Vi gir en oversikt over den kliniske protokollen for ikke-invasiv vurdering av Human egg modenhet ved hjelp av polarisert lys mikroskopi.
Den optimale tidspunktet for Intracytoplasmatisk sperm injeksjon (ICSI) er av en alvorlig bekymring for fruktbarhet programmer fordi ubeleilig sperm oppføring avtar egget er utviklingsmessige kompetanse. Tilstedeværelsen av den første Polar kroppen (PB) sammen med meiotic spindelen indikerer fullføring av oocyte modning og egget er beredskap for befruktning. I klinisk praksis er det vanlig å anta at alle oocytter som viser en PB er modne metafase (MII) oocytter. Men, PB ekstrudering forut dannelsen av bipolar MII spindel. Dette asynchrony gjør bare tilstedeværelsen av PB en upålitelig markør av oocyte modenhet. Ikke-invasiv spindel avbildning ved hjelp av polarisert lys mikroskopi (PLM) gir rask og enkel inspeksjon av om PB-visning oocyte faktisk satt sammen igjen en meiotic spindel før ICSI. Her presenterer vi en standard protokoll for å utføre menneskelige egg modenhet vurdering i klinisk laboratorium. Vi viser også hvordan du optimaliserer tiden for ICSI med hensyn til oocyte utviklingstrinn for å hindre prematur sperm injeksjon av sen-modning oocytter. Ved hjelp av denne tilnærmingen, kan selv umodne oocytter ekstrudering PB in vitro være klinisk utnyttet. Bekreftelse på at MII spindel er til stede før sperm injeksjon og individuell justering av tiden av ICSI er spesielt viktig i dårlig prognose in-vitro befruktning (IVF) sykluser med et lavt antall oocytter tilgjengelig for befruktning.
For å bli en fertilizable haploide egg, har diploid oocyte å extrude halvparten av sin genetiske informasjon i en tilstøtende celle, kalt den første Polar kroppen (PB), og justere kromosomer i ekvator av bipolar metafase II (MII) spindel. Mens PB kan tydelig observeres av konvensjonell lys mikroskopi, påvisning av genetisk materiale og cytoskjelettkomponenter strukturer krever vanligvis invasiv forberedende prosedyrer som er uforenlig med oocyte videre bruk for fruktbarhet behandling. Derfor, i klinisk praksis, er tilstedeværelsen av PB anses som et kjennetegn på oocyte modenhet. Men Live Imaging av mikrotubulinettverket og kromosom dynamikk under menneskelig oocyte modning avslørte at PB blir synlig et par timer før bipolar MII spindel er montert og kromosomer er justert1. Likevel, i den overførte lys, MII arrestert egg er umulig å skille fra oocytter som bare gikk inn i prosessen med kromosom segregering. Således, en kohort av oocytter, klassifisert som MII oocytter basert bare på PB tilstedeværelse, kan inneholde latematuring oocytter som ennå ikke har fullført sin utvikling og dermed ikke er klar for befruktning.
Forsinkelsen av oocyte modning er sannsynlig å påvirke befolkningen av fattige respondere med et lavt antall MII oocytter og en høy andel av umodne oocytter samlet uventet i stimulert sykluser2. In vivo, bare en enkelt, best kvalitet egg oppnår modenhet og blir ovulated. I in-vitro befruktning (IVF) sykluser, kontrollerte eggstokkene hyperstimulering brukes til å rekruttere flere oocytter for modning. Gonadotropin surge utløser en gjenopptakelse av meiotic programmet og egg forfedre er ment å nå MII arrest scenen innen 36 timer3. Men oocytter Hentet fra preovulatory sekkene ofte utgjør et utvalg av PBdisplaying MII oocytter og umodne oocytter, enten ved metafase jeg (MI) eller Germinal vesicle Stadium (GV) (figur 1). Bare MII oocytter er utsatt for Intracytoplasmatisk sperm injeksjon (ICSI) mens umodne oocytter vanligvis kastes. Likevel, når dyrket in vitro, MI oocytter er ofte observert å extrude PB in vitro. Til tross for deres generelle mindre verd, sent-modning oocytter som spontant fullførte den første meiotic divisjonen under overnight kulturen har blitt brukt som siste ressurs oocytter, og levende fødsler har blitt rapportert4,5 ,6,7,8. Derfor, den altfor tidlige injeksjon av sperm kan være en primær årsak underliggende dårlige utviklingsmessige utfall av sen-modning oocytter rapportert i tidligere studier9,10,11.
Polarisert lys mikroskopi (PLM) kombinert med et bildebehandling programvare muliggjør ikke-invasiv visualisering av meiotic spindel i live oocyte. Den doble refleksjon er generert av samspillet mellom polarisert lysstråle med den svært bestilte montering av mikrotubuli bygge bipolar spindel. Siden det polariserte lyset er av normal intensitet, kan teknikken trygt brukes i kliniske innstillinger for å vise dynamikken i divisjons apparatet11,12,13,14. Tilstedeværelsen av MII spindel birefringence innenfor oocyte har blitt identifisert som en markør av et egg ‘ s utviklingsmessige kompetanse9,15, 16,17,18, 19,20,21,22,23. Dermed har det blitt antydet at ikke-invasiv meiotic spindel Imaging kan brukes til egg kvalitetskontroll i klinisk praksis11,14,20.
Siden tidslinjen for microtubular dynamikk under oocyte meiose har blitt løst1, det observerte PLM mønsteret kan være bedre relatert til den tiden løpet av mi til MII overgangen. Kort tid etter PB utslipp, den begynnende MII spindel blir undetectable av PLM. Men hvis oocytter holdes i kulturen, birefringence signalet kan dukke opp senere når bipolar MII spindel setter sammen9,10,11. Således, i oocytter ekstrudering en PB in vitro, fravær av spindelen kan være bare midlertidig tilsvarende den fysiologiske overgangen av sen-modning oocyte fra MI til MII scenen. Hvis MII spindel signalet er undetectable, sperm injeksjon kan utsettes til et senere tidspunkt gir ekstra tid for MII spindel formasjon. PLM-støttet optimalisering av ICSI tid maksimerer sjansen for sen-modning oocytter å bli klinisk utnyttet og gjøre en forskjell for dårlig prognose pasienter9.
Nedenfor gir vi en trinnvis protokoll for hvordan man utfører ikke-invasiv spindel avbildning i humant oocytter. Vi viser også hvordan PLM kan anvendes for å unngå risikoen for tidlig befruktning av sen-modning oocytter.
Acentrosomal meiotic spindel i menneskets oocytter er svært dynamisk og en delikat struktur1. Under suboptimal forhold, mikrotubulinettverket fibrene raskt depolymerize og meiotic spindel deler opp30,31,32,33. Derfor er det kritisk viktig å sikre at oocyte kultur og mikromanipulering forhold, nemlig temperatur og pH er i optimal rekkevidde. For å minimere risikoen for spindel forstyrrelser, bør oocytter oppbevares i et temperatur kontrollert miljø som opprettholder 37 ± 0,5 ° c i det oocyte mediet. Bruk av mikroskop og microinjection oppsett utstyrt med et oppvarmet stadium er strengt nødvendig. All manipulering med oocytter utenfor inkubator må utføres i HEPES/MOPPER-bufrede medier for å unngå pH-fluctulations. For å unngå mulige bivirkninger av overdreven oocyte levere i ambient tilstand, bør den totale tiden av PLM eksamen ikke overstige 10 minutter. Oocytter må analyseres på glasset bunnen parabolen med plast lokket fjernet fordi posisjonering av en standard plast i strålen banen svekker bildeanalyse. Fordi plast og glassbunn retter har ulike termiske egenskaper, bør temperaturen sjekkes direkte i dråpene av håndtering medium i eksamen parabolen.
I tillegg til laboratorieforhold, prosessuelle forskjeller og operatørens mikromanipulering ferdigheter kan ha en innvirkning på PLM eksamen nøyaktighet. Bare svært sammensatte bipolar aksling kan være invasivt visualisere. Observert signal er proporsjonal med graden av strukturell organisering av spindelen. Begynnende, apolar, løsnet eller disarrayed aksling viser bare uklare birefringence eller ingen i det hele tatt (Figur 3 og Figur 4). For resten, ufullkommen oppstilling av polarisert lyset med mikrotubulinettverket oppstille produserer bare en gjennomskinnelig og dårlig definerte birefringence til tross for det faktisk tilstedeværelse av welldeveloped bipolar spindel (skikkelsen 4). Med mindre riktig orientert, kan spindel signalet være lett savnet og oocyte modenhet feildiagnostisert (supplerende video). For optimal spindel avbildning, må oocyte være riktig snudd rundt hver akse. Siden birefringence er ikke synlig inne okularene, operatøren har å ur computeren skjermen stund utføre omdreining av det oocyte. Tidligere erfaring med mikromanipulering og opplæring av spindel avbildning i overskudd i vitro modnet oocytter er ønskelig før du bytter til klinisk anvendelse.
I tillegg til spindel, det Cumulus celler rundt oocyte, oolema, det indre laget av Zona pellucida og noen cytoplasmatiske strukturer (f. eks, refractile organer, vakuoler) utstillingen birefringence (figur 5a-D). Med mindre grundig fjernet fra oocyte før bildebehandling, tett festet follikulær celler produsere bakgrunnsstøy og kompromiss meiotic spindel deteksjon. Vær forsiktig så du ikke feil en stor refractile kroppen for spindelen. Mange cytoplasmatiske inkluderinger bosatt i cytoplasma vise høylys styrke som kraftig kontraster med den mørke bakgrunnen. Meiotic spindel, derimot, viser bare moderat signal, uklare grenser og vanligvis festes til oolema under eller ved siden av den første PB. Noen ganger viser PLM-undersøkelsen et brutto spindel avvik fra standardposisjonen (figur 5e, F). Hvis det er en stor forskyvning mellom divisjons apparatet og PB, hjelper PLM å orientere oocyte for å unngå fare for spindel skade under microinjection. Den relative plasseringen av spindelen i oocyte ser ikke ut til å påvirke utviklings potensialet til den resulterende embryo17,34. Men når spindelen competely løsner fra oolema, oppstår befruktning unormalt. Interessant nok gjennomgår noen dårlig kvalitet oocytter kromatin decondensation umiddelbart etter PB ekstrudering istedenfor å starte mikrotubulinettverket kjernedannelse (figur 4f). Ved bruk av konvensjonelle lys mikroskopi og PB som eneste markør for oocyte modenhet, vil slike sub-kompetente oocytter betraktes som fertilizable. Således, på toppen av rutinen morfologiske vurderingen, legger spindel Imaging viktig informasjon om egget modenhet og kan tjene som en indirekte markør av sin kvalitet.
Forekomsten av spindled MII-oocytter vil trolig bli påvirket av karakteristika for studiepopulasjonen (f.eks. genetisk bakgrunn, medisinsk tilstand, mors alder). I tillegg vil andelen developmentally forsinket oocytter i kohort påvirke det faktiske antallet påviste spindel-negative oocytter. Meiotic spindel visualisering gjør det mulig å tydelig identifisere fertilizable oocytter arrestert i MII scenen. Videre kan den andre inspeksjonen på et senere tidspunkt avdekke om spindel-negative oocyte er unormal eller har bare nylig kommet gjennom mi/MII overgang9,10,11. Når lov til å utvikle en spindel før ICSI, selv umodne oocytter, som rutinemessig kastes, kan produsere levedyktig embryo9. I sykluser med svært få oocytter tilgjengelig for befruktning, fin-tidsbestemt ICSI av oocytter ekstrudering PB kan tjene som en rednings strategi og alternativ til syklus kansellering.
Likevel, utvide preinkubering tid bør ikke generalisert til alle oocytter. In vivo modnet oocytter fra normale respondere vanligvis viser en MII spindel9,20,21,27. Her synker sjansen for vellykket spindel avbildning med tiden som en konsekvens av post-ovulatory in vitro aldring35. Hvis det er mulig, bør ICSI utføres på dagen for henting og bør ikke overstige 9 timer (45 timer etter HCG), perioden forbundet med en nedgang i resulterende embryo kvalitet36,37. Oocytter viser distinkt bipolar aksling bør utsettes for ICSI uten ytterligere forsinkelser. Oppsummert er individualisert optimalisering av ICSI timing verdt i dårlig prognose pasienter å utelukke risiko for prematur sperm injeksjon. Imidlertid er det unødvendig, for tidkrevende og arbeidskrevende å bli utført i alle IVF sykluser.
PLM-analyse avslører om oocyte nådde MII-scenen. Men ikke-invasiv visualisering av meiotic spindel gir ingen informasjon om kromosom organisasjon. Det kan være alvorlig kromosom forskyvning og/eller mors alder-relaterte chromatid splitting i oocytter med en bipolar spindel (figur 5). Diverse andre faktorer har betydelig innvirkning på reproduksjon suksess (f. eks sperm faktor, mitokondrier, embryonale Genova aktivisering, uregelmessig kløft, epigenetikk, endometrium, mødre immunitet). Derfor, påvisning av MII spindel per se, garanterer ikke et positivt klinisk resultat av IVF prosedyren.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke embryologi laboratorium for Reprofit International. Vi erkjenner også kjernen anlegget CELLIM av CEITEC støttes av MEYS CR (LM2015062 tsjekkisk-Bioimaging) for deres støtte med å skaffe immunofluorescence Imaging data som presenteres her.
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |