Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

doi: 10.3791/60058 Published: August 19, 2019

Summary

אנו מספקים מיתאר של הפרוטוקול הקליני להערכת לא פולשנית של בגרות ביצה אנושית באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב.

Abstract

העיתוי האופטימלי של הזרקת הזרע התאיים (ICSI) הוא דאגה רצינית לתוכניות הפוריות, משום שערך זרע בטרם עת מצמצם את היכולת ההתפתחותית של הביצית. נוכחות של גוף הקוטב הראשון (PB) יחד עם ציר meiotic מציין השלמה של התבגרות oocyte ואת המוכנות של הביצה להפריה. בפרקטיקה הקלינית, נהוג להניח כי כל האוציטים המציגים PB הם בוגרים (MII) oocytes. עם זאת, PB ההבלטה לפני היווצרות של ציר MII דו-קוטבית. זה הופך את הנוכחות של PB לסמן לא אמין של בגרות oocyte. הדמיה של ציר שאינו פולשני באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב (PLM) מאפשר בדיקה קלה ומהירה של האם PB-הצגת oocyte למעשה הרכבנו ציר meiotic לפני ICSI. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי כדי לבצע הערכה לפירעון ביצים אנושיים במעבדה הקלינית. אנו גם מראים כיצד למטב את הזמן של ICSI ביחס לשלב ההתפתחותי של oocyte על מנת למנוע הזרקת זרע מוקדמת של התבגרות מאוחרת oocytes. שימוש בגישה זו, אפילו בלתי בוגר הבלטת מיכל PB בתוך מבחנה יכול להיות מנוצל קלינית. הצהרה כי ציר MII נוכח לפני הזרקת זרע והתאמה אינדיבידואלית של הזמן של ICSI הוא חשוב במיוחד בפרוגנוזה נמוכה הפריה חוץ גופית (IVF) מחזורים עם מספר נמוך של oocytes זמין עבור הפריה.

Introduction

כדי להיות ביצת fertilizable פלואידי, את דיפלואידי oocyte יש להפוך את חצי המידע הגנטי שלה לתא הסמוך, נקרא גוף הקוטב הראשון (PB), וליישר כרומוזומים בתוך המשווה של מטשלב השני הדו (mii) ציר. בעוד PB יכול להיות בבירור נצפתה על ידי מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי, זיהוי של חומרים גנטיים מבנים ציטולדים בדרך כלל דורש הכנה פולשנית שאינם תואמים את השימוש הנוסף של oocyte לטיפול בפוריות. מכאן, בפרקטיקה הקלינית, הנוכחות של PB הוא נחשב סימן ההיכר של בגרות oocyte. עם זאת, הדמיה חיה של מיקרוכדורית ודינמיקה כרומוזום במהלך התבגרות האדם oocyte גילה כי PB הופך להיות גלוי כמה שעות לפני ציר MII דו-קוטבית מורכב וכרומוזומים מיושרים1. עם זאת, באור המשודר, MII עצרה ביצים הם לא להבחין האוסטציטים אשר נכנס רק לתהליך של הפרדה כרומוזום. כך, קבוצה של oocytes, מסווג כ MII oocytes מבוסס רק על נוכחות PB, יכול להכיל latematuring רפתקאות oocytes שעדיין לא השלימו את התפתחותם ובכך אינם מוכנים הפריה.

עיכוב של התבגרות oocyte צפוי להשפיע על האוכלוסייה של המגיבים עניים עם מספר נמוך של MII oocytes ושיעור גבוה של oocytes בוגר שנאסף במפתיע ב מחזורי גירוי2. בvivo, רק ביצה אחת, באיכות הטובה ביותר משיגה בגרות והופכת ovulated. ב-הפריה חוץ גופית (IVF) מחזורים, השחלה מבוקרת חלתי משמש לגייס אוציטים מרובים להבשלה. גל גונדוטרופין מפעיל חידוש של התוכנית meiotic ואת ושלתי ביצה אמורים להגיע לשלב מעצר MII בתוך 36 שעות3. עם זאת, oocytes שאוחזרו preovulatory זקיקי לעתים קרובות מהווים מבחר של PBdisplaying MII oocytes ובלתי בוגר oocytes, או במטא I (MI) או שלפוחית העין בשלב (GV) (איור 1). רק MII oocytes חשופים הזרקת זרע תאיים (ICSI) בעוד oocytes בלתי בוגר הם בדרך כלל מושלך. עם זאת, כאשר מעובד בתוך מבחנה, MI oocytes משמשים בדרך כלל כדי הבלטת PB ב מבחנה. למרות הנחיתות הכללית שלהם, התבגרות מאוחרת oocytes אשר השלימה באופן ספונטני את החטיבה meiotic הראשון במהלך תרבות הלילה השתמשו בהצלחה כמשאב האחרון oocytes, ו לידות חי דווחו4,5 ,6,7,8. מכאן, ההזרקה בטרם עת של הזרע עשוי להיות הסיבה העיקרית בבסיס התוצאות התפתחותיות עניות של oocytes התבגרות מאוחרת דיווחו במחקרים קודמים9,10,11.

מיקרוסקופ אור מקוטב (PLM) בשילוב עם תוכנת עיבוד תמונה מאפשר הדמיה לא פולשנית של ציר meiotic ב-oocyte חי. השתקפות כפולה נוצרת על ידי אינטראקציה של קרן אור מקוטב עם הרכבה מסודרת מאוד של microtubules בניית הציר הדו. מאז אור מקוטב הוא בעוצמה נורמלית, הטכניקה יכולה לשמש בבטחה הגדרות קליניות כדי לראות את הדינמיקה של מנגנון החלוקה11,12,13,14. הנוכחות של ציר mii שבירה בתוך oocyte זוהה כסמן של יכולת התפתחותית של ביצה9,15,16,17,18, . 19,20,21,22,23 כך, הוצע כי הדמיה לא פולשנית הציר meiotic יכול לשמש לבקרת איכות ביצה בפרקטיקה קלינית11,14,20.

מאז ציר הזמן עבור הדינמיקה המיקרוצינורי במהלך מוזיקה oocyte נפתרה1, דפוס plm נצפתה יכול להיות קשור יותר לקורס הזמן של MI כדי mii המעבר. זמן קצר לאחר פליטת PB, הציר MII המתהווה הופך להיות בלתי ניתן לגילוי על ידי PLM. עם זאת, אם האוזציטים נשמרות בתרבות, האות השבירה עשוי לצוץ מאוחר יותר כאשר ציר של mii דו-קוטבית פורס9,10,11. כך, ב אוציטים הבלטת ממד PB ב מבחנה, העדר ציר יכול להיות רק זמני המתאים המעבר הפיזיולוגי של oocyte התבגרות מאוחרת מ-MI לשלב MII. אם אות MII הציר אינו ניתן לגילוי, הזרקת זרע יכול להיות נדחה לנקודת זמן מאוחרת יותר מתן זמן נוסף עבור היווצרות ציר MII. אופטימיזציה PLM בסיוע של זמן ICSI למקסם את הסיכוי של התבגרות מאוחרת oocytes להיות מנוצל קלינית ולעשות הבדל לחולים פרוגנוזה נמוכה9.

להלן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד של איך לבצע דימות ציר פולשני של האדם oocytes. אנו גם להדגים כיצד PLM יכול להיות מועסק כדי למנוע את הסיכון של הפריה מוקדמת של התבגרות מאוחרת oocytes.

Protocol

פרוטוקול זה מתאר את ההליך הקליני שהוא ' הרחבה ' לטיפול IVF סטנדרטי. זה צריך להתבצע על ידי כוח אדם מנוסה בהתאם לפרקטיקה מעבדה טובה הנחיות קליניות24,25. מומלץ להשיג הסכמה מושכלת בכתב מהחולים הזכאים. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית.

1. איחזור ביצים וחסיפה

  1. לגרום גירוי השחלות באמצעות פרוטוקולי גירוי קונבנציונאלי3. כוונן את המינון לתגובה אישית. כאשר שני או יותר זקיקי, דמיינו על ידי סריקת אולטרסאונד, להגיע לקוטר של 18 מ"מ, לגרום התבגרות oocyte עם יישום של 250 μg גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG). לתזמן את האיסוף (OPU) ב 35 לאחר הזרקת hCG הודעה.
  2. לאסוף מאוחזרים קומולוס-oocyte מתחמי (COCs) ב-CO2-עצמאי טיפול בינונית (טבלת חומרים). בעקבות תקופת דגירה קצרה (10-15 דקות) באינקובטור2-עצמאי, בקצרה (עד 30 s) לחשוף את הפתרונות של החברה לפתרון hyaluronidase (טבלת חומרים). תחת stereomicroscope, להסיר בצורה מכנית תאים קומולוס-קורונה על ידי ליטוף בעדינות COCs עם קצה מסנן 200 μL.
  3. באמצעות מיקרופיפטות מיקרו עם קוטר יורד בהדרגה (200 יקרומטר, 180 יקרומטר ו 150 יקרומטר), בעדינות להסיר את oocytes מן התאים הזקיקים הנותרים ולשטוף את האוציטים 3x בטיפול בינוני.
  4. העריכו את המספר והסטטוס ההתפתחותי של האוסטציטים הנסתיות בהתאם לנוכחות או העדר הגרעין והראשון PB (איור 1).
  5. בדוק את קריטריוני ההכללה עבור בדיקת PLM. לבצע הערכת בגרות ביצה אם יש (1) תגובה גרועה בלתי צפויה לגירוי קונבנציונאלי עם פחות מ 6 MII oocytes שנאסף ב-OPU ו (2) היסטוריה של כשל הפריה קודם או oocyte immaturity.
  6. מקום GV, MI ו-MII oocytes לתוך בארות נפרדות בצלחת IVF, כל המכיל 500 μL של מדיום בינוני מוצרים2תלויי-משקל (טבלת חומרים) מכוסה שמן מינרלי (לוח חומרים).
  7. המלון מיועד לתוספת של 3 עד 4 שעות ב-37 ° c באווירה של מחולל לחות של 5% O2 ו-6% CO2.

2. הכנה לבדיקת plm ולאחריה icsi

הערה: הפרוטוקול המסופק כאן מתאר את הערכת PLM שבוצעה באמצעות מערכת העזרה הקוטבית של OCTAX (טבלת חומרים). לחילופין, ניתן להשתמש במערכות תצוגה מסחרית אחרות של הציר.

  1. הכינו צלחות לטיפוח העובר.
    1. בהתאם למספר של oocytes להיבדק (סך של MII oocytes, ו-MI oocytes הבלטת ממד ב-PB במהלך תקופת הדגירה המוקדמת), להכין את הצלחת 4-הבאר או לוחית 12-באר, למלא כל טוב עם 500 μL או 30 μL של התרבות הבינונית, בהתאמה , ולכסות בשמן מינרלי שולי בעבר.
    2. ודאו ששמן התרבות והמינרלים בתווך מוקמים בחממה של2 מבני הלילה. שמור את המנה המוכנה ב-CO2-החממה התלויים עבור לפחות 2 h. מספר בארות אם יש צורך לעקוב אחר הגורל ההתפתחותי של oocytes בודדים.
  2. הכן את הצלחת ICSI.
    1. השימוש צלחת פלסטיק מוקצה ולעשות 5 μL droplet של בינוני טיפול טרום-שחומם עבור כל PB-הצגת oocyte ועוד droplet אחד עבור כביסה המחט. לעשות droplet נוספת של polyvinylפירולסיים (PVP) פתרון (לוח חומרים) עבור השתק זרע לפני icsi (להוסיף זרע ממש לפני icsi) וכיסוי עם שמן מינרלים prewarmed.
    2. שמור את הצלחת ICSI מוכן באינקובטור2-עצמאי לפחות 20 דקות. מספר בארות אם יש צורך לעקוב אחר האוציטים לאחר icsi.
  3. הכן את צלחת הבדיקה PLM.
    1. השימוש צלחת זכוכית מוקצה התחתון ולעשות 5 μL טיפות של בינונית טיפול טרום שחומם עבור כל PB-הצגת oocyte. שכבת-על עם שמן מינרלי טרום-שחומם.
    2. שמור את המנה בחממה העצמאית2-CO לפחות 20 דקות. מספר את הטיפות אם יש צורך לעקוב אחר האוציטים לאחר בדיקת plm.
  4. הכינו את המיקרוסקופ לבדיקת PLM.
    1. החליפו את הבמה המחוממת על המיקרוסקופ ההפוך, מראש והשיגו את טמפרטורת ההתחממות הנכונה. ודא שההגדרות מותאמות במדויק כדי לשמור על 37 מעלות צלזיוס בטיפות בינוניות בצלחת PLM/ICSI במהלך הליכי המיקרומניפולציה.
    2. להתאים את המחט מחזיק סטרילי ICSI לתוך מחזיקי מיקרו ולהביא אותם לפוקוס. לחילופין, השתמשו במחט מאינקובטור.
    3. בחר את המטרה המתאימה (20x ו-25x הם המתאימים ביותר) ולוודא כי הקבל הוא מיקום שדה בהיר.
    4. הכנס מסנן הפרעות ירוקות (האור הופך לירוק) והגדר את מחוון ניתוח הגביש הנוזלי לתנוחת עבודה.
    5. הגדר את התריס כדי ~ 50% ולהתאים מקטצר עגול כדי להקטין את רעשי הרקע.
  5. הכן את המחשב לבדיקת PLM.
    1. הפעל את תוכנת הדימות.
    2. בחר וידאו | מקור וידאו | polarAIDE בתפריט הווידאו בשורת התפריטים העליונה.
    3. עבור לווידאו בשידור חי על- ידי המעבר לדף וידאו והפעלה של ניתוח הציר והסונה על-ידי הפעלת הסמל (איור משלים 1) בסרגל הכלים של הווידאו.
    4. בחירת מצב תצוגה לשינוי גודל דינאמי במהלך הדמיית ציר: (1) אדום (שבירה)/ירוק (רקע) תצוגה משולבת, או (2) לבן (שבירה)/and שחור (רקע) נוף. מצב הניקוד הדינמי משמש לניקוד אוטומטי של הסונה פלווצידה.

3. בחינת בגרות הביצית

  1. לאחר תקופת טרום הדגירה (3-4 שעות), לבצע בדיקה PLM לחשוף את מצב הבגרות oocyte בזמן הסטנדרטי של ICSI (39-40 h לאחר ההדק hCG).
  2. העבר את כל oocytes לתוך טיפות בודדות על מנת PLM ומניחים אותו תחת המיקרוסקופ הפוך מוכן הדמיה ציר. זכרו להסיר את מכסה הפלסטיק ממנה תחתית הזכוכית לפני תחילת הבדיקה.
  3. . הביאי את האחד הראשון לפוקוס אם קשה לחפש את התא שמתחת לאור ירוק, משוך את המסנן הירוק באופן זמני. ודא שהמסנן הירוק נוסף לפני הניתוח.
  4. שימו לב לתמונת האישור המזוהה של oocyte (אדום/כתום על רקע ירוק) כפי שהוא מעובד במחשב ומוצג בזמן אמת על מסך המחשב. זכור כי האות אינו מוצג בעינית.
  5. אם ההודעה מכריזה על חשיפה באור נמוך מדי/גבוה קופץ למעלה, להתאים את הבהירות לעוצמה המתאימה באמצעות כפתור עוצמת אור של המיקרוסקופ.
  6. השתמש מחט מחזיק ICSI להפוך את oocyte כך PB הוא במיקום 12 השעה ולהתמקד PB.
  7. אם שבירה הציר אינו גלוי ממבט ראשון בקרבת PB, בעדינות להפוך את oocyte סביב כל ציר על ידי נגיעה מעט הסונה pellucida כדי להבטיח את היישור של אור מקוטב עם סיבי ציר המערך (וידאו משלים ). הצהר על העדר ציר MII כל עוד ה-oocyte אינו מראה את אות הציר למרות הסיבוב הקפדני.
  8. מבוסס על דפוס שבירה שנצפו, לסווג את oocytes לתוך הקטגוריות הבאות (איור 2): (א) oocytes עם אות בהיר של ציר דו קוטבית בצורת חבית mii עם גבולות ברורים ואפילו הפצה של שבירה ; (ב) אוציטים עם מכולה, אפאר וציר MII שקוף עם גבולות חריגים והפצה לא אחידה של האות; (ג) האוציטים ללא הגילוי של ציר MII מחזיר שבירה באואופלזמה;   (ד) אנאפיום I/telophase אני oocytes, מראה גשר מיקרוצינורי (סטרנד חיבור בין הראשון PB ו oocyte) במקום ציר MII.
    הערה: Oocyte עם סימן ציר MII לזיהוי (כיתה א' או ב') מתאימים ל-ICSI מיידי.
  9. צלם תמונה (F9) או הקלט וידאו עבור דוח ו/או ניתוח תמונה שלאחריו. שמור תיעוד של תבנית תמונה כדי להקטין את הסובייקטיביות של האופרטור.
  10. מעבר למיקום של oocyte הבא וחזור על שלבים 3.6-3.9.

4. אופטימיזציה של icsi עיתוי

  1. העבר את כל ציר-חיובי oocytes (כיתה A או B, שלב 3.8) לתוך צלחת icsi והנושא אותם icsi על פי פרוטוקולים סטנדרטיים24,25.
  2. אם oocytes להראות לא לגילוי אות MII ציר, למקם את הצלחת PLM לתוך החממה2-עצמאי ולהעביר את icsi לתוך זמן מאוחר יותר.
  3. בצע בדיקה מחודשת של PLM ~ 2-3 לאחר מכן בעקבות השלבים 3.3-3.9. אם קצת oocyte (s) עדיין חסר ציר MII, עיכוב נוסף ICSI עבור תוספת 1-2 h.
  4. העבר את כל oocytes לתוך הצלחת ICSI ולהזריק להם לפי פרוטוקולים סטנדרטיים24. אם תבשיל PLM תואם את זווית כיפוף של המחט מיקרוהזרקה, לבצע ICSI מיד בצלחת PLM לאחר מעבר למצב שדה בהיר.
  5. עם ICSI, העברת oocytes לצלחות מוכנות לטיפוח העובר ולתרבות עד לשלב הבלסטוציסטה.

Representative Results

מיקרוסקופ אור מקוטב מאפשר באופן מיידי לבדוק אם ההבשלה הגרעינית השלימה והתאספו ציר MII לפני ICSI. בשל אופיו הלא פולשני שלה, זה יכול לשמש כדי להעריך בבטחה את המוכנות של ביצת האדם להפריה בהגדרות הקליניות11,12,13,14. בנוסף, יש סיכוי גבוה יותר להצמיח מעבר לעוברים קיימא מאשר באוציטים ללא ציר9,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , 23. גם, oocytes שמציעות ציר דו קוטבית ברורים נראה שיש יכולת התפתחותית גבוהה יותר מאשר oocytes עם הצירים מנוונת9,21,22. יחד, הדמיה ציר יכול לשמש ככלי כדי לזהות את oocytes עם הפוטנציאל הגדול ביותר להיות מופרית בהצלחה, לעבור פיתוח טרום השרשה ותמיכה לטווח מלא הריון9,15, מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , . עשריםואחד

השכיחות המדווחת של הציר משתנה (44-97%) המשקף את הגיוון של האוכלוסייה למדו9,15,16,17,18,19,20,21, מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , מיכל בן 26 , בן 27 , 28. ב vivo התבגר oocytes מתוך המגיבים הנורמליים בדרך כלל להציג ציר mii דו-קוטבית ב 40 h לאחר ההדק hCG9,18,27,29. עם זאת, במגיבים איטי, הבריכה של oocytes שאוחזרו מ preovulatory זקיקי מושפע התבגרות עיכוב9,27. כאן, הדמיה ציר צריך להתבצע כדי להפלות את האוסטציטים נעצר בשלב MII מאלה שעברו מעבר מורדתי חשוב (איור 3). אנו ממליצים על הסרת תאים פוליקולרית מיד עם אחזור, ואת הדגירה של MI ו-MII oocytes בארות נפרדות כדי להיות מסוגל להבחין ב vivo oocytes הבשיל ו התבגרות מאוחרת הבלטת ממד PB בתוך מבחנה, זמן קצר לפני ICSI. במקרה של מבוצעת בדיוק לפני ICSI, שתי אוכלוסיות אלה של oocytes מבוססים על מראה PB.

יש לפרש את השינויים הספציפיים לפאזה בתבנית PLM בהקשר של הידע על הדינמיקה של ציר הזמן במהלך ההבשלה המיוטית. במהלך הinterkinesis, מנגנון החלוקה עובר התארגנות מבנית נרחבת ואות plm מאוד נעלם1,9,10,11. כך, בהתפתחות נפשית מושהית הבלטת ממד PB בתוך מבחנה, העדר אות MII ציר עשוי לא בהכרח לשקף הפרעה תאית, אבל זה יכול להצביע על ההתקדמות של oocyte מ-MI לשלב MII (איור 3). אם הזרע מוזרק בנקודת זמן בלתי פיזיולוגית, הפוטנציאל ההתפתחותי של הביצית נחשף. דחיית icsi מספק התבגרות מאוחרת oocytes עם יותר זמן להרכיב ציר mii שנוכחותו קשורה עם תוצאות קליניות טוב יותר9,10,11. במחקר קליני מעורבים איטי/עני המגיבים, כמעט 60% של בתחילה הציר-שלילי אוציטים פיתח אות הציר לפני PLM מחדש בדיקה כ 2 h מאוחר יותר9. בהתאם לשלב ההתפתחותי והכושר הכולל של התבגרות מאוחרת, מראה ציר MII לאחר PB ההבלטה בדרך כלל לוקח 2-6 h (התבוננות שלא פורסמה). Oocytes מציג גשר מיקרוכדורית (אנאפיום/telophase כיתה D) במהלך הבדיקה PLM הראשון דורשים זמן רב יותר לפתח אות MII ציר מאשר oocytes ללא צירים גלויים (הצירים המתעוררים, כיתה C). התאמה אישית של הזמן של ICSI לשלב ההתפתחותי של הביצית מונע הפעלה מוקדמת של oocyte ותוצאות שיעור הדישון משופר ופיתוח העובר מוצלחת9.

למרות מאוחר התבגרות oocytes הבלטת ממד ב-PB באופן כללי יש יכולת התפתחותית נמוכה יותר מאשר ב vivo התבגר oocytes, שיעור התפתחות העובר מקובל אם הם מצליחים להרכיב ציר לזיהוי לפני העיכוב ICSI (הבלסטלציה קצב של41.32%) באמצעות גישה זו, אפילו oocytes בוגרים, אשר נדחים בדרך כלל לטיפול בפוריות, יכול להיות מנוצל קלינית, לייצר עוברים הניתנים להעברה, ולהצמיח לטווח מלא הריונות. הערכה של השלב המטוריאני של כל oocyte הפרט הוא מועיל במיוחד במחזור פרוגנוזה נמוכה מניב מספר קטן של MII oocytes ו/או לאחר ביצוע הצלה התבגרות מתורבת של ooציטים בלתי בוגרים9.

מלבד הערכת בגרות ביצה, הדמיה ציר מומלץ גם לפני ביופסיה PB כדי למנוע השמדת הצירים בתוך האני/telophase האוציטים. באמבריולוגיה ניסיוני, ההדמיה של הציר המיוטי משמשת במהלך העברת ביצים ו/או הליך העברה של ציר13.

Figure 1
איור 1: ההבשלה של האדם האנושי. ב vivo הבשיל oocytes (MII) מוצג PB בזמן האחזור. בלתי בוגר oocytes (GV, MI) יכול להשלים באופן ספונטני התבגרות מבחנה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: סיווג Oocyte מבוסס על תבנית PLM-זיהה. דוגמאות מייצגות של ציונים בעלי כישור (A-D) לפי המראה של אות הציר. תבנית מזוהה PLM: (A) אות בולטת של ציר דו קוטבי, (ב) שקוף ציר הציר mii, (ג) לא לזיהוי ציר, ו (ד) מיקרוטובית גשר. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שלבים של MI כדי מעבר MII בהבשלה האוסטטה. המראה של oocytes בשדה בהיר (בשורה העליונה), בשילוב עם אות פלואורסצנטית של כרומוזומים (ציאן) ו microtubules (מגנטה) (שורה אמצעית), ו באור מקוטב (בשורה התחתונה) מוצג. כל אוסטליט היה הראשון PLM בדק ומיד תוקן. אוציטים קבוע (אימונוcytes) עם תווית הופסט (DNA) ו anti-α-טובולין נוגדן (microtubules). החץ הצהוב מציין את הנוכחות של PB ואת החץ הלבן מדגיש את המיקום של microtubules ביניים. סרגל קנה מידה = 20 μm. דמות זו שונתה מ הולבטיקובה ואח ', JARG 20199. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הקורלציה של הארגון כרומוזום מיקרוטוכדורית עם דפוס שבירה זוהה על ידי מיקרוסקופ אור מקוטב. המראה של האוציטים בשדה בהיר בשילוב עם אות פלורסנט עבור כרומוזומים (ציאן) ו microtubules (מגנטה) (השורה העליונה), ו באור מקוטב (בשורה התחתונה) מוצג. כל האוציט תוקן מיד לאחר בחינת PLM. דנ א (הואכסט) ומיקרוטוכדורית (α-טובולין) היו מוכתמים. (A-C) oocytes עם ציר plm לזיהוי כרומוזומים לא מיושרים (a, B) או מעמודי צירים ממוקדים באופן רופף (C); (D-F) לא נורמלי האוציטים ללא הצירים plm-לגילוי mii מראה לא מפותח (ד), אפאר (E) או לא ציר (F). החץ הלבן מדגיש את המיקום של microtubules מיקרו, ו כוכבית (*) מציין את המיקום של פירוק כרומטין. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שבירה מבנים באוציטים אנושיים. דוגמאות מייצגות של (A-D) מבנים שבירה שזוהו על ידי plm ב-האדם האוציטים. ZP = סונה פלידה; PM = ממברנה פלזמה (oolema); . גוף שבירה, שואבי אבק חץ לבן, ציר מיוטי. בשלבים שונים של התבגרות (ה) mii ציר שגוי עם גוף הקוטב (PB). (ו) ציר התנתקות מקרום הפלזמה. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

משלים איור 1: פריסת שולחן העבודה של תוכנת ניתוח תמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים: הליך בדיקה PLM. סיבוב של oocyte נדרש כדי להוציא את הנוכחות של ציר (חץ). סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

הציר הגבוה ביותר של האוציטים בתאי האדם הוא דינמי מאוד ומבנה עדין1. בתנאים מיטביים, הסיבים המיקרוכדורית מהירים במהירות וצירים מיוכטיים מכילים30,31,32,33. מכאן, חשוב באופן ביקורתי כדי להבטיח כי התרבות oocyte ותנאי המיקרומניפולציה, כלומר טמפרטורה ו-pH הם בטווח האופטימלי. כדי למזער את הסיכון של שיבוש ציר, את oocytes יש לשמור בסביבה טמפרטורה מבוקרת שמירה על 37 ± 0.5 ° צ' במדיה oocyte. השימוש במיקרוסקופים ובכיוונון מיקרוהזרקה המצויד בשלב מחומם הינו נדרש בלבד. כל מניפולציה עם oocytes מחוץ לחממה חייב להתבצע ב HEPES/מחלק מדיה באגירה כדי למנוע האוספים של pH. כדי למנוע תופעות לוואי פוטנציאליות של oocyte מוגזמת מסירת במצב הסביבה, הזמן הכולל של בדיקת PLM לא יעלה על 10 דקות. Oocytes צריך להיות מנותח על הצלחת התחתונה זכוכית עם מכסה פלסטיק הסיר מכיוון מיקום של פלסטיק רגיל בנתיב הקורה פוגע בניתוח תמונה. מכיוון פלסטיק זכוכית מנות בתחתית יש מאפיינים תרמיים שונים, הטמפרטורה יש לבדוק ישירות טיפות של טיפול בינוני בצלחת הבדיקה.

בנוסף לתנאי מעבדה, הבדלים פרוצדורליים וכישורי המיקרומניפולציה של המפעיל יכולים להשפיע על דיוק הבדיקה PLM. רק הצירים דו קוטבית מורכבים ביותר יכולים להיות מאוד לא פולשני. האות הנצפה פרופורציונאלית לדרגת הארגון המבני של הציר. נייסנט, אפאר, שחרר או עיוות הצירים מציגים רק שבירה מטושטשת או כלום בכלל (איור 3 ואיור 4). מלבד זאת, יישור לא מושלם של אור מקוטב עם מערכים זעירים מייצר רק מעבר שקוף ומוגדר למחצה, למרות הנוכחות הממשית של ציר דו-קוטבי מפותח (איור 4). אלא אם כן מונחה כראוי, אות הציר עשוי להיות מחמיץ בקלות הבגרות oocyte שאובחנו (וידאו משלים). עבור הדמיה הציר האופטימלי, oocyte צריך להיות כראוי סובב סביב כל ציר. מאז שבירה אינו גלוי בחתיכות עיניים, המפעיל צריך לצפות במסך המחשב תוך ביצוע סיבוב של oocyte. הניסיון הקודם עם מיקרומניפולציה והכשרה של הדמיה ציר העודף בתוך מבחנה הבשיל מתורבת הוא רצוי לפני מעבר ליישום קליני.

מלבד הציר, התאים קומולוס המקיפים את oocyte, oocyte, השכבה הפנימית של הסונה pellucida וכמה מבנים cytoplasmic (למשל, גופים שבירה, וחללים) התערוכה שבירה (איור 5A-D). אלא אם הוסר ביסודיות מן oocyte לפני הדמיה, תאים הזקיקים מחובר היטב לייצר רעשי רקע ולהתפשר זיהוי ציר meiotic. היזהרו לא לטעות גוף שבירה גדול עבור ציר. הכללות cytoplasmic רבים המתגוררים בציטופלסמה להציג בהירות גבוהה אשר ניגודים בחדות עם הרקע הכהה. הציר המיוטי, מצד שני, מוצג אות מתון בלבד, גבולות מטושטשים ובדרך כלל מתחבר ל-oolema מתחת או בסמוך ל-PB הראשון. מדי פעם, בדיקת PLM חושף סטייה ציר גולמי ממיקומה הסטנדרטי (איור 5E, F). אם יש חוסר התאמה משמעותי בין מנגנון החילוק ו PB, PLM עוזר לכוון את oocyte כדי למנוע את הסיכון של פציעה ציר במהלך מיקרוהזרקה. המיקום היחסי של הציר בתוך ה-oocyte אינו משפיע על הפוטנציאל ההתפתחותי של העוברים הנובעים17,34. עם זאת, כאשר הציר מתנתק מהאורמה, מומים דישון מתרחשים. באופן מעניין, כמה אוציטים באיכות ירודה עוברים ניתוח כרומטין מיד לאחר שחול ה-PB במקום להתחיל בתהליך המיקרו-כדורית (איור 4F). באמצעות מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו-PB כמו הסמן היחיד של בגרות oocyte, כגון זה sub-המוסמכת oocytes ייחשב fertilizable. כך, על גבי הערכה מורפולוגית שגרתית, הדמיה ציר מוסיף מידע חשוב על בגרות של ביצה יכול לשמש כסמן עקיף של האיכות שלה.

השכיחות של מסתובב MII oocytes הוא עשוי להיות מושפע מאפיינים של אוכלוסיית המחקר (למשל, רקע גנטי, מצב רפואי, גיל אימהי). בנוסף, החלק של הפיתוח התעכב oocytes בתוך הקוציטים ישפיע על מספר בפועל של הציר השלילי של כישור-שליליהתשעה,27. הדמיה ציר מיוטיק מאפשר לזהות בבירור fertilizable oocytes נעצר בשלב MII. יתר על כן, הבדיקה השנייה במועד מאוחר יותר עשוי לגלות אם הציר השלילי של הפלך הוא חריג או רק לאחרונה התקדמה באמצעות MI/mii מעבר9,10,11. כאשר מותר לפתח ציר לפני ICSI, אפילו אוציטים בוגרות, אשר מושלך באופן שגרתי, יכול לייצר עוברים קיימא9. במחזורים עם מעטים מאוד oocytes זמינים עבור הפריה, דק מתוזמן ICSI של הבלטת ממד של oocytes בתוך PB יכול לשמש כאסטרטגיית הצלה חלופה לביטול מחזור.

עם זאת, הארכת זמן טרום הדגירה לא צריך להיות כללית על כל האוציטים. ב vivo התבגר oocytes מן המגיבים הנורמליים בדרך כלל התערוכה מיאני ציר9,20,21,27. כאן, הסיכוי של הדמיה מוצלחת הציר פוחתת עם הזמן כתוצאה של post-ovulatory בהזדקנות מבחנה35. אם אפשרי, icsi יש לבצע ביום של אחזור ולא יעלה על 9 שעות (45 שעות פוסט hCG), התקופה המשויכת עם ירידה באיכות העובר כתוצאה36,37. Oocytes הצגת הצירים דו קוטבית ברורים צריך להיות נתון ICSI ללא עיכוב נוסף. לסיכום, אופטימיזציה אישית של העיתוי ICSI כדאי בחולים פרוגנוזה נמוכה להוציא כל סיכון של הזרקת זרע מוקדמת. עם זאת, זה לא נחוץ, זמן רב מדי ומפרך להתבצע בכל מחזורי IVF.

ניתוח PLM מגלה אם oocyte הגיע לשלב MII. עם זאת, הדמיה לא פולשנית של ציר meiotic אינו מספק מידע אודות ארגון כרומוזום. יכול להיות חמור בכרומוזום שגוי ו/או הקשורים גיל הקשורות כרומאטיד הקשור oocytes הכולל ציר דו קוטבית (איור 5). גורמים אחרים שונים יש השפעה משמעותית על הצלחה רבייה (למשל, גורם זרע, המיטוקטורים, הפעלת הגנום העובריים, מחשוף סדיר, אפיגנטיקה, רירית הספר, חסינות אימהית). לכן, זיהוי ציר MII למשל, אינו מבטיח תוצאה קלינית חיובית של הליך IVF.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנחנו רוצים להודות למעבדה האמבריולוגיה של האינטרנציונל החדש. אנו מכירים גם את מתקן הליבה CELLIM של CEITEC נתמך על ידי MEYS CR (LM2015062 צ'כית-Bioimaging) עבור התמיכה שלהם עם השגת נתונים הדמיה immunofluorescence הציג כאן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin Irvine Scientific 90164 bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture
Denuding micropipette 150 µm Microtech IVF 005-150C
Denuding micropipette 180 µm Microtech IVF 005-180B suitable for oocyte transfer between dishes
Denuding micropipette 200 µm Microtech IVF 005-250-A suitable for oocyte transfer between dishes
FluoroDish World Precision Instruments FD 5040-100 glass-bottom dish
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells)
Holding micropipette Microtech 001-120-30 sterile glass microneedles
Hyaluronidase solution Irvine Scientific 90101 for oocyte denudation
ICSI micropipette Microtech 002-5-30 sterile glass microneedles
Micro Droplet Culture Dish Vitrolife 16003 12-well plate for embryo culture
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin Irvine Scientific 90163 handling medium, MOPS/HEPES buffered
Nikon Eclipse TE 2000-U Nikon inverted microscope with heated stage
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 150270 plastic ICSI dish
Nunc non-treated 4-well IVF dish Thermo Fisher Scientific 179830 4-well plate for embryo culture
OCTAX polarAide MTG integrated PLM system
Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305 oil for overlay
Polyvinylpyrrolidone Irvine Scientific 90123 for sperm immobilization prior to ICSI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348, (6239), 1143-1147 (2015).
  2. Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18, (1), 1-11 (2012).
  3. Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. Springer. India, Mumbai, India. (2016).
  4. Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63, (3), 209-211 (2017).
  5. Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80, (2), 447-449 (2003).
  6. Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87, (5), 1022-1027 (2007).
  7. Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33, (11), 1501-1505 (2016).
  8. De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14, (7), 1859-1863 (1999).
  9. Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36, (3), 445-452 (2019).
  10. Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12, (4), 442-446 (2006).
  11. Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17, (4), 454-460 (2008).
  12. Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7, (1), 24-29 (2003).
  13. Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
  14. Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5, (2), 117-124 (2002).
  15. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75, (2), 348-353 (2001).
  16. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16, (7), 1464-1468 (2001).
  17. Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18, (4), 817-820 (2003).
  18. Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19, (3), 649-654 (2004).
  19. Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14, (2), 166-174 (2007).
  20. Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26, (3), 535-544 (2011).
  21. Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96, (2), 389-393 (2011).
  22. Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101, (2), 403-406 (2014).
  23. Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105, (4), 1085-1092 (2016).
  24. ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31, (4), 685-686 (2016).
  25. Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
  26. Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13, (5), 661-667 (2006).
  27. Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18, (6), 1289-1293 (2003).
  28. Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16, (2), 232-238 (2008).
  29. Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19, (1), 55-62 (2011).
  30. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16, (11), 2374-2378 (2001).
  31. Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12, (1), 65-70 (2004).
  32. Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19, (5), 1148-1154 (2004).
  33. Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37, (3), 279-290 (2018).
  34. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17, (1), 34-45 (2011).
  35. Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15, (5), 573-585 (2009).
  36. Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33, (5), 797-806 (2018).
  37. Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13, (8), 2223-2226 (1998).
הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).More

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter