Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Human egg modenhet vurdering og klinisk anvendelse

doi: 10.3791/60058 Published: August 19, 2019

Summary

Vi gir en oversikt over den kliniske protokollen for ikke-invasiv vurdering av Human egg modenhet ved hjelp av polarisert lys mikroskopi.

Abstract

Den optimale tidspunktet for Intracytoplasmatisk sperm injeksjon (ICSI) er av en alvorlig bekymring for fruktbarhet programmer fordi ubeleilig sperm oppføring avtar egget er utviklingsmessige kompetanse. Tilstedeværelsen av den første Polar kroppen (PB) sammen med meiotic spindelen indikerer fullføring av oocyte modning og egget er beredskap for befruktning. I klinisk praksis er det vanlig å anta at alle oocytter som viser en PB er modne metafase (MII) oocytter. Men, PB ekstrudering forut dannelsen av bipolar MII spindel. Dette asynchrony gjør bare tilstedeværelsen av PB en upålitelig markør av oocyte modenhet. Ikke-invasiv spindel avbildning ved hjelp av polarisert lys mikroskopi (PLM) gir rask og enkel inspeksjon av om PB-visning oocyte faktisk satt sammen igjen en meiotic spindel før ICSI. Her presenterer vi en standard protokoll for å utføre menneskelige egg modenhet vurdering i klinisk laboratorium. Vi viser også hvordan du optimaliserer tiden for ICSI med hensyn til oocyte utviklingstrinn for å hindre prematur sperm injeksjon av sen-modning oocytter. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan selv umodne oocytter ekstrudering PB in vitro være klinisk utnyttet. Bekreftelse på at MII spindel er til stede før sperm injeksjon og individuell justering av tiden av ICSI er spesielt viktig i dårlig prognose in-vitro befruktning (IVF) sykluser med et lavt antall oocytter tilgjengelig for befruktning.

Introduction

For å bli en fertilizable haploide egg, har diploid oocyte å extrude halvparten av sin genetiske informasjon i en tilstøtende celle, kalt den første Polar kroppen (PB), og justere kromosomer i ekvator av bipolar metafase II (MII) spindel. Mens PB kan tydelig observeres av konvensjonell lys mikroskopi, påvisning av genetisk materiale og cytoskjelettkomponenter strukturer krever vanligvis invasiv forberedende prosedyrer som er uforenlig med oocyte videre bruk for fruktbarhet behandling. Derfor, i klinisk praksis, er tilstedeværelsen av PB anses som et kjennetegn på oocyte modenhet. Men Live Imaging av mikrotubulinettverket og kromosom dynamikk under menneskelig oocyte modning avslørte at PB blir synlig et par timer før bipolar MII spindel er montert og kromosomer er justert1. Likevel, i den overførte lys, MII arrestert egg er umulig å skille fra oocytter som bare gikk inn i prosessen med kromosom segregering. Således, en kohort av oocytter, klassifisert som MII oocytter basert bare på PB tilstedeværelse, kan inneholde latematuring oocytter som ennå ikke har fullført sin utvikling og dermed ikke er klar for befruktning.

Forsinkelsen av oocyte modning er sannsynlig å påvirke befolkningen av fattige respondere med et lavt antall MII oocytter og en høy andel av umodne oocytter samlet uventet i stimulert sykluser2. In vivo, bare en enkelt, best kvalitet egg oppnår modenhet og blir ovulated. I in-vitro befruktning (IVF) sykluser, kontrollerte eggstokkene hyperstimulering brukes til å rekruttere flere oocytter for modning. Gonadotropin surge utløser en gjenopptakelse av meiotic programmet og egg forfedre er ment å nå MII arrest scenen innen 36 timer3. Men oocytter Hentet fra preovulatory sekkene ofte utgjør et utvalg av PBdisplaying MII oocytter og umodne oocytter, enten ved metafase jeg (MI) eller Germinal vesicle Stadium (GV) (figur 1). Bare MII oocytter er utsatt for Intracytoplasmatisk sperm injeksjon (ICSI) mens umodne oocytter vanligvis kastes. Likevel, når dyrket in vitro, MI oocytter er ofte observert å extrude PB in vitro. Til tross for deres generelle mindre verd, sent-modning oocytter som spontant fullførte den første meiotic divisjonen under overnight kulturen har blitt brukt som siste ressurs oocytter, og levende fødsler har blitt rapportert4,5 ,6,7,8. Derfor, den altfor tidlige injeksjon av sperm kan være en primær årsak underliggende dårlige utviklingsmessige utfall av sen-modning oocytter rapportert i tidligere studier9,10,11.

Polarisert lys mikroskopi (PLM) kombinert med et bildebehandling programvare muliggjør ikke-invasiv visualisering av meiotic spindel i live oocyte. Den doble refleksjon er generert av samspillet mellom polarisert lysstråle med den svært bestilte montering av mikrotubuli bygge bipolar spindel. Siden det polariserte lyset er av normal intensitet, kan teknikken trygt brukes i kliniske innstillinger for å vise dynamikken i divisjons apparatet11,12,13,14. Tilstedeværelsen av MII spindel birefringence innenfor oocyte har blitt identifisert som en markør av et egg ' s utviklingsmessige kompetanse9,15, 16,17,18, 19,20,21,22,23. Dermed har det blitt antydet at ikke-invasiv meiotic spindel Imaging kan brukes til egg kvalitetskontroll i klinisk praksis11,14,20.

Siden tidslinjen for microtubular dynamikk under oocyte meiose har blitt løst1, det observerte PLM mønsteret kan være bedre relatert til den tiden løpet av mi til MII overgangen. Kort tid etter PB utslipp, den begynnende MII spindel blir undetectable av PLM. Men hvis oocytter holdes i kulturen, birefringence signalet kan dukke opp senere når bipolar MII spindel setter sammen9,10,11. Således, i oocytter ekstrudering en PB in vitro, fravær av spindelen kan være bare midlertidig tilsvarende den fysiologiske overgangen av sen-modning oocyte fra MI til MII scenen. Hvis MII spindel signalet er undetectable, sperm injeksjon kan utsettes til et senere tidspunkt gir ekstra tid for MII spindel formasjon. PLM-støttet optimalisering av ICSI tid maksimerer sjansen for sen-modning oocytter å bli klinisk utnyttet og gjøre en forskjell for dårlig prognose pasienter9.

Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for hvordan man utfører ikke-invasiv spindel avbildning i humant oocytter. Vi viser også hvordan PLM kan anvendes for å unngå risikoen for tidlig befruktning av sen-modning oocytter.

Protocol

Denne protokollen beskriver den kliniske prosedyren som er en "add-on" til standard IVF-behandling. Det bør utføres av erfarent personell i samsvar med god laboratoriepraksis og kliniske retningslinjer24,25. Det anbefales å innhente skriftlig informert samtykke fra kvalifiserte pasienter. Denne protokollen ble godkjent av den institusjonelle etikk komitéen.

1. egg henting og denudation

  1. Indusere stimulering av eggstokkene ved hjelp av konvensjonelle stimulering protokoller3. Juster dosen til individuell respons. Når to eller flere hårsekker, som kan visualisere ved ultralyd skanning, nå en diameter på 18 mm, induserer oocyte modning med anvendelse av 250 μg humant gonadotropin (hCG). Planlegg oocyte henting (OPU) ved 35 − 36 timer etter hCG-injeksjon.
  2. Samle Hentet Cumulus-oocyte komplekser (Kombinasjonspiller) i CO2-Independent håndtering medium (tabell av materialer). Etter en kort inkubasjonsperiode (10 − 15 min) i en CO2-uavhengig inkubator, kort (opptil 30 s) utsette samlet kombinasjonspiller å Hyaluronidase løsning (tabell av materialer). Under en stereomikroskopet, mekanisk fjerne Cumulus-Corona celler ved forsiktig pipettering Kombinasjonspiller med en 200 μL filter spissen.
  3. Ved å bruke denudation Mikropipetter med en gradvis synkende diameter (200 μm, 180 μm og 150 μm), fjerner du forsiktig oocytter fra de resterende follikulær cellene og vasker oocytter 3x i håndterings medium.
  4. Vurdere antall og utviklingsmessige status for var avdekt oocytter i henhold til tilstedeværelse eller fravær av kjernen og første PB (figur 1).
  5. Sjekk inkluderings kriteriene for PLM-undersøkelse. Gjennomføre en egg modenhet vurdering hvis det er (1) en uventet dårlig respons på konvensjonell stimulering med færre enn 6 MII oocytter samlet på OPU og (2) en historie med tidligere befruktning svikt eller oocyte umodenhet.
  6. Plasser GV, MI og MII-oocytter i separate brønner i en IVF-rett, som hver inneholder 500 μL av preequilibrated CO2-avhengige kultur medium (tabell av materialer) dekket med mineralolje (tabell av materialer).
  7. Ruge for ytterligere 3 − 4 h ved 37 ° c i en fuktet atmosfære på 5% O2 og 6% co2.

2. forberedelse for PLM-undersøkelse og påfølgende ICSI

Merk: protokollen som beskrives her, beskriver PLM-vurderingen som utføres ved hjelp av OCTAX Polar AIDE-systemet (tabell med materialer). Alternativt kan andre kommersielt tilgjengelige spindel vise systemer brukes.

  1. Forbered plater for embryo dyrking.
    1. Avhengig av antall oocytter som skal undersøkes (totalt av MII-oocytter, og MI-oocytter ekstrudering en PB i løpet av preinkubering perioden), klargjør du enten en 4-brønn plate eller en 12-brønn plate, fyller hver brønn med 500 μL eller 30 μL av kultur medium, henholdsvis , og dekk med tidligere equilibrated mineralolje.
    2. Sørg for at både kultur medium og mineralolje har blitt equilibrated i CO2 inkubator over natten. Oppbevar den tilberedte parabolen i CO2-avhengige inkubator for minst 2 h. Number brønnene om nødvendig for å spore den utviklingsmessige skjebnen til individuelle oocytter.
  2. Forbered ICSI parabolen.
    1. Bruk tildelt plast rett og gjør 5 μL dråpe prewarmed håndterings medium for hver PB-visning oocyte og en ekstra dråpe for nål vasking. Lag en ekstra dråpe polyvinylpyrrolidon (PVP) løsning (tabell av materialer) for sperm IMMOBILISERING før ICSI (Legg sperm like før ICSI) og overlegg med prewarmed mineralolje.
    2. Hold forberedt ICSI parabolen i CO2-uavhengige inkubator i minst 20 min. Number brønnene om nødvendig for å spore OOCYTTER etter ICSI.
  3. Forbered PLM eksamen parabolen.
    1. Bruk tildelt glassbunn parabol og gjøre 5 μL dråper av prewarmed håndtering medium for hver PB-visning oocyte. Overlegg med prewarmed mineralolje.
    2. Hold parabolen i CO2-uavhengige inkubator i minst 20 min. Number dråpene om nødvendig for å spore OOCYTTER etter PLM undersøkelse.
  4. Still inn mikroskopet klart for PLM-undersøkelse.
    1. Slå den oppvarmede scenen på invertert mikroskop på godt i forveien for å oppnå riktig oppvarmings temperatur. Kontroller at innstillingene er nøyaktig justert for å opprettholde 37 ° c i håndterings medium dråpene i PLM/ICSI-parabolen under mikromanipulering prosedyrer.
    2. Monter den sterile holde-og ICSI-nålen i microinjection holdere og før dem i fokus. Alternativt kan du bruke en klekking nål.
    3. Velg riktig mål (20x og 25x er den mest egnede) og sikre at kondensatoren er i lyse felt posisjon.
    4. Sett inn grønt støyfilter (lyset blir grønt) og sett glidebryteren for flytende krystall analyse i arbeidsposisjon.
    5. Sett lukkeren til ~ 50% og Juster sirkulære polarisator for å redusere bakgrunnsstøyen.
  5. Sett datamaskinen klar for PLM undersøkelse.
    1. Startbilde behandlingsprogrammet.
    2. Velg video | Video kilde | polarAIDE i video-menyen i den øverste menylinjen.
    3. Bytt til live video ved å gå til video side og aktivere spindel og Zona analyse ved å trykke på ikonet (ekstra figur 1) i video verktøylinjen.
    4. Velg visningsmodus for dynamisk skalering under spindel avbildning: (1) rød (birefringence)/Green (bakgrunn) kombinert visning, eller (2) hvit (birefringence)/and svart (bakgrunns) visning. Den dynamiske poeng beregningsmodusen brukes til autoscoring av Zona pellucida.

3. undersøkelse av egg modenhet

  1. Etter preinkubering perioden (3 − 4 t) utfører du en PLM-undersøkelse som avslører oocyte mod Enhetsstatus på standardtidspunktet til ICSI (39 − 40 timer etter hCG Trigger).
  2. Overfør alle oocytter til individuelle dråper på PLM-fatet og plasser den under det omvendte mikroskopet som er klargjort for spindel avbildning. Husk å fjerne plast lokket fra glasset bunnen parabolen før du starter eksamen.
  3. Bring den første oocyte i fokus. Hvis det er vanskelig å søke etter cellen under grønt lys, trekker du ut det grønne filteret midlertidig. Kontroller at det grønne filteret er satt inn før analyse.
  4. Observer det oppdagede oocyte birefringence bildet (rød/oransje på grønn bakgrunn) som det er datamaskin-behandlet og vises i sanntid på dataskjermen. Husk at signalet ikke er synlig i okularet.
  5. Hvis meldingen som annonserer lys eksponering er for lav/høy dukker opp, justere lysstyrken til passende intensitet ved hjelp av mikroskopet lysstyrke knotten.
  6. Bruk en holder og ICSI nål for å slå oocyte slik at PB er i kl 12 posisjon og fokus til PB.
  7. Hvis spindel birefringence ikke er synlig ved første blikk i nærheten av PB, Drei oocyte forsiktig rundt hver akse ved litt berøring av Zona pellucida for å sikre justeringen av det polariserte lyset med array spindel fibre (supplerende video ). Erklærer fraværet av MII-spindelen så lenge oocyte ikke viser spindel signalet til tross for streng rotasjon.
  8. Basert på den observerte birefringence mønster, klassifisere oocytter inn i følgende kategorier (figur 2): (A) oocytter med lyse signal av bipolar tønne-formet MII spindel med klart avgrenset grenser og jevn fordeling av birefringence ; (B) oocytter med Dysmorfofobi, apolar og gjennomskinnelig MII-spindel med uregelmessige grenser og ujevn fordeling av signalet; (C) oocytter uten synlig MII spindel birefringence i ooplasm;   (D) anaphase I/telophase jeg oocytter, viser en microtubular bro (en binde tråd mellom første PB og oocyte) i stedet for MII spindel.
    Merk: oocyte med synlig MII spindel signal (klasse A eller B) er egnet for umiddelbar ICSI.
  9. Ta et øyeblikksbilde (F9) eller ta opp video for en rapport og/eller påfølgende bildeanalyse. Behold dokumentasjon av bilde mønsteret for å redusere subjektivitet til operatøren.
  10. Flytt til posisjonen til neste oocyte og gjenta trinn 3.6 − 3.9.

4. optimalisere ICSI timing

  1. Overfør alle spindel-positive oocytter (Grade A eller B, trinn 3,8) inn i ICSI parabolen og underlagt dem til ICSI i henhold til standardprotokoller24,25.
  2. Hvis oocytter ikke viser noen synlig MII-spindel-signal, plasserer du PLM-retten i CO2-Independent inkubator og flytter ICSI inn i et senere tidspunkt.
  3. Utfør ny undersøkelse av PLM ~ 2 − 3 h senere følgende trinn 3.3 − 3.9. Hvis noen oocyte (er) fortsatt mangler en MII spindel, ytterligere forsinkelse ICSI for ytterligere 1 − 2 t.
  4. Overfør alle oocytter inn i ICSI parabolen og injisere dem i henhold til standardprotokoller24. Hvis PLM-parabolen er kompatibel med bøye vinkelen på microinjection nålen, utføre ICSI umiddelbart i PLM parabolen etter bytte til en lysfeltet modus.
  5. Ved ICSI, overføring oocytter til forberedt plater for embryo dyrking og kultur til blastocyst scenen.

Representative Results

Polarisert lys mikroskopi gjør det mulig å kjapt inspisere om oocyte fullført kjernefysisk modning og monterte MII spindel før ICSI. På grunn av sin ikke-invasiv karakter, kan den brukes til å trygt vurdere den menneskelige egg beredskap for befruktning i kliniske innstillinger11,12,13,14. Spindled oocytter er mer sannsynlig å gi opphav til levedyktig embryo enn oocytter uten en spindel9,15,16,17,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23. også oocytter med en distinkt bipolar spindel synes å ha en høyere utviklingsmessige kompetanse enn oocytter med Dysmorfofobi aksling9,21,22. Tatt sammen, kan spindel Imaging tjene som et verktøy for å identifisere oocytter med størst potensial til å bli vellykket befruktet, gjennomgår Preimplantation utvikling og støtte full sikt graviditet9,15, 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23på.

Den rapporterte forekomsten av spindelen varierer (44 − 97%) reflekterer mangfoldet av studerte befolkning9,15,16,17,18,19,20,21, 22 av , 23 andre , 26 i , 27 andre priser , 28. in vivo modnet oocytter fra normale respondere vanligvis viser bipolar MII spindel på 40 h etter HCG trigger9,18,27,29. Men i langsomme respondere, bassenget av oocytter Hentet fra preovulatory sekker er påvirket av modning forsinkelse9,27. Her bør spindel Imaging utføres for å diskriminere oocytter arrestert i MII scenen fra de gjennomgår viktige maturational overgang (Figur 3). Vi anbefaler fjerning av follikulær celler umiddelbart ved henting, og inkubasjons av MI og MII oocytter i separate brønner for å kunne skille in vivo modnet oocytter og sen-modning oocytter ekstrudering PB in vitro, kort tid før ICSI. I tilfelle denudation utføres like før ICSI, er disse to populasjoner av oocytter skilles basert på PB utseende.

Den fase spesifikke endringer av PLM mønsteret skal tolkes i sammenheng med kunnskap om spindel dynamikk under meiotic modning. Under interkinesis gjennomgår divisjons apparatet omfattende strukturelle omorganisering og PLM signal midlertidig forsvinner1,9,10,11. Således, inne developmentally forsinket oocytter ekstrudering PB inne vitro, fraværet av det MII spindel signal kanskje ikke nødvendigvis reflektere Cellular forstyrrelse bortsett fra den kunne gi uttrykk for det oocyte ' progresjon fra MI å MII scene (skikkelsen 3). Hvis sæden injiseres på et unfysiologisk tidspunkt, er egget utviklingsmessige potensialet kompromittert. Utsette ICSI gir sen-modning oocytter med mer tid til å sette sammen en MII spindel hvis tilstedeværelse er forbundet med bedre kliniske resultater9,10,11. I den kliniske studien som involverte langsom/fattig respondere, utviklet nesten 60% av første spindel-negative oocytter spindel signal før PLM Re-eksamen ca 2 h senere9. Avhengig av utviklingstrinn og generelle egnethet av sen-modning oocytter, den MII spindel utseende etter PB ekstrudering vanligvis tar 2 − 6 t (upublisert observasjon). Den oocytter viser en mikrotubulinettverket bro (anaphase/telophase, grade D) under den første PLM eksamen krever en lengre tid å utvikle MII spindel signal enn oocytter uten synlige spindel (nye aksling, grade C). Individuell justering av tiden av ICSI til egget er utviklingstrinn hindrer tidlig aktivering av oocyte og resulterer i en forbedret befruktning og vellykket embryoutvikling9.

Selv om sen-modning oocytter ekstrudering PB in vitro generelt har en lavere utviklingsmessige kompetanse enn in vivo modnet oocytter, er graden av embryoutvikling akseptabelt hvis de klarer å sette sammen en synlig spindel før forsinket ICSI (blastulation rate på 41,32%9. Ved hjelp av denne tilnærmingen, selv umodne oocytter, som normalt avvises for fruktbarhet behandling, kan være klinisk utnyttet, produsere overførbar embryo, og gi opphav til full-term svangerskap. Evaluering av den maturational fasen av hver enkelt oocyte er spesielt gunstig i dårlig prognose sykluser gir et lite antall MII oocytter og/eller etter å ha utført en redning in vitro modning av umodne oocytter9.

Bortsett fra egg modenhet vurdering, er spindel Imaging også anbefalt før PB biopsi for å unngå spindel ødeleggelse i anaphase i/telophase oocytter. I eksperimentell embryologi brukes visualisering av meiotic spindel under egg utskraping og/eller spindel overførings prosedyre13.

Figure 1
Figur 1: Human oocyte modning. In vivo modnet oocytter (MII) utstillingen PB på tidspunktet for henting. Umodne oocytter (GV, MI) kan spontant fullføre modning in vitro. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: oocyte klassifisering basert på PLM-oppdaget mønster. Representative eksempler på oocyte karakterer (A-D) basert på utseendet på spindel signalet. PLM-oppdaget mønster: (A) fremtredende signal av bipolar spindel, (B) gjennomskinnelig apolar MII spindel spindel, (C) ingen synlig spindel, og (D) mikrotubulinettverket bro. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: stadier av mi til MII overgangen i oocyte modning. Utseendet til oocytter i skarpt felt (øverste rad), kombinert med et fluorescens signal av kromosomer (cyan) og mikrotubuli (magenta) (midtre rad), og i polarisert lys (nederste rad) vises. Hver oocyte ble først PLM-undersøkt og umiddelbart fast. Faste oocytter var (Immuno) merket med Hoechst (DNA) og anti-α-tubulin antistoff (mikrotubuli). Den gule pilen viser tilstedeværelsen av PB og den hvite pilen fremhever posisjonen til birefringent mikrotubuli. Scale bar = 20 μm. Dette tallet er endret fra Holubcová et al., JARG 20199. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: korrelasjon av kromosom-mikrotubulinettverket organisasjon med birefringence mønster oppdages av polarisert lys mikroskopi. Utseendet til oocytter i det lyse feltet kombinert med et fluorescerende signal for kromosomer (cyan) og mikrotubuli (magenta) (øverste rad), og i polarisert lys (nederste rad) vises. Hver oocyte ble fikset umiddelbart etter PLM-eksamen. DNA (Hoechst) og mikrotubulinettverket (α-tubulin) ble flekkete. (A-C) OOCYTTER med PLM-synlig spindel ennå feiljustert kromosomer (A, B) eller løst fokuserte spindel stolper (C); (D-F) unormal OOCYTTER uten PLM-synlig MII-spindel som viser underutviklet (D), apolar (E) eller ingen spindel (F). Den hvite pilen fremhever plasseringen av birefringent mikrotubuli, og stjerne (*) indikerer posisjonen til decondensed kromatin. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Birefringence strukturer i menneskelig oocytter. Representative eksempler på (A-D) birefringent strukturer oppdaget av PLM i humant oocytter. ZP = Zona pellucida; PM = plasma membran (oolema); RB = refractile kropper, vakuoler. Hvit pil, meiotic spindel i ulike stadier av modning. (E) MII-spindel forskyvning med Polar legeme (Pb). (F) spindel avløsning fra plasma membran. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: desktop layout av bildet analyseprogramvare. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende video: PLM undersøkelse prosedyre. Rotasjon av oocyte er nødvendig for å utelukke tilstedeværelsen av spindelen (pilen). Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Acentrosomal meiotic spindel i menneskets oocytter er svært dynamisk og en delikat struktur1. Under suboptimal forhold, mikrotubulinettverket fibrene raskt depolymerize og meiotic spindel deler opp30,31,32,33. Derfor er det kritisk viktig å sikre at oocyte kultur og mikromanipulering forhold, nemlig temperatur og pH er i optimal rekkevidde. For å minimere risikoen for spindel forstyrrelser, bør oocytter oppbevares i et temperatur kontrollert miljø som opprettholder 37 ± 0,5 ° c i det oocyte mediet. Bruk av mikroskop og microinjection oppsett utstyrt med et oppvarmet stadium er strengt nødvendig. All manipulering med oocytter utenfor inkubator må utføres i HEPES/MOPPER-bufrede medier for å unngå pH-fluctulations. For å unngå mulige bivirkninger av overdreven oocyte levere i ambient tilstand, bør den totale tiden av PLM eksamen ikke overstige 10 minutter. Oocytter må analyseres på glasset bunnen parabolen med plast lokket fjernet fordi posisjonering av en standard plast i strålen banen svekker bildeanalyse. Fordi plast og glassbunn retter har ulike termiske egenskaper, bør temperaturen sjekkes direkte i dråpene av håndtering medium i eksamen parabolen.

I tillegg til laboratorieforhold, prosessuelle forskjeller og operatørens mikromanipulering ferdigheter kan ha en innvirkning på PLM eksamen nøyaktighet. Bare svært sammensatte bipolar aksling kan være invasivt visualisere. Observert signal er proporsjonal med graden av strukturell organisering av spindelen. Begynnende, apolar, løsnet eller disarrayed aksling viser bare uklare birefringence eller ingen i det hele tatt (Figur 3 og Figur 4). For resten, ufullkommen oppstilling av polarisert lyset med mikrotubulinettverket oppstille produserer bare en gjennomskinnelig og dårlig definerte birefringence til tross for det faktisk tilstedeværelse av welldeveloped bipolar spindel (skikkelsen 4). Med mindre riktig orientert, kan spindel signalet være lett savnet og oocyte modenhet feildiagnostisert (supplerende video). For optimal spindel avbildning, må oocyte være riktig snudd rundt hver akse. Siden birefringence er ikke synlig inne okularene, operatøren har å ur computeren skjermen stund utføre omdreining av det oocyte. Tidligere erfaring med mikromanipulering og opplæring av spindel avbildning i overskudd i vitro modnet oocytter er ønskelig før du bytter til klinisk anvendelse.

I tillegg til spindel, det Cumulus celler rundt oocyte, oolema, det indre laget av Zona pellucida og noen cytoplasmatiske strukturer (f. eks, refractile organer, vakuoler) utstillingen birefringence (figur 5a-D). Med mindre grundig fjernet fra oocyte før bildebehandling, tett festet follikulær celler produsere bakgrunnsstøy og kompromiss meiotic spindel deteksjon. Vær forsiktig så du ikke feil en stor refractile kroppen for spindelen. Mange cytoplasmatiske inkluderinger bosatt i cytoplasma vise høylys styrke som kraftig kontraster med den mørke bakgrunnen. Meiotic spindel, derimot, viser bare moderat signal, uklare grenser og vanligvis festes til oolema under eller ved siden av den første PB. Noen ganger viser PLM-undersøkelsen et brutto spindel avvik fra standardposisjonen (figur 5e, F). Hvis det er en stor forskyvning mellom divisjons apparatet og PB, hjelper PLM å orientere oocyte for å unngå fare for spindel skade under microinjection. Den relative plasseringen av spindelen i oocyte ser ikke ut til å påvirke utviklings potensialet til den resulterende embryo17,34. Men når spindelen competely løsner fra oolema, oppstår befruktning unormalt. Interessant nok gjennomgår noen dårlig kvalitet oocytter kromatin decondensation umiddelbart etter PB ekstrudering istedenfor å starte mikrotubulinettverket kjernedannelse (figur 4f). Ved bruk av konvensjonelle lys mikroskopi og PB som eneste markør for oocyte modenhet, vil slike sub-kompetente oocytter betraktes som fertilizable. Således, på toppen av rutinen morfologiske vurderingen, legger spindel Imaging viktig informasjon om egget modenhet og kan tjene som en indirekte markør av sin kvalitet.

Forekomsten av spindled MII-oocytter vil trolig bli påvirket av karakteristika for studiepopulasjonen (f.eks. genetisk bakgrunn, medisinsk tilstand, mors alder). I tillegg vil andelen developmentally forsinket oocytter i kohort påvirke det faktiske antallet påviste spindel-negative oocytter. Meiotic spindel visualisering gjør det mulig å tydelig identifisere fertilizable oocytter arrestert i MII scenen. Videre kan den andre inspeksjonen på et senere tidspunkt avdekke om spindel-negative oocyte er unormal eller har bare nylig kommet gjennom mi/MII overgang9,10,11. Når lov til å utvikle en spindel før ICSI, selv umodne oocytter, som rutinemessig kastes, kan produsere levedyktig embryo9. I sykluser med svært få oocytter tilgjengelig for befruktning, fin-tidsbestemt ICSI av oocytter ekstrudering PB kan tjene som en rednings strategi og alternativ til syklus kansellering.

Likevel, utvide preinkubering tid bør ikke generalisert til alle oocytter. In vivo modnet oocytter fra normale respondere vanligvis viser en MII spindel9,20,21,27. Her synker sjansen for vellykket spindel avbildning med tiden som en konsekvens av post-ovulatory in vitro aldring35. Hvis det er mulig, bør ICSI utføres på dagen for henting og bør ikke overstige 9 timer (45 timer etter HCG), perioden forbundet med en nedgang i resulterende embryo kvalitet36,37. Oocytter viser distinkt bipolar aksling bør utsettes for ICSI uten ytterligere forsinkelser. Oppsummert er individualisert optimalisering av ICSI timing verdt i dårlig prognose pasienter å utelukke risiko for prematur sperm injeksjon. Imidlertid er det unødvendig, for tidkrevende og arbeidskrevende å bli utført i alle IVF sykluser.

PLM-analyse avslører om oocyte nådde MII-scenen. Men ikke-invasiv visualisering av meiotic spindel gir ingen informasjon om kromosom organisasjon. Det kan være alvorlig kromosom forskyvning og/eller mors alder-relaterte chromatid splitting i oocytter med en bipolar spindel (figur 5). Diverse andre faktorer har betydelig innvirkning på reproduksjon suksess (f. eks sperm faktor, mitokondrier, embryonale Genova aktivisering, uregelmessig kløft, epigenetikk, endometrium, mødre immunitet). Derfor, påvisning av MII spindel per se, garanterer ikke et positivt klinisk resultat av IVF prosedyren.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke embryologi laboratorium for Reprofit International. Vi erkjenner også kjernen anlegget CELLIM av CEITEC støttes av MEYS CR (LM2015062 tsjekkisk-Bioimaging) for deres støtte med å skaffe immunofluorescence Imaging data som presenteres her.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin Irvine Scientific 90164 bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture
Denuding micropipette 150 µm Microtech IVF 005-150C
Denuding micropipette 180 µm Microtech IVF 005-180B suitable for oocyte transfer between dishes
Denuding micropipette 200 µm Microtech IVF 005-250-A suitable for oocyte transfer between dishes
FluoroDish World Precision Instruments FD 5040-100 glass-bottom dish
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells)
Holding micropipette Microtech 001-120-30 sterile glass microneedles
Hyaluronidase solution Irvine Scientific 90101 for oocyte denudation
ICSI micropipette Microtech 002-5-30 sterile glass microneedles
Micro Droplet Culture Dish Vitrolife 16003 12-well plate for embryo culture
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin Irvine Scientific 90163 handling medium, MOPS/HEPES buffered
Nikon Eclipse TE 2000-U Nikon inverted microscope with heated stage
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 150270 plastic ICSI dish
Nunc non-treated 4-well IVF dish Thermo Fisher Scientific 179830 4-well plate for embryo culture
OCTAX polarAide MTG integrated PLM system
Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305 oil for overlay
Polyvinylpyrrolidone Irvine Scientific 90123 for sperm immobilization prior to ICSI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348, (6239), 1143-1147 (2015).
  2. Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18, (1), 1-11 (2012).
  3. Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. Springer. India, Mumbai, India. (2016).
  4. Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63, (3), 209-211 (2017).
  5. Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80, (2), 447-449 (2003).
  6. Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87, (5), 1022-1027 (2007).
  7. Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33, (11), 1501-1505 (2016).
  8. De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14, (7), 1859-1863 (1999).
  9. Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36, (3), 445-452 (2019).
  10. Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12, (4), 442-446 (2006).
  11. Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17, (4), 454-460 (2008).
  12. Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7, (1), 24-29 (2003).
  13. Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
  14. Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5, (2), 117-124 (2002).
  15. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75, (2), 348-353 (2001).
  16. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16, (7), 1464-1468 (2001).
  17. Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18, (4), 817-820 (2003).
  18. Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19, (3), 649-654 (2004).
  19. Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14, (2), 166-174 (2007).
  20. Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26, (3), 535-544 (2011).
  21. Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96, (2), 389-393 (2011).
  22. Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101, (2), 403-406 (2014).
  23. Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105, (4), 1085-1092 (2016).
  24. ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31, (4), 685-686 (2016).
  25. Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
  26. Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13, (5), 661-667 (2006).
  27. Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18, (6), 1289-1293 (2003).
  28. Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16, (2), 232-238 (2008).
  29. Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19, (1), 55-62 (2011).
  30. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16, (11), 2374-2378 (2001).
  31. Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12, (1), 65-70 (2004).
  32. Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19, (5), 1148-1154 (2004).
  33. Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37, (3), 279-290 (2018).
  34. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17, (1), 34-45 (2011).
  35. Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15, (5), 573-585 (2009).
  36. Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33, (5), 797-806 (2018).
  37. Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13, (8), 2223-2226 (1998).
Human egg modenhet vurdering og klinisk anvendelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).More

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter