לשבש על ידי 0.5% נתרן dodecyl סולפט (SDS), ולעכל עם 0.6 mg/mL פרוטטינואז K (PK) ב 37 ° צ' עבור 1 h.
    8. לשחזר את חומצות גרעין נגיפי ידי כלורופורם פנול החילוץ משקעים אתנול.
    9. לפתור את ה-DNA נגיפי שחולצו על 1.2% agarose ג'ל ולזהות לפי תקן כתמי הדרומי סטנדרטי באמצעות32 P-התווית hbv בדיקה DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמוצג כאן, HBV נגיפי ה-iPSC-CD8+ T תאים שנוצרו על ידי מערכת תרבות מבחנה. לאחר הפעולה של אלה ויראלי מסוג iPSC-CD8+ T תאים באופן משמעותי לדכא את שכפול hbv במודל Murine (קובץ משלים 1). העכבר iPSC הם התמרה עם המבנה של MIDR retroviral יעיל קידוד היברידית של העכבר האנושי HBV (Hbv183-191-ספציפי, s183), לאחר מכן iPSCs גנים המ בשיתוף עם OP9-DL1/DL4 תאים המבטא ליגניות (הן DL1 ו DL4) מולקולות בנוכחות rFlt3L ו-rIL-7. ביום 28 של תרבות שיתוף חוץ-גופית, התאים הנגזרים iPSC באופן משמעותי לבטא CD3 ו-Ag ספציפי לג TCR (לא תאים סמנים). בדיקת הזרימה של הCD3+CD8+ האוכלוסיה מראה כי התמרה מגדילה באופן דרמטי את הדור של CD8 בs183מפרט ויראלי בתאי T (איור 1).

ביום 28 של שיתוף תרבות חוץ גופית, CD4-CD8+ יחיד חיובי (SP) ipsc-CD8+ T תאים מבודדים ומגורה על ידי הטחול לא מרוקן פעמו עם s183 פפטיד, וייצור cy, מוערך. IPSC-CTLs לייצר כמויות גדולות של IL-2 ו IFN-Υ כפי שזוהו על ידי כתמים תאיים או אליסה (איור 2). זיהום HBV הוא המושרה HBV-A 2.1 הטרנסגניים (HBV) עכברים על ידי הזרקה הידרודינמית של 10 μg של pAAV/HBV 1.2 DNA פלאמצע דרך הורידים הזנב של עכברים. שכפול HBV מזוהה מיום 3 – 21 בסרום של עכברי HBV. שכפול ה-DNA פסגות ביום 6 ומפחית בהדרגה באמצעות ניתוח PCR בזמן אמת (איור 3).

שבועיים לאחר הפעולה, עכברים מאותגרים עם הזרקה הידרודינמית של pAAV/HBV 1.2 ה-DNA פלמיד. סיכוייו הנגיפי נמדד על ידי ה-PCR בזמן אמת מן הסרום בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה. התוצאות מראות כי השכפול ויראלי מופחת באופן משמעותי בכל נקודות הזמן בעכברים קבלת HBV ויראלי Ag לתאי T בהשוואה לעכברים קבלת תאיבקרה(איור 4א). הביטוי חלבון המשטח HBV נבדק גם בכבד במסגרת הטיפול לעיל. עכברים מורדמים בימים שונים לאחר הזרקת HBV ואת דגימות הכבד מבודדים לבדיקה היסטולוגית. דגימות מוכתם חלבון משטח HBV ונבדק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית. החלבון HBV פני השטח נצפה כמו ירד באופן משמעותי בעכברים מקבל HBV נגיפי Ag הספציפי ל-iPSC-CTLs, לעומת העכברים קבלת תאים בקרה (איור 4ב). ניסוי זה מוכיח בבירור כי ויראלי הספציפי Ag-CD8+ T תאים יש את היכולת להפחית את שכפול hbv במודל murine.

Figure 1
איור 1: הדור של HBV ויראלי ה-iPSC-CD8+ T ספציפי תאים.
עכבר iPSCs הם התמרה עם המבנים הבאים ויראלי: HBs183-91 tcr (midr-S183 tcr) או בנובה257 – 264 tcr (MIDR-OVA tcr), ו התמרה iPSCs הם שיתוף תרבותי עם OP9-DL1/DL4 מסטרומה תאים עבור T השושלת בידול. (א) ייצוג סכמטי של המבנה הרטרונגיפי midr-S183 tcr המבטא s183-ספציפי tcr. ענבל = אות האריזה; 2a = וירוס קלוט העצמית היציאה 2a רצף; משמאל לימין = מסוף ארוך חוזר. (ב) מורפולוגיה של תא T בידול בימים 0, 7, 14, ו -22. (ג) הזרמת החוליות לתאים הנגזרים לתאי ipsc ביום 28. CD3+CD8+ תאים (משמאל) מסומנים כפי שמצוין ונותחו עבור הביטוי של CD8 ו TCRVβ28 (מימין). נתונים המוצגים מייצגים שלושה ניסויים בודדים. הערכים מייצגים ממוצע ± SD (* * p < 0.01; לזווג t-בדיקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח פונקציונלי של התאים האנטי-ויראליות של HBV-CD8+ T הספציפיים ל-Ag.
ביום 28 של תרבות שיתוף חוץ גופית, התאים SP CD8+s183 tcr+ ipsc-T ממוינים. התאים iPSC-T ו CD8+ T תאים התמרה עם midr-S183 tcr הם מגורה על ידי T-מרוקן הטחול (apcs) מ hhd עכברים פעמו עם s183 פפטיד (FLLTRILTI). (א) מכתיםתאיים של ifn-Υ אחרי 7 h (מגודרת על CD8+ תאים) (T/apcs = 1:4). (ב) אליסה של ifn-γ אחרי 40 h. נתונים המוצגים הם נציגים של שלושה ניסויים בודדים. הערכים מייצגים ממוצע ± SD (נ, p > 0.05; לזווג t-בדיקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: אינדוקציה של שכפול HBV בעכברי HBV על ידי הזרקה הידרודינמית.
עכברי HHD הם עירוי אינפוזיה עם hhd פלאמיד באמצעות הזרקת וריד הזנב הידרודינמי. 10 μg של הפלסמיד מוזרק 8% ממסת הגוף הכוללת PBS. על נקודות הזמן שצוין לאחר ההזרקה, הסרום מבודד מדם ו-DNA מופק ב-PCR בזמן אמת. נתונים המוצגים מייצגים שלושה ניסויים בודדים. הערכים מייצגים ממוצע ± SD. נתונים הם נציגים של חמישה עכברים לכל קבוצה של שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הפחתה של שכפול HBV על ידי פעולה של ויראלי הספציפי Ag-CD8+ T תאים.
העכברים HHD הם עירוי הועבר באופן ויראלי מסוג Ag-CD8+ T תאים ושלתי (ביום 22 של תרבות מבחנה) וניהול עם hhd פלמיד בשבוע 2 לאחר העברת התא. (א) נסיוב hbv עותקים. על נקודות זמן שצוין לאחר ההזרקה, סרום מבודד דם, ו-DNA מופק בזמן אמת ניתוח PCR. נתונים המוצגים מייצגים שלושה ניסויים בודדים. הערכים מייצגים משמעות ± SD. (ב) רקמת הכבד היסטולוגיה. עכברים מורדמים ביום 8 post-HBV זיהום. דגימות כבד מבודדות ומוכתם לבדיקה היסטולוגית. הפאנל העליון מראה את הביטוי חלבון HBsAg בעכברים נגועים (כתמים IHC) והלוח התחתון מציג את חדירת התא דלקתית (הוא-כתמים). הנתונים מייצגים חמישה עכברים לכל קבוצה של שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תבנית דנ א 2 מ ל
ה-DNA היברידיזציה תערובת ((Taq DNA פולימראז, מאגר התגובה PCR, 10 מ"מ MgCl2, ו dNTP תערובת) 1 מ ל
25 מ"מ MgCl2 0.8 מ ל
0.3 μM המקדח 3 מ ל
5 μM של כל פריימר 3.2 מ ל
כולל 10 מ ל

שולחן 1: נפח התגובה של ה-PCR

טמפרטורה זמן
דנטורציה 95 ° c 5 מנות
ריפוי 53 ° c עשרה מנות
סיומת 72 ° c עשרים ושנות
5 ° c

שולחן 2: תוכנית ה-PCR

קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מציג שיטה להפקת ה-iPSC-CTLs הנגיפי הספציפי לשימוש ב-ACT כדי לדכא שכפול HBV במודל מורין. בזיהום HBV כרונית, הגנום הנגיפי צורות כרומוזום מיני יציבה, ה-DNA סגור מעגלי מעגלית (cccDNA) זה יכול להימשך לאורך כל תוחלת החיים של hepatocyte. פילוח הסיווג של כרומוזום מיני נגיפי עלול לגרום לתרופה של זיהום HBV כרונית. הטיפול האנטי ויראלי מטרות ההמרה הפוכה הווירוס, אך לעתים רחוקות יוצר שליטה חיסונית על שכפול HBV מונע על ידי cccDNA. CD8+ ctls ספציפי ל-hbv יכול לתווך את הריגת החלציטים הנגועים ולהאיץ את הסיווג של cccDNA. עם זאת, ה-CTLs הספציפי ל-HBV נמחקים, לא מתפקד, או נכנעים לתשישות בחולים עם זיהום HBV כרוני. לפעול עם ctls ספציפי hbv הוא טיפול חיובי עבור זיהום hbv כרונית28,29. נאיבי או מרכזי זיכרון T cell לימפוציטים T (כלומר, בתאי החיסון מאוד תגובתי) הם מתעריקים אידיאליים עבור טיפולים מבוססי חוק בשל התפשטות הגדול שלהם, נטייה נמוכה יותר למוות בהשוואה לתאים סופני הבדיל, ומעולה יכולת להגיב ל ציטוקינים הומסטטיים. עם זאת, פעולה כזו לא הייתה לעיתים קרובות בלתי אפשרית עקב קשיים בהשגת מספר מספיק של מטופלים מחולים. כבר הראו בעבר כי תכנות מחודש של ה-Ag הספציפי אוהתקנות של iPSCs יכול לשמש עבור טיפולים מבוססי תא20,23,27,30. דו ח זה מדגים שיטה להפקת iPSC-CTLs ויראלי ספציפי, ולהשתמש בתאים אלה לטיפול חיסוני מבוסס-ACT במודל murine של שכפול HBV.

למרות שיש מודלים העכבר הטרנסגניים של שכפול HBV, מודלים אלה מאתגרים כי הסובלנות המרכזית הנגרמת על ידי מוצרי הגן הטרנסגניים גורם עכברים להיות עמידים בפני HBV Ags. בנוסף, עכברים טרנסגניים אינם מתאימים ניטור ויראלי כמו הגנום hbv משולב ממשיך בכל תא העכבר31,32. גם, למרות החיסונים המצליחים פותחו למניעת זיהום, טיפול או חיסוני לאחר זיהום HBV לא פותחה. יתרה מזאת, הגישות הנסיוניות ל-HBV הפתוגנזה הוגבלו מכיוון שטווח המארח של זיהום HBV מוגבל לגברים ולשימפנזים, ובמערכת התרבות החוץ-גופית להפצת HBV אין די. CD8+ T תאים הם מבטיחים התאים האחרים נגד סוגים שונים של זיהום נגיפי; עם זאת, תגובת תא T נגד HBV אינה שופעת. ספציפיות, תפקוד והיעדר מספרים מספיקים כדי לטעון תגובה חיסונית עשוי להיות הגורם. דו ח זה חושף את שיטת ההזרקה הידרודינמית הגורמת ביעילות לשכפול HBV בעכברים. השיטה מאפשרת משלוח של כמות גדולה של הפלאבין HBV ישירות לתוך הכבד. המודל מציג רציפה viremia עבור יותר מ 8 שבועות עם זיהוי של HBV mRNA, חלבון, ו-DNA בימים שונים לאחר ההזרקה. שיטה זו עבור שכפול HBV בעכברים שימושית לטיפול חיסוני HBV.

לסיכום, שכפול HBV הושרה בהצלחה בעכברים באמצעות הליך הזרקת הידרודינמי, ו-iPSC-CTLs ספציפי ויראלי שימשו כטיפול חיסוני עבור שכפול HBV. עם זאת, ישנן שתי מגבלות של השיטה: (1) יותר משלושה שבועות של בידול התא T מתורבת עשוי להפחית את היישומים הטרנסלבותית של התאים T שנוצר עבור ACT; ו (2) HBV הזרקת הידרודינמי יכול ביעילות לגרום שכפול HBV בכבד; עם זאת, הוא אינו יוצר את cccDNA, שהיא הסיבה העיקרית לזיהום HBV מתמשך. עם זאת, השיטה מספקת גישה חלופית עבור שכפול HBV וטיפול. שילוב משטר באמצעות תרופות נגד HBV ופעולה של ויראלי iPSC ספציפי-CTLs צפוי להפחית מאגרי HIV, ובכך וכתוצאה מכך טיפול בזיהום HIV כרונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים ד ר אדם J Gehring מבית החולים הכללי של טורונטו המכון למתן cDNA עבור HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-הספציפי A2-מוגבל אנושי היברידית TCR, וד ר. פיי-ג'ר צ'ן מאוניברסיטת טייוואן הלאומית למתן המבנה של pAAV/HBV 1.2. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק בריאות R01AI121180, R01CA221867 ו R21AI109239 לג. ס. י.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HHD mice Institut Pasteur, Paris, France H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice
iPS-MEF-Ng-20D-17 RIKEN Cell Bank APS0001
SNL76/7 ATCC SCRC-1049
OP9 ATCC CRL-2749
pAAV/HBV1.2 plasmid Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) HBV DNA construct
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28)
OVA257–264-specific TCR genes Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes
Anti-CD3 (17A2) antibody Biolegend 100236
Anti-CD44 (IM7) antibody BD Pharmingen 103012
Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100408
Anti-CD8 (53-6.7) antibody Biolegend 100732
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody Biolegend 505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody Biolegend 506306
α-MEM Invitrogen A10490-01
Anti-HBs antibody Thermo Fisher MA5-13059
ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
Brefeldin A Sigma B7651
DMEM Invitrogen ABCD1234
FBS Hyclone SH3007.01
FACSAria Fusion cell sorter BD 656700
Gelatin MilliporeSigma G9391
GeneJammer Agilent 204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer Proimmune F027-4A - 27
HRP Anti-Mouse Secondary Antibody Invitrogen A27025
mFlt-3L Peprotech 250-31L
mIL-7 Peprotech 217-17
Nuclease S7 Roche 10107921001
Paraformaldehyde MilliporeSigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Permeabilization buffer Biolegend 421002
Polybrene MilliporeSigma 107689
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen P36931
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 151 תא גזע HBV חיסוני העברת תא המאמצת שכפול נגיפי עכבר
גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, X., Lei, F., Haque, M., Song, … More

Xiong, X., Lei, F., Haque, M., Song, J. Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice. J. Vis. Exp. (151), e60043, doi:10.3791/60043 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter