סלמונלה כרונית זיהום דלקת מעיים פיברוזיס

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל העכבר של סלמונלה פיברוזיס המעי מונחה הדומה הסימנים העיקריים מפתח פתולוגי של מחלת קרוהן כולל דלקת קיר ופיברוזיס. שיטה זו יכולה לשמש כדי להעריך גורמים מארחים לשנות את התוצאות הפיברוטיות באמצעות עכברים מוטציה המתוחזקות על C57Bl/6 רקע גנטי.

Abstract

רקמות פיברוזיס המאופיינת הצטברות פתולוגית של מטריקס מסחטות כגון קולגן היא תוצאה של דלקת מתמשכת ותיקון מוסדר. ב מחלת המעי הגס (IBD), פיברוזיס מוביל תצורות סטריקצ'ור חוזרים שבהם אין טיפול יעיל מלבד כריתת כירורגית. בשל התחלתה המאוחרת, התהליכים כי הכונן פיברוזיס הוא פחות לומד ובעיקר לא ידוע. לכן, סיבוכים פיברופטיים מייצגים אתגר מרכזי ב-IBD. בפרוטוקול זה, חזקה במודל vivo של סיסטיק מעיים מתוארת כאשר סטרפטומיצין טרום טיפול של C57Bl/6 עכברים ואחריו gavage אוראלי עם כיתה החיסון סלמונלה typhimurium ΔAroA מוטציה מוביל מושבת פתוגן מתמשך ו פיברוזיס של המעי. מתודולוגיות להכנת S. Typhimurium עבור החיסון, בדיקת הפתוגן העומסים המעי הטחול, והערכת התצהיר קולגן ברקמות המעי מוסברים. מודל זה מחלה ניסויית שימושי עבור בדיקת גורמים מארחים כי גם לשפר או להחריף את תקליטור כמו פיברוזיס מעיים.

Introduction

קוליטיס כיבית (UC) ו קרוהן מחלת (CD) הן שתי הצורות הגדולות של ibd והם מאופיינים כמו כרונית הפרעות דלקתיות במערכת העיכול ^1,2. הפרעות אלה יש השפעה גדולה על איכות החיים של החולים. תסמינים של IBD כוללים כאבי בטן, שלשול, בחילות, ירידה במשקל, חום, ועייפות³. מחקרים שנעשו לאחרונה זיהו גורמים גנטיים וסביבתיים שתורמים הפתוגנזה המחלה; הוא חשב כי גורמי סיכון כאלה לתרום הפרעה של מכשול האפיתל וכתוצאה מכך טרנסלוקציה או דגימות יתר של אנטיגנים לומיאל⁴. כתוצאה מכך, זה יוזם תגובה דלקתית מחריגה על פלורה הקומנדונית מתווכת על ידי תאים חיסוניים מעיים⁴. תכונות של סיבוכים הקשורים ibd יכול להאריך לאתרים מעבר למערכת העיכול המשפיעים על איברים שונים כולל המפרקים, העור, והכבד^1,2. סימנים מכילים של UC כוללים דלקת חמורה לפזר בדרך כלל מקומי במעי הגס¹. פתולוגיה של מחלות משפיעה על רירית ורירית המעיים של המעי וכתוצאה מכך כיבית שטחיים¹. לעומת זאת, תקליטור יכול להשפיע על כל חלק של מערכת העיכול למרות הראיות של מחלה נמצא בדרך כלל המעי הגס ו-הדימעי². יתר על כן, דלקת ב-CD הוא טרנסקיר, המשפיעה על כל השכבות של קיר המעי².

כמה גנים הרגישות IBD אשר זוהו מצביעים כי דיסרגולציה של המכשול האפיתל או חסינות הם תורמים קריטיים התקדמות המחלה⁵. מוטציות בתחום הנוקלאוטיד 2 (NOD2) מבוטא על ידי מונוציטים נמצאה קשורה עם רגישות מוגברת לתקליטור; זה מדגיש את הקשר בין זיהוי המערכת החיסונית שונה של רכיבים חיידקיים ואת המחלה⁶. לאחרונה הגנום-wide לימודי התאגדות (GWAS) חשפו מסלולים נוספים העלולים להיות מעורבים בפתוגנזה של IBD כולל וריאציות גנטיות ב: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R מסלולים תלויים מקושר לחסינות אדפטיבית, MUC1, MUC19 וPTGER4 בתחזוקת מחסומי מעיים, ובATG16L-מתווך מותאם אוטומטית^7,8,9. בעוד מחקרים אלה מבוססי האוכלוסייה הגנטיקה הגדילו את ההבנה שלנו של ibd, אללים הרגישות לבדה לא מספיקים ליזום ולקיים מחלה כרונית³. גורמים אחרים שאינם גנטיים כולל שינויים בהרכב microbiome בבטן וירידה בגיוון הקשורים לדלקת במעיים. עם זאת, לא ברור אם הבטן לפני או היא תוצאה של התגובות החיסונית מוסדר³. למרות האטיולוגיה של IBD נשאר ברור, ההבנה שלנו של הפתוגנזה של המחלה שופרה על ידי מודלים העכבר הניסיוני של דלקת המעיים^10,11. מודלים אלה באופן אינדיבידואלי אינם מייצגים באופן מלא את המורכבות של המחלה האנושית, אבל הם יקרי ערך להסבר מסלולים pathפסלוגיים כי יכול להיות רלוונטי IBD ולאימות של אסטרטגיות טיפוליות בלתי סופי^10, . בסדר, ¹¹ מודלים אלה עכבר בדרך כלל להסתמך על ייזום של דלקת על ידי אינדוקציה כימית או זיהום, העברת תאים חיסוניים, או מניפולציה גנטית. יתר על כן, אסטרטגיות אלה לעיתים קרובות כרוך רטבאליות בשלמות אפיתל או אפנון של חסינות מולדים או אדפטיבית.

סלמונלה בידור serovars הם פתוגנים מעיים שיכולים להדביק בני אדם ועכברים. לאחר בליעה, סלמונלה יכול ליישב את הבטן על ידי פלישה ישירה של epithelia, M תאים, או אנטיגן הצגת תאים¹². עכברים נגועים דרך הפה עם S. Typhimurium מביא את הקולוניזציה בעיקר של אתרים מערכתית כגון הטחול ובלוטות הלימפה מצע עם שפע נמוך יחסית במערכת העיכול¹². עם זאת, טיפול מקדים של עכברים עם סטרפטומיצין משפר את היעילות של סלמונלה מושבת המעיים על ידי הפחיתה את ההשפעות ההגנה המארחת של מיקרוביוטה נורמלי¹³. התכונות הפתולוגיים של מודל זה כוללות הפרעה או כיבית של מכשול האפיתל, גיוס גרנולוציט, ובצקת חמורה¹³. לחילופין, זיהום עם כיתות החיסון S. מוטציה ΔAroA typhimurium מוביל לקולוניזציה כרונית של מעי והמעי הגס הנמשכת עד היום 40 לאחר זיהום¹⁴. . הס' המתח ΔAroA typhimurium יש פגם בביוסינתזה של חומצות אמינו ארומטיות; זה הופך את זן מוטציה avirulent והוא יכול להיות מנוצל כחיסון יעיל מאוד¹⁵. זיהום אוראלי בעכברים מוביל Th1-ו-Th17-cytokine תגובה דלקתית הקשורים, שיפוץ רקמות נרחב, ואת התצהיר קולגן. פתולוגיה רקמות קשורה לרמות גבוהות של גורם פרו-פיברוטי כגון TGF-β1, CTGF, ו IGF¹⁴. הצלקות הטראנקינטיות שדווחו במודל זה מזכירים את תצורות של סטריקצ'ור שנצפו לעתים קרובות ב-IBD. האינדוקציה של פיברוזיס על ידי סלמונלה דורש התקפה אלימה על ידי האיים הפתוגניות של סלמונלה (SPI)-1 ו-2 ¹². . חשוב מכך, זה ה מודל הדלקת העור ΔAroA מהווה מערכת שימושית לחקר תגובות פיברוטיות בעכברים מוטנטים המתוחזקים ברקע C57/Bl6. הזן C57/Bl6 הוא רגיש מאוד ל -S. Typhiumurim SL1344 זיהום בשל אובדן של פונקציה מוטציה ב הגן קידוד ההתנגדות הטבעית הקשורים מקרופאג חלבון (nramp)-1^16,17. מצאנו כי IL-17A ו-רוα תלוי בתאי הלימפה מולדים הם תורמים חשובים בפתוגנזה במודל זה¹⁸.

סיבוך משמעותי של תקליטור הוא מוסדר ומוגזם התצהיר של מטריקס מסחטות (ecm) כולל קולגן^2,19. למרות מערכת העיכול יש קיבולת גבוהה יחסית להתחדשות, הצטלקות פיברוטיק יכול לנבוע בשל תגובות ריפוי הפצע לא פתורות המשויכים דלקת כרונית וחמורה^20,21. בתקליטור, התוצאה היא השפעות מדלשליליות על ארכיטקטורת הרקמה המובילה לפגיעה משמעותית באיברים^21,22. הטבע הטרנסציורי של הדלקת שנצפתה בתקליטור בסופו של דבר לפני העיבוי של קיר המעי הקשורים היצרות סימפטומטי או היווצרות סטריקצ'ור²¹. כשליש מהחולים בתקליטור דורשים כריתת מעיים של סיבוך זה²². אין טיפולים אנטי פיברופטיים יעילים ibd בהתחשב בכך שהשימוש בוקחת כגון azath, או אנטי-tnfα ביולוגי אין השפעה או רק בצניעות מופחתת הדרישה של התערבויות כירורגי^19,23 . בעוד סיסטיק הוא חשב להיות תוצאה של דלקת כרונית, תאים של מוצא mesenchymal כגון פיברותקיעות ו קרום הלב הם נחשבים מקורות סלולריים העיקרי של ecm בפיברוטיק צלקות^21,24. כרונית ס'. הזיהום ΔAroA typhimurium הוא מודל עכבר חזק של סיסטיק מעיים שיכול להציע תובנות לתוך הפתוגנזה של תכונות כמו תקליטור.

Protocol

כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קולומביה הבריטית.

1. הכנת סלמונלה typhimurium ΔAroA תרבויות לgavage אוראלי של עכברים

1. . מתוך מלאי של גליצרול קפוא Typhimurium ΔAroA, להכין צלחת פס באמצעות LB אגר המכיל 100 μg/mL סטרפטומיצין עם לולאה סטרילית. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c. ניתן לאחסן לוחות פס עד שבוע אחד ב -4 ° c.
2. יום אחד לפני זיהום, להכין אנטיביוטיקה על ידי המסת 0.5 g של סטרפטומיצין ב 2.5 mL של מים. לאחר מסנן הסטרפטומיצין פתרון חיטוי, בעל פה gavage העכברים באמצעות הנורה משופעת 22G gavage המחט ו 1 מזרק mL עם 100 μL של סטרפטומיצין פתרון (20 מ"ג סטרפטומיצין/מינון). באמצעות לולאה להגבר, איחסן 3 mL של ציר LB (50 μg/mL סטרפטומיצין) בצינור תרבות עם מושבה אחת. דגירה של סלמונלה תרבות aerobically ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 200 RPM.
3. ביום של זיהום, להכין את מינון הזיהום הסופי על ידי ביצוע 2 ברציפות 1/10 הדילול של תרבויות הלילה סלמונלה ב-PBS סטרילי. זה יגרום ה100 μL המכיל כ 3 x 10⁶ cfu.
4. באמצעות הנורה משופעת 22G gavage מחט מזרק 1 mL, gavage כל עכבר עם 100 μL של סלמונלה מוכנה.
   הערה: הכנת תרבויות סלמונלה באמצעות טכניקות אספטי. ריכוז החיסונים הסופי של סלמונלה עשוי להיות מאומת על ידי הציפוי מדלל סידורי על LB אגר עם סטרפטומיצין. המתח S. Typhimurium יכול להיות מושגת על ידי יצירת קשר עם פרופסור McNagny (kelly@brc.ubc.ca).

2. הערכת משאות סלמונלה ברקמות

1. הכינו 2 מ ל בטוח-נעילת, מיקרוצינורות התחתון עגול עם 1 מ ל של PBS סטרילי וחרוז פלדת אל-חלד בלוק. שוקלים מראש את החצוצרות. לפני איסוף הרקמה
2. . מורדמים על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני לאסוף רקמה מבעלי חיים בודדים בצינורות נפרדים. שוקלים את הצינורות. כדי לקבוע משקולות רקמה
3. הומוגון באמצעות מנגנון טחנת מערבל במשך 15 דקות ב-30 Hz. העברה 900 μL של PBS לכל טוב ב-96-מגתחת 2-mL. פיפטה 100 μL של רקמות הומוטים לתוך הבאר הראשונה, לערבב היטב, ולבצע דילול סדרתי על ידי הוספת 100 μL לבארות הבאים עד 10^-6 דילול מתקבל. צלחת 10 μL של כל דילול בטרילקטים אל LB אגר המכיל 100 μg/mL streptomcyin.
4. לספור ולהכפיל CFU הממוצע על ידי פקטור של 100 מאז 10 μL של המדגם 1000 μL היה מצופה, ואת פקטור הדילול המתאים. חלוקת משקל רקמות הכולל CFU על ידי משקולות רקמות כדי לקבוע CFU לכל גרם של רקמות.
   הערה: שמור את כל הדגימות על קרח או ב -4 ° c במהלך עיבוד רקמות. השתמש בעזרת מרחב הצינורות באמצעות מדלל סדרתי עם רקמה. הכינו את מיכל ה96 הטוב ביותר המכיל את ה-PBS.

3. פירובסיריוס אדום כתמים וכימות של קולגן.

1. לתקן רקמות cecal לילה ב 10% פורמלין באגירה ולהתכונן הטבעה פרפין. גזור מקטעים 5-μm עבור Picrosirius מכתים אדום כפי שמתואר בעבר²⁵.
2. לכידת תמונות ללא הפרדות צבע של כל חתך cecal על מיקרוסקופ ברייטפילד.
3. פתח את פיג'י (ImageJ) וגרור ושחרר את קובץ התמונה. tif אל סרגל הכלים.
4. בשורת התפריטים, בחר תמונה > הקלד > מחסנית RGB כדי לפצל את התמונה לערוצים אדומים, ירוקים וכחולים. החלק את הפס האופקי בתחתית החלונית כדי להגדיר את הערוץ לירוק.
5. פתח תמונה > כוונן > הכלי סף. התאם מגבלות מינימום ומקסימום כדי למנוע אותות רקע. לאחר הגדרת הסף הרצוי, סגור את כלי הסף ועבור לניתוח ≫ קביעת מדידות. בדוק את האזור, שבר אזור, הגבל אל הסף ותווית תצוגה.
6. שער מקטע הרקמה עם בחירות ביד או בחירת מצולע הכלי ולמדוד את% אזור חיובי עבור קולגן על ידי לחיצה על לנתח > מדידה.
7. לנרמל את האזור המוחלט חיובי עבור כתמים קולגן לאזור הרקמה.
   הערה: פיג'י (ImageJ) היא תוכנית מקור פתוח שניתן להוריד ב https://fiji.sc. תמונות עם תנאי לכידה זהה (כלומר, בהירות ומיקוד) חייב להיות מגבלות הסף זהה לכימות מדויקת. אם יש מכתים את הרקע בתוך הרקמה הנבחרת, למדוד את האזור המוחלט ולהחסיר אותו מהאזור חיובי עבור קולגן מתוך הרקמה כולה.

Representative Results

טיפול סטרפטומיצין ואחריו זיהום אוראלי עם S. Typhimurium ΔAroA מוביל לדלקת מעיים חזקה פיברוזיס במיוחד מעי (איור 1). בעול הפתוגן אופייני של 10⁸ עד 10⁹ cfu ל 1 גרם של מעי ו 10⁴ cfu per 1 g של הטחול ניתן לשחזר בעלי חיים נגועים (איור 2). הערכה של פיברוזיס ב picrosirius קטעי ויטראז אדום מציינים שיא פיברוזיס 21 ימים לאחר זיהום בעוד הרבה של הפתולוגיה נפתרה על ידי יום 42 pi (איור 3 ואיור 4). התצהיר הקולגן הוא מבוטא ביותר submucosa המעי תוך סיסטיק רירית הוא מתון יותר.

איור 1. תרשים של הסבנייה של היסטולוגיה, הערכת העמסה של סלמונלה וכימות ציטוקין.
קטע 1 המייצג את העצה cecal עשוי לשמש ניתוח ביטוי גנים בעוד קטע 2 יהיה קבוע ב 10% פורמלין באגירה עבור היסטולוגיה ו פלח 3 יהיה הומוגניים לספירה חיידקי.

. איור 2 . עול הפתוגן במעי ובטלנס
סלמונלה CFU לכל משקל של רקמה במהלך זיהום. דמות זו שונתה מ-Lo et al.²⁶. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. איור 3 פירובסיריוס אדום ויטראז ' חלקים של רקמת המעיים.
תמונות שדה בהיר של ceca מחיות נגוע בעלי חיים 21 ו 42 ימים לאחר S. . דלקת הטיפקס ΔAroA סרגל בקנה מידה, 200 μm. דמות זו שונתה מ-Lo et al.²⁶.

איור 4. ככמת של התצהיר של קולגן על ידי ניתוחים מורמטרים.
(א) psr + צביעתמנורמללאזור הרקמה. משמעות הנקבעת על-ידי מבחן ANOVA קרוקל-ווליס בכיוון אחד עם מבחן post של Dunns. * *, P < 0.01, נ, p > 0.05. דמות זו שונתה מ-Lo et al.²⁶. (ב) דוגמה לקוונפיקציה קולגן ברקמת cecal באמצעות פיג'י. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

ההבנה שלנו של הפתוגנזה של IBD היה משופר מאוד על ידי מודלים העכבר של דלקת במעיים. למרות מודלים בודדים כגון לא לכידה של כל התכונות של מחלת האדם מורכבים ורב עצרת, הם היו שימושיים בזיהוי תכונות מפתח של התקדמות המחלה. הטיות פיברוטית הקשורים IBD נשאר צורך קליני מרכזי מבחינה קלינית כאשר הטיפולים הנוכחיים אינם יעילים בהתפתחות מחלות היפוך. יתר על כן, המעי פיברוזיס קשה ללמוד בסביבה מעבדה בשל מגבלות על מודלים בעלי חיים נוכחיים. חשיפה כרונית כדי tnbs בעכברים balb/c הוכח לגרום קולגן חזק התצהיר במעי הגס כי הוא מונע על ידי IL-13 ו tgf-B1 איתות^27,28. עם זאת, מעיים פיברוזיס לא נצפתה בדרך כלל במודלים אחרים של מעבדה בשימוש שגרתי של קוליטיס כגון טיפול DSS, IL-10-לקויה, או המאמצת העברת מודלים תא T. Grassl et al. הפגינו זיהום מערכת העיכול כרונית של C57Bl6 עם החליש ΔAroA מוטציה סלמונלה להתאמץ התוצאות פיברוזיס חזקה באזורי רירית ו submucosal של מעי¹². הם דיווחו כי השיא פיברוזיס התרחשה שלושה שבועות לאחר הזיהום היה קשור עם Th1 ו Th17 חסינות וגורמים מוגבה פרו פיברוטיק TGF-B1, CTGF, ו IGF-1¹². פתולוגיה זו מזכירה את התקליטור כמו דלקת חמורה פיברוזיס היא טרנסקיר. בעוד IBD הוא בדרך כלל פרוגרסיבי, אחד המגבלה החשובה של מודל הזיהום סלמונלה כרונית הוא האופי הארעי של immunopathology פיברוטיק. ב C57Bl/6 עכברים, מחלת המעיים נפתרה בדרך כלל על ידי שבוע שישה לאחר ההדבקה. למרות זה מגיע, השלבים האחרונים של מודל זה זיהום יכול להיות מנוצל כדי לזהות גורמים או תהליכים המעורבים בקידום הפוגה המחלה²⁶.

למרות חיידקים מונחה פתוגן חיידקי של קוליטיס הם נחקרו היטב, אין קשר בין סלמונלה ו-CD. עם זאת, זה הוצע כי הגודל של המחלה הפיברוטית במהלך השלבים האחרונים של הקולוניזציה סלמונלה כרונית אינה מתאם ישירות עם נטל הפתוגן רומז כי הפתולוגיה היא "הפצת עצמית" פעם מעיים חמורות דלקת היא ביוזמת סלמונלה²⁹. לעומת זאת, הפתולוגית-פולשנית החיידק Esהאנציצ'יה (AIEC) הפתובאר היתה מקושרת מאוד לפיתוח התקליטור בשל שכיחות גבוהה ברירית ileal של חולים³⁰. בנוסף, מושבת aiec מתמשך (עד 9 שבועות) של ileum, מעי ונקודתיים של כמה זנים העכבר כולל C57Bl/6 מוביל הצטברות מטריצה חזקה בבטן דרך הביטוי הדגל ובכך להפגין את הפוטנציאל האינדוקציה הפיברוגניים של זה . פתובימונט^31,32 ההתפתחות האחרונה של זיהום מונחה מודלים של סיסטיק מעיים סיפקו מודלים ניסיוניים חזקים של IBD. אלה סיפקו מערכות חדשות לנתח את הקשר בין המינים בקטריאלי בידור כולל הגורמים התקפה אלימה שלהם, ומארח גורמים הרגישות שעשויים לשפר את ההבנה שלנו של IBD הקשורים פיברוזיס.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 ml round bottom safe lock tubes	Eppendorf	22363344
Stainless steel beads	Qiagen	69989
PBS	Gibco	10010031
Large-Orifice Pipet Tips	Fisher	2707134
2 mL megablock plates	Sarstedt	82.1972.002
Gavage needles	FST	18061-22
Streptomycin sulfate	Sigma	S9137
Mixer mill	Retsch	MM