Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Bedömning av Human ägg mognad och dess kliniska tillämpning

doi: 10.3791/60058 Published: August 19, 2019

Summary

Vi ger en översikt av det kliniska protokollet för icke-invasiv bedömning av mänskliga ägg mognad med hjälp av polariserad ljusmikroskopi.

Abstract

Den optimala tidpunkten för intracytoplasmisk spermie injektion (ICSI) är av en allvarlig oro för fertilitets program eftersom förtida spermier inträde minskar ägget kompetensutveckling. Närvaron av den första Polar kroppen (PB) tillsammans med meiotiska metafaserna spindel indikerar slutförandet av äggcell mognad och ägget beredskap för befruktning. I klinisk praxis är det brukligt att anta att alla oocyter som uppvisar en PB är mogna metafase (MII) oocyter. Men PB extrudering föregår bildandet av bipolär MII spindel. Detta communityn hos gör blotta närvaron av PB en opålitlig markör för äggcell mognad. Noninvasiv spindel avbildning med hjälp av polariserad ljusmikroskopi (PLM) möjliggör snabb och enkel inspektion av huruvida PB-visar äggcell faktiskt återmonteras en meiotiska metafaserna spindel före ICSI. Här presenterar vi ett standardprotokoll för att utföra Human Egg mognadbedömning i det kliniska laboratoriet. Vi visar också hur man optimerar tiden för ICSI med avseende på äggcell utvecklingsstadiet för att förhindra för tidig spermie injektion av sena förfallande oocyter. Med hjälp av denna metod, även omogen oocyter extrudera PB in vitro kan kliniskt utnyttjas. Affirmation att MII spindel är närvarande före sperma injektion och individuell justering av tiden för ICSI är särskilt viktigt i dålig prognos in-vitro fertilisering (IVF) cykler med ett lågt antal oocyter tillgängliga för befruktning.

Introduction

För att bli ett fruktbart haploida ägg, diploida äggcell har att pressa hälften av sin genetiska information i en angränsande cell, kallas den första Polar kroppen (PB), och justera kromosomer i ekvatorn av bipolär metafase II (MII) spindel. Medan PB tydligt kan observeras med konventionell ljusmikroskopi, kräver detektion av genetiskt material och cytoskeletala strukturer vanligtvis invasiva förberedande procedurer som är oförenliga med äggocyten ytterligare användning för fertilitetsbehandling. I klinisk praxis betraktas därför förekomsten av PB som ett kännetecken för äggcell mognad. Emellertid, levande bild av mikrotubule och kromosom dynamik under Human äggcell mognad visade att PB blir synlig ett par timmar innan bipolär Mii spindel monteras och kromosomer är inriktade1. Ändå, i det överförda ljuset, den MII arresterade ägg är omöjlig att skilja från oocyter som just gått in i processen för kromosom segregering. Sålunda, en kohort av oocyter, klassificeras som MII oocyter baserat endast på PB närvaro, kan innehålla latematuring oocyter som ännu inte har avslutat sin utveckling och därmed inte är redo för befruktning.

Fördröjningen av äggcell mognad kommer sannolikt att påverka populationen av fattiga responders med ett lågt antal Mii oocyter och en hög andel omogna oocyter samlas oväntat i stimulerade cykler2. In vivo, bara en enda, bästa kvalitet ägg uppnår mognad och blir ovulated. I in vitro-fertilisering (IVF) cykler, kontrollerad ovariell hyperstimulering används för att rekrytera flera oocyter för mognad. Gonadotropin Surge utlöser ett återupptagande av meiotiska program och ägg stamceller är tänkta att nå MII gripande skede inom 36 timmar3. Emellertid, oocyter som hämtats från preovulatoriska folliklar utgör ofta ett sortiment av pbvisa Mii oocyter och omogna oocyter, antingen I metafas I (mi) eller avelsmaterial vesikel skede (GV) (figur 1). Endast MII oocyter utsätts för intracytoplasmisk spermie injektion (ICSI) medan omogna oocyter vanligtvis kasseras. Men, när odlas in vitro, MI oocyter är vanligen observeras att extrudera PB in vitro-. Trots deras allmänna underlägsenhet, sena mognar oocyter som spontant avslutat den första meiotiska metafaserna division under natten kultur har framgångsrikt använts som sista resurs oocyter, och levande födda har rapporterats4,5 ,6,7,8. Därför, den förtida injektion av spermier kan vara en primär orsak underliggande dåliga utvecklingsresultat av sena förfallande oocyter rapporterade i tidigare studier9,10,11.

Polariserad ljusmikroskopi (PLM) kombinerat med ett bildbehandlings program möjliggör icke-invasiv visualisering av den meiotiska spindeln i den levande äggocyten. Den dubbla reflektion genereras av samspelet mellan polariserad ljusstråle med mycket beställda montering av mikrotubuli bygga bipolär spindel. Eftersom det polariserade ljuset är av normal intensitet, kan tekniken säkert användas i kliniska inställningar för att Visa dynamiken i divisionens apparat11,12,13,14. Närvaron av MII spindel Dubbelbrytning inom äggcell har identifierats som en markör för ett ägg utveckling kompetens9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Sålunda, det har föreslagits att noninvasiv meiotiska metafaserna spindel avbildning kan användas för ägg kvalitetskontroll i klinisk praxis11,14,20.

Eftersom tidslinjen för mikrotubulär dynamik under äggcell meios har lösts1, kan den observerade PLM-mönstret vara bättre relaterade till tiden loppet av mi till Mii Transition. Strax efter PB emission, den begynnande MII spindeln blir omöjlig att upptäcka genom PLM. Men om oocyterna hålls i kulturen, kan den Dubbelbrytning signalen dyka upp senare när bipolär Mii spindel återmonteras9,10,11. I oocyter som extruderar en PB in vitro kan därför frånvaron av spindeln endast tillfälligt motsvara den fysiologiska övergången av den sena mognads-oocyten från MI till MII-stadiet. Om MII spindel signalen är omöjlig att upptäcka, sperma injektion kan skjutas upp till en senare tidpunkt som ger extra tid för MII spindel bildning. PLM-stödd optimering av ICSI tid maximerar risken för sena förfallande oocyter att vara kliniskt utnyttjad och göra skillnad för fattiga prognos patienter9.

Nedan ger vi ett steg-för-steg-protokoll om hur man utför noninvasiv spindel avbildning i humana oocyter. Vi visar också hur PLM kan användas för att undvika risken för för tidig befruktning av sena förfallande oocyter.

Protocol

Detta protokoll beskriver det kliniska förfarandet som är ett "tillägg" till standard IVF-behandling. Den bör utföras av erfaren personal i enlighet med god laboratoriesed och kliniska riktlinjer24,25. Inhämta skriftligt informerat samtycke från de behöriga patienterna rekommenderas. Detta protokoll godkändes av den institutionella etikkommittén.

1. ägg upptagning och denudation

  1. Inducera ovariell stimulering med konventionella stimuleringsprotokoll3. Justera dosen till individuell respons. När två eller flera folliklar, visualiseras av ultraljud Scan, nå en diameter på 18 mm, inducera äggcell mognad med tillämpning av 250 μg humant koriongonadotropin (hCG). Schema äggcell pick-up (opu) vid 35 − 36 h post HCG injektion.
  2. Samla in hämtade Cumulus-äggocyte komplex (COCs) i CO2-oberoende hantering medium (tabell över material). Efter en kort inkubationstid (10 − 15 min) i en co2-oberoende inkubator, kort (upp till 30 s) exponera insamlade COCs till hyaluronidas lösning (tabell över material). Under ett stereomikroskop, ta mekaniskt bort Cumulus-Corona celler genom att försiktigt Pipettera COCs med en 200 μL filter spets.
  3. Med hjälp av denudation Mikropipetter med en gradvis minskande diameter (200 μm, 180 μm och 150 μm), försiktigt remsor oocyterna från de återstående follikulära celler och tvätta oocyter 3x i hantering medium.
  4. Bedöma antal och utvecklingsstatus för de denaturerade oocyterna beroende på förekomst eller frånvaro av kärnan och första PB (figur 1).
  5. Kontrollera inkluderingskriterierna för PLM-undersökning. Utföra en bedömning av ägg mognad om det finns (1) ett oväntat dåligt svar på konventionell stimulering med färre än 6 MII oocyter som samlats in vid OPU och (2) en historia av tidigare fertilisering misslyckande eller oocyt omognad.
  6. Placera GV, MI och MII oocyter i separata brunnar i en IVF-rätt, var och en innehåller 500 μL av preequilibrated CO2-beroende odlingssubstrat (tabell över material) täckt med mineralolja (tabell över material).
  7. Inkubera i ytterligare 3 − 4 h vid 37 ° c i en Befuktad atmosfär av 5% O2 och 6% Co2.

2. förberedelse för PLM-examination och efterföljande ICSI

Anmärkning: det protokoll som anges här beskriver PLM bedömning utförs med hjälp av OCTAX Polar AIDE system (tabell över material). Alternativt kan andra kommersiellt tillgängliga spindel visningssystem användas.

  1. Förbered plattor för embryoodling.
    1. Beroende på antalet oocyter som ska undersökas (totalt MII oocyter, och MI oocyter extruderar en PB under preinkubations tiden), Förbered antingen en 4-brunn tallrik eller en 12-brunn tallrik, fylla varje brunn med 500 μL eller 30 μL av odlingssubstrat, respektive och täck med tidigare jämkade mineralolja.
    2. Se till att både odlingssubstrat och mineralolja har jämställts i CO2 -inkubatorn över natten. Håll den förberedda skålen i CO2-beroende inkubator för minst 2 h. numrera brunnarna om det behövs för att spåra det utvecklingsmässiga ödet för enskilda oocyter.
  2. Förbered ICSI skålen.
    1. Använd tilldelad plast maträtt och gör 5 μL droppe förvärmda hanterings medium för varje PB-visar äggcell och en extra droppe för nål tvätt. Gör en extra droppe polyvinylpyrrolidon (PvP) lösning (tabell över material) för spermie immobilisering före ICSI (tillsätt spermier strax före ICSI) och overlay med förvärmda mineralolja.
    2. Förvara den beredda ICSI skålen i CO2-oberoende inkubator i minst 20 min. numrera brunnarna om det behövs för att spåra oocyterna efter ICSI.
  3. Förbered PLM-provskålen.
    1. Använd tilldelad glasbotten skålen och gör 5 μL droppar förvärmda hanterings medium för varje PB-visar äggcell. Överlägg med förvärmda mineralolja.
    2. Håll skålen i CO2-oberoende inkubator i minst 20 min. numrera dropparna om det behövs för att spåra OOCYTERNA efter PLM-undersökning.
  4. Ställ mikroskopet redo för PLM-undersökning.
    1. Byt den uppvärmda scenen på det inverterade mikroskopet i god tid för att uppnå rätt uppvärmnings temperatur. Se till att inställningarna är korrekt justerade för att bibehålla 37 ° c i hanteringen av medelstora droppar i PLM/ICSI skålen under mikromanipulation procedurer.
    2. Montera den sterila anläggningen och ICSI-nålen i mikroinjektionshållarna och sätta dem i fokus. Alternativt kan du använda en kläcknings nål.
    3. Välj lämpligt mål (20x och 25x är de lämpligaste) och se till att kondensorn är i ljust fält läge.
    4. Infoga grönt störningsfilter (ljuset blir grönt) och Ställ in reglaget för flytande kristall analys i arbetsläge.
    5. Ställ in slutaren till ~ 50% och justera cirkulär polarisator för att minska bakgrundsbrus.
  5. Ställ in datorn redo för PLM-undersökning.
    1. Starta avbildningsprogram varan.
    2. Välj video | Video källa | polarAIDE i videomenyn i den övre menyraden.
    3. Växla till livevideo genom att gå till video sidan och aktivera spindel och Zona analys genom att trycka på ikonen (kompletterande figur 1) i videoverktygsfältet.
    4. Välj visningsläge för dynamisk skalning under spindel avbildning: (1) röd (Dubbelbrytning)/grön (bakgrund) kombinerad vy, eller (2) vit (Dubbelbrytning)/och svart (bakgrund) vy. Det dynamiska bedömningsläget används för autopoängsättning av zona pellucida.

3. undersökning av ägg mognad

  1. Efter preinkubations tiden (3 − 4 timmar), utför en PLM-undersökning som avslöjar oocytmognads status vid normaltid för ICSI (39 − 40 h efter hCG-trigger).
  2. Överför alla oocyter till enskilda droppar på PLM-skålen och placera den under det inverterade mikroskopet som förberetts för spindel avbildning. Kom ihåg att ta bort plastlocket från glaset botten skålen innan undersökningen påbörjas.
  3. Ta den första äggocyten i fokus. Om det är svårt att söka efter cellen under grönt ljus, dra ut det gröna filtret tillfälligt. Se till att det gröna filtret sätts in före analysen.
  4. Observera den upptäckta äggcell Dubbelbrytning bild (röd/orange på grön bakgrund) eftersom det är datorbehandlade och visas i realtid på datorskärmen. Kom ihåg att signalen inte syns i okularet.
  5. Om budskapet om ljus exponering är för lågt/högt dyker upp, justera ljusstyrkan till lämplig intensitet med hjälp av mikroskopets ljusintensitet ratten.
  6. Använd en anläggning och ICSI-nål för att vrida på äggcell så att PB är i positionen klockan 12 och fokuserar på PB.
  7. Om spindel Dubbelbrytning inte syns vid första ögonkastet i närheten av Pb, vrid oocyten försiktigt runt varje axel genom att något vidröra zona pellucida för att säkerställa anpassningen av det polariserade ljuset med matrisens spindel fibrer (extra video ). Deklarera frånvaron av MII-spindeln så länge som oocyten inte visar spindel signalen trots rigorös rotation.
  8. Baserat på det observerade bibrytnings mönstret klassificerar du oocyterna i följande kategorier (figur 2): (a) oocyter med ljussignal av bipolär Barrel-formad Mii spindel med tydligt avgränsade gränser och även fördelning av Dubbelbrytning ; B oocyter med dysmorphic, apolar och genomskinlig MII-spindel med oregelbundna gränser och ojämn fördelning av signalen. (C) oocyter utan detekterbar Mii spindel Dubbelbrytning i ooplasm;   D) Anaphasen i/Telophase I-oocyter, som visar en mikrotubulär brygga (en bindväv mellan första PB och äggocyten) i stället för MII-spindeln.
    Anmärkning: oocyte med detekterbar MII spindel signal (grad A eller B) är lämpliga för omedelbar ICSI.
  9. Ta en ögonblicksbild (F9) eller spela in video för en rapport och/eller efterföljande bildanalys. Behåll dokumentation av bild mönstret för att minska operatörens subjektivitet.
  10. Flytta till positionen för nästa äggcell och upprepa steg 3.6 − 3.9.

4. optimera ICSI timing

  1. Överför alla spindel positiva oocyter (grad A eller B, steg 3,8) till ICSI-skålen och ta dem till ICSI enligt standardprotokollen24,25.
  2. Om oocyterna visar ingen detekterbar MII spindel signal, placera PLM skålen i CO2-oberoende inkubator och flytta ICSI till ett senare tillfälle.
  3. Utför PLM-omprövning ~ 2 − 3 h senare efter steg 3.3 − 3.9. Om vissa äggcell (er) fortfarande saknar en MII-spindel, ytterligare dröjsmål ICSI för ytterligare 1 − 2 h.
  4. Överför alla oocyter till ICSI skålen och injicera dem enligt standardprotokoll24. Om PLM-skålen är kompatibel med mikroinjektionsnålens böjningsvinkel ska du omedelbart utföra ICSI i PLM-skålen efter att ha omkoppling till ett ljust fält läge.
  5. Vid ICSI, överför oocyter till preparerade plåtar för embryododling och kultur fram till blastocyststadiet.

Representative Results

Polariserad ljusmikroskopi gör det möjligt att omedelbart inspektera om äggocyten avslutat nukleära mognad och monterade MII spindel före ICSI. På grund av dess icke-invasiva karaktär, det kan användas för att säkert bedöma det mänskliga äggets beredvillighet för befruktning i kliniska inställningar11,12,13,14. Spindled oocyter är mer benägna att ge upphov till livskraftiga embryon än oocyter utan spindel9,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23. också, oocyter med en distinkt bipolär spindel verkar ha en högre utvecklingskompetens än oocyter med dysmorphic spindlar9,21,22. Sammantaget kan spindel avbildning fungera som ett verktyg för att identifiera de oocyter som har störst potential att framgångsrikt befruktas, genomgå preimplantatorisk utveckling och stödja fulltids graviditet9,15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Den rapporterade incidensen av spindeln varierar (44 − 97%) återspeglar mångfalden i den studerade populationen9,15,16,17,18,19,20,21, 22 , 23 , 26 , 27 , 28. in vivo mognade oocyter från normala responders visar vanligtvis bipolär Mii spindel vid 40 h efter HCG utlösa9,18,27,29. Men i långsamma responders, poolen av oocyter hämtas från preovulatoriska folliklar påverkas av mogningen fördröjning9,27. Här, spindel avbildning bör utföras för att diskriminera oocyter greps i MII skede från dem som genomgår viktiga mogational Transition (figur 3). Vi rekommenderar avlägsnande av follikulära celler omedelbart vid hämtning, och inkubationen av MI och MII oocyter i separata brunnar för att kunna särskilja in vivo mognade oocyter och sena förfallande oocyter extrudera PB in vitro, strax före ICSI. Om denudation utförs strax före ICSI, dessa två populationer av oocyter är omöjlig att skilja baserat på PB utseende.

De fasspecifika förändringarna i PLM-mönstret skall tolkas i samband med kunskap om spindeldynamiken under meiotiska metafaserna mognad. Under interkinesis genomgår divisions apparaten omfattande strukturell omorganisering och PLM signalerar övergående försvinner1,9,10,11. Således, i utvecklingsstörda fördröjda oocyter extrudera PB in vitro, kan avsaknaden av MII spindel signalen inte nödvändigtvis återspeglar cellulära störningar, men det kan tyda på äggcell progression från MI till MII skede (figur 3). Om sperman injiceras vid en ofysiologisk tidpunkt, ägget utvecklingspotential äventyras. Senareläggning ICSI ger sena mognar oocyter med mer tid att montera en MII spindel vars närvaro är förknippad med bättre kliniska resultat9,10,11. I den kliniska studien med långsam/dålig respons, nästan 60% av initialt spindel-negativa oocyter utvecklat spindel signal innan PLM förnyad undersökning cirka 2 h senare9. Beroende på utvecklingsstadiet och den totala konditionen av sena förfallande oocyter, MII spindel utseende efter PB extrudering typiskt tar 2 − 6 h (opublicerade observation). De oocyter uppvisar en mikrotubuli bro (Anaphase/Telophase, grade D) under den första PLM undersökningen kräver en längre tid att utveckla Mii spindel signal än oocyter utan synlig spindel (framväxande spindlar, grad C). Individuell justering av tiden för ICSI till äggets utvecklingsstadium förhindrar för tidig aktivering av äggcell och resulterar i en förbättrad gödsling hastighet och framgångsrik embryonal utveckling9.

Även om sena förfallande oocyter som extruderar PB in vitro i allmänhet har en lägre utvecklingskompetens än in vivo mognade oocyter, är embryots utveckling godtagbar om de lyckas montera en detekterbar spindel före fördröjd IKSI (blastulation skattesats på 41,32%)9. Med hjälp av denna metod, även omogna oocyter, som normalt avvisas för fertilitetsbehandling, kan vara kliniskt utnyttjas, producera överförbara embryon, och ge upphov till full-term graviditeter. Utvärdering av mogningsledet för varje enskild äggcell är särskilt fördelaktigt vid dålig prognos cykler som ger ett litet antal MII oocyter och/eller efter att ha utfört en räddning in vitro mognad av omogen oocyter9.

Bortsett från ägg mognadbedömning, spindel avbildning rekommenderas också före PB biopsi för att undvika spindel förstörelse i Anaphasen i/Telophase oocyter. I experimentell embryologi, visualisering av den meiotiska spindeln används under ägg enucleation och/eller spindel överföring förfarande13.

Figure 1
Figur 1: Human äggcell mognad. In vivo mognade oocyter (MII) uppvisar PB vid tidpunkten för hämtning. Omogen oocyter (GV, MI) kan spontant slutföra mogningen in vitro. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: oocyte klassificering baserad på PLM-detekterat mönster. Representativa exempel på äggcell kvaliteter (a-D) baserat på utseendet på spindel signalen. PLM-detekterat mönster: (a) framträdande signal av bipolär spindel, (B) genomskinlig apolar Mii spindel spindel, (C) ingen detekterbar spindel, och (D) mikrotubuli Bridge. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: stadier av mi till Mii övergång i äggcell mognad. Utseendet på oocyter i ljust fält (översta raden), kombinerat med en fluorescenssignal av kromosomer (cyan) och mikrotubuli (magenta) (mellersta raden), och i polariserat ljus (nedersta raden) visas. Varje äggcell var först PLM-granskad och omedelbart fastställd. Fasta oocyter var (Immuno) märkta med Hoechst (DNA) och anti-α-tubulin antikropp (mikrotubuli). Den gula pilen indikerar närvaron av PB och den vita pilen belyser positionen av birefrragande mikrotubuli. Skalstapel = 20 μm. Denna siffra har modifierats från Holubcová et al., JARG 20199. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: korrelation av kromosom-Microtubule organisation med Dubbelbrytning mönster detekteras av polariserad ljusmikroskopi. Utseendet på oocyter i det ljusa fältet kombinerat med en fluorescerande signal för kromosomer (cyan) och mikrotubuli (magenta) (översta raden), och i polariserat ljus (nedersta raden) visas. Varje äggcell fastställdes omedelbart efter PLM-undersökning. DNA (Hoechst) och mikrotubuli (α-tubulin) färgas. (A-C) oocyter med PLM-detekterbar spindel ännu feljusterade kromosomer (a, B) eller löst fokuserade spindel poler (C); (D-F) onormala oocyter utan PLM-DETEKTERBAR Mii-spindel som visar underutvecklad (d), apolar (E) eller ingen spindel (F). Den vita pilen belyser positionen av birefrragande mikrotubuli, och asterisk (*) indikerar positionen för dekondenserad kromatin. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bibrytnings strukturer i humana oocyter. Representativa exempel på (a-D) birefrragande strukturer som upptäckts av PLM i humana oocyter. ZP = zona pellucida; PM = plasmamembran (oolema); RB = refraktila förkroppsligar, vacuoles. Vit pil, meiotiska metafaserna spindel i olika stadier av mognad. (E) Mii spindel feljustering med Polar Body (PB). Fspindel avlossning från plasmamembran. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande bild 1: skrivbords layout för bildanalys programmet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande video: PLM examination förfarande. Rotation av äggocyten krävs för att utesluta närvaron av spindeln (pil). Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Discussion

Den acentrosomal meiotiska metafaserna spindel i mänskliga oocyter är mycket dynamisk och en delikat struktur1. Under suboptimala förhållanden, den mikrotubuli fibrer snabbt depolymerize och meiotiska metafaserna spindel Disassemblerar30,31,32,33. Därför är det ytterst viktigt att se till att äggcell kulturen och mikromanipuleringförhållandena, nämligen temperatur och pH, är i optimalt omfång. För att minimera risken för spindel störningar bör oocyterna förvaras i en temperaturkontrollerad miljö som upprätthåller 37 ± 0,5 ° c i äggcell mediet. Användning av Mikroskop och görs setup utrustad med en uppvärmd scen är strikt krävs. All manipulation med oocyter utanför inkubatorn måste utföras i HEPES/MOPS buffrade medier för att undvika pH-fluktueringar. För att undvika potentiellt skadliga effekter av överdriven oocyt överlämnande i omgivnings tillstånd, bör den totala tiden för PLM-undersökning inte överstiga 10 minuter. Oocyterna måste analyseras på glaset botten skålen med plastlocket bort eftersom positionering av en standard plast i strålen vägen försämrar bildanalys. Eftersom plast och glasbotten rätter har olika termiska egenskaper, bör temperaturen kontrolleras direkt i droppar av hantering medium i undersökningen skålen.

Förutom laboratorieförhållanden kan förfarandemässiga skillnader och operatörens mikromanipulering ha en inverkan på PLM: s noggrannhet. Endast Högmonterade bipolär spindlar kan vara noninvasivt visualiseras. Observerade signalen är proportionell mot graden av strukturell organisering av spindeln. Begynnande, apolaris, lossade eller disarrayed spindlar visar endast suddig Dubbelbrytning eller ingen alls (figur 3 och figur 4). Dessutom, ofullständig anpassning av polariserat ljus med mikrotubuli arrayer producerar bara en genomskinlig och dåligt definierade Dubbelbrytning trots den faktiska närvaron av välutvecklad bipolär spindel (figur 4). Om inte korrekt orienterad, kan spindel signalen lätt missas och äggcell mognad fel diagnos (kompletterande video). För optimal spindel avbildning måste äggocyten vändas på rätt sätt runt varje axel. Eftersom Dubbelbrytning inte syns i okularen, operatören har att titta på datorskärmen när du utför rotation av äggcell. Tidigare erfarenhet av mikromanipulering och utbildning av spindel avbildning i överskott in vitro-mognade oocyter är önskvärt innan man övergår till klinisk applicering.

Förutom spindeln, de Cumulus-celler som omger äggcell, oolema, det inre skiktet av zona pellucida och vissa cytoplasmiska strukturer (t. ex. refraktila organ, vakuoler) uppvisar Dubbelbrytning (figur 5a-D). Om inte grundligt avlägsnas från äggcell före avbildning, tätt bifogade follikulära celler producerar bakgrundsljud och kompromiss meiotiska metafaserna spindel detektering. Var noga med att inte förväxla en stor refractile kropp för spindeln. Många cytoplasmiska inneslutningar bosatta i cytoplasman visar hög ljusstyrka som skarpt kontrasterar mot den mörka bakgrunden. Meiotic spindel, å andra sidan, uppvisar endast måttlig signal, suddiga gränser och vanligtvis fäster till oolema under eller intill den första PB. Ibland avslöjar PLM-undersökning en grov spindel avvikelse från sin standardposition (figur 5E, F). Om det finns en stor förskjutning mellan divisionens apparat och PB, hjälper PLM till att orientera äggocyten för att undvika risken för spindel skada vid mikroinjektion. Spindelns relativa position i oocyten förefaller inte påverka utvecklingspotentialen hos de resulterande embryona17,34. Men när spindeln competely lossnar från oolema, fertilisering avvikelser förekommer. Intressant, vissa dålig kvalitet oocyter genomgå kromatin dekondensation omedelbart efter PB extrudering istället för att starta mikrotubuli nukleation (figur 4F). Med konventionell ljusmikroskopi och PB som enda markör för oocytmognad, skulle sådana underkompetenta oocyter betraktas som fruktbara. Således, ovanpå den rutinmässiga morfologiska bedömningen, spindel avbildning tillför viktig information om äggets mognad och kan fungera som en indirekt markör för dess kvalitet.

Incidensen av spindledda MII oocyter kommer sannolikt att påverkas av egenskaperna hos studiepopulationen (t. ex. genetisk bakgrund, medicinskt tillstånd, moderns ålder). Dessutom kommer andelen av utvecklingsstörda fördröjda oocyter inom kohorten att påverka det faktiska antalet upptäckta spindel negativa oocyter9,27. Meiotic spindel visualisering gör det möjligt att tydligt identifiera fertiliserbara oocyter greps i MII skede. Dessutom kan den andra inspektionen vid ett senare tillfälle avslöja om den spindel-negativa äggocyten är onormal eller har bara nyligen framskridit genom mi/Mii Transition9,10,11. När det tillåts att utveckla en spindel före ICSI, även omogna oocyter, som rutinmässigt kasseras, kan producera livskraftiga embryon9. I cykler med mycket få oocyter tillgängliga för befruktning, fint tidsinställda ICSI av oocyter extruderande PB kan fungera som en räddnings strategi och alternativ till cykel avbokning.

Icke desto mindre bör förlänga preinkubations tiden inte generaliseras till alla oocyter. In vivo mognade oocyter från normal responders uppvisar typiskt en MII-spindel9,20,21,27. Här minskar risken för framgångsrik spindel avbildning med tiden som en följd av post-ovulatoriska in vitro-åldrande35. Om möjligt bör ICSI utföras på dagen för hämtning och bör inte överstiga 9 timmar (45 timmar efter hCG), perioden i samband med en minskning av resulterande embryo kvalitet36,37. Oocyter som uppvisar distinkta bipolära spindlar bör genomgå ICSI utan ytterligare dröjsmål. Sammanfattnings, individualiserad optimering av ICSI timing är värdefullt i fattiga prognos patienter att utesluta någon risk för förtida sperma injektion. Det är dock onödigt, alltför tidskrävande och mödosam att utföras i alla IVF cykler.

PLM-analys avslöjar om äggocyten nådde MII-stadiet. Men noninvasiv visualisering av den meiotiska spindeln ger ingen information om kromosom organisation. Det kan finnas allvarlig kromosom förskjutning och/eller moderns åldersrelaterade kromatiddelning i oocyter med en bipolär spindel (figur 5). Flera andra faktorer har stor inverkan på fortplantnings framgången (t. ex. spermie faktorn, mitokonskerna, embryonal genom aktivering, oregelbunden klyvning, epigenetik, endometrium, moderns immunitet). Därför, detektering av MII-spindeln i sig, garanterar inte ett positivt kliniskt resultat av IVF-förfarandet.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi skulle vilja tacka embryologi laboratorium Reprofit International. Vi erkänner också kärnan anläggning CELLIM av CEITEC stöds av MEYS CR (LM2015062 Czech-bioimaging) för deras stöd med att få immunofluorescenografi data som presenteras här.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin Irvine Scientific 90164 bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture
Denuding micropipette 150 µm Microtech IVF 005-150C
Denuding micropipette 180 µm Microtech IVF 005-180B suitable for oocyte transfer between dishes
Denuding micropipette 200 µm Microtech IVF 005-250-A suitable for oocyte transfer between dishes
FluoroDish World Precision Instruments FD 5040-100 glass-bottom dish
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells)
Holding micropipette Microtech 001-120-30 sterile glass microneedles
Hyaluronidase solution Irvine Scientific 90101 for oocyte denudation
ICSI micropipette Microtech 002-5-30 sterile glass microneedles
Micro Droplet Culture Dish Vitrolife 16003 12-well plate for embryo culture
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin Irvine Scientific 90163 handling medium, MOPS/HEPES buffered
Nikon Eclipse TE 2000-U Nikon inverted microscope with heated stage
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 150270 plastic ICSI dish
Nunc non-treated 4-well IVF dish Thermo Fisher Scientific 179830 4-well plate for embryo culture
OCTAX polarAide MTG integrated PLM system
Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305 oil for overlay
Polyvinylpyrrolidone Irvine Scientific 90123 for sperm immobilization prior to ICSI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348, (6239), 1143-1147 (2015).
  2. Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18, (1), 1-11 (2012).
  3. Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. Springer. India, Mumbai, India. (2016).
  4. Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63, (3), 209-211 (2017).
  5. Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80, (2), 447-449 (2003).
  6. Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87, (5), 1022-1027 (2007).
  7. Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33, (11), 1501-1505 (2016).
  8. De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14, (7), 1859-1863 (1999).
  9. Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36, (3), 445-452 (2019).
  10. Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12, (4), 442-446 (2006).
  11. Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17, (4), 454-460 (2008).
  12. Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7, (1), 24-29 (2003).
  13. Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
  14. Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5, (2), 117-124 (2002).
  15. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75, (2), 348-353 (2001).
  16. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16, (7), 1464-1468 (2001).
  17. Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18, (4), 817-820 (2003).
  18. Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19, (3), 649-654 (2004).
  19. Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14, (2), 166-174 (2007).
  20. Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26, (3), 535-544 (2011).
  21. Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96, (2), 389-393 (2011).
  22. Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101, (2), 403-406 (2014).
  23. Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105, (4), 1085-1092 (2016).
  24. ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31, (4), 685-686 (2016).
  25. Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
  26. Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13, (5), 661-667 (2006).
  27. Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18, (6), 1289-1293 (2003).
  28. Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16, (2), 232-238 (2008).
  29. Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19, (1), 55-62 (2011).
  30. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16, (11), 2374-2378 (2001).
  31. Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12, (1), 65-70 (2004).
  32. Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19, (5), 1148-1154 (2004).
  33. Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37, (3), 279-290 (2018).
  34. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17, (1), 34-45 (2011).
  35. Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15, (5), 573-585 (2009).
  36. Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33, (5), 797-806 (2018).
  37. Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13, (8), 2223-2226 (1998).
Bedömning av Human ägg mognad och dess kliniska tillämpning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).More

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter