Summary
Этот протокол описывает модель мыши Сальмонеллы инициативе кишечного фиброза, который напоминает ключевые патологические признаки болезни Крона, включая трансмурльное воспаление и фиброз. Этот метод может быть использован для оценки факторов, которые изменяют фиброзные исходы с помощью мышей-мутантов поддерживается на C57Bl/6 генетического фона.
Abstract
Ткань фиброз характеризуется патологическим накоплением внеклеточной матрицы, такие как коллаген является результатом постоянного воспаления и дисрегулируемого ремонта. При воспалительных заболеваниях кишечника (IBD) фиброз приводит к периодическим стрикционным образованиям, для которых нет эффективной терапии, кроме хирургической резекции. Из-за его позднего начала, процессы, которые управляют фиброзом менее изучены и в значительной степени неизвестны. Таким образом, фиброзные осложнения представляют собой серьезную проблему в IBD. В этом протоколе, надежная модель in vivo кишечного фиброза описывается, где стрептомицин предварительной обработки C57Bl/6 мышей следуют устные gavage с вакциной класса Salmonella Typhimurium мутант ароА приводит к стойкой колонизации патогена и фиброз цекума. Методики подготовки С. Объясняется тифимурий ЗароА для прививки, количественной оценки патогенных нагрузок в цекуме и селезенке, а также оценки осаждения коллагена в тканях кишечника. Эта экспериментальная модель заболевания полезна для изучения факторов, которые либо усиливают, либо усугубляют CD-подобный кишечный фиброз.
Introduction
Язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD) являются двумя основными формами IBD и характеризуются как хронические и рецидивирующих воспалительных расстройств желудочно-кишечного тракта 1,2. Эти расстройства оказывают значительное влияние на качество жизни пациентов. Симптомы IBD включают боли в животе, диарея, тошнота, потеря веса, лихорадка, и усталость3. Недавние исследования выявили генетические и экологические факторы, способствующие патогенеза болезней; считается, что такие факторы риска способствуют нарушению эпителиального барьера, что приводит к транслокации или перевыборе светящихся антигенов4. Как следствие, это инициирует аномальную воспалительную реакцию на коммунальную флору, опосредованный кишечными иммунными клетками4. Особенности IBD-связанных осложнений может распространяться на сайты за пределами желудочно-кишечного тракта, затрагивающих различные органы, включая суставы, кожу и печень1,2. Признаки UC включают тяжелые и диффузное воспаление обычно локализованы в толстой кишке1. Патология заболеваний поражает слизистую оболочку и субмукоз кишечника, что приводит к поверхностным язвам слизистойоболочки 1. В отличие от этого, CD может повлиять на любую часть желудочно-кишечного тракта, хотя доказательства болезни обычно встречаются в толстой кишке и дистальном илеуме2. Кроме того, воспаление в CD является трансмуральным, затрагивающих все слои стенки кишечника2.
Несколько генов восприимчивости IBD, которые были определены будет означать, что дисрегуляция эпителиального барьера или иммунитета являются критическиважными факторами прогрессирования болезни5. Мутации в домене нуклеотидной олигомеризации 2 (NOD2), выраженные моноцитами, были связаны с повышенной восприимчивостью к CD; это подчеркивает связь между измененным врожденным иммунным обнаружением бактериальных компонентов и заболеванием6. Более поздние исследования ассоциации генома (GWAS) выявили дополнительные пути, потенциально участвующие в патогенеза IBD, включая генетические вариации в: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R зависимых путей связаны с адаптивным иммунитетом, MUC1, MUC19, и PTGER4 в кишечном барьере обслуживания, и ATG16L-опосредованныйаутофагии7,8,9. Хотя эти популяционные исследования генетики улучшили наше понимание IBD, восприимчивость аллелей только, вероятно, недостаточно в иначинии и поддержания хронических заболеваний3. Другие негенетические факторы, включая изменения в составе микрофлоры кишечника и уменьшение разнообразия, были связаны с воспалением кишечника. Тем не менее, неясно, является ли дисбактериоз кишечника предшествует или является следствием дисрегулируемых иммунных реакций3. Хотя этиология IBD остается неясным, наше понимание патогенеза болезни была усилена экспериментальных моделей мыши кишечного воспаления10,11. Эти модели индивидуально не в полной мере представляют сложность болезни человека, но они являются ценными для выяснения патофизиологических путей, которые могут иметь отношение к IBD и для проверки предварительных терапевтических стратегий10, 11. Такие модели мыши обычно полагаются на начало воспаления химической индукции или инфекции, передачи иммунных клеток, или генетические манипуляции. Кроме того, эти стратегии часто включают возмущения в эпителиальной целостности или модуляции врожденного или адаптивного иммунитета.
Salmonella enterica серовары кишечных патогенов, которые могут инфицировать людей и мышей. После приема, Salmonella может колонизировать кишечник путем прямого вторжения эпителии, M клеток, или антигена представления клеток12. Мыши, инфицированные устно С. Typhimurium приводит к колонизации в первую очередь системных сайтов, таких как селезенка и брюшной лимфатической узлы с относительно низким изобилием в желудочно-кишечном тракте12. Тем не менее, предварительное лечение мышей стрептомицин повышает эффективность колонизации кишечника сальмонеллы за счет уменьшения принимающей защитные эффекты нормальной микробиоты13. Патологические особенности этой модели включают нарушение или язву эпителиального барьера, набор гранулоцитов и тяжелый отек13. Кроме того, инфекция вакциной класса S. Тифимурий ЗароА мутант приводит к хронической колонизации цекум и толстой кишки, которая сохраняется до дня 40 после инфекции14. С. Штамм Тифимурий ЗароА имеет дефект в биосинтезе ароматических аминокислот; это делает мутант штамм аврулентным и может быть использован в качестве высокоэффективной вакцины15. Устные инфекции у мышей приводит к Th1- и Th17-цитокинов связанных воспалительных ответ, обширные ткани ремоделирования, и осаждение коллагена. Ткань патологии связано с повышенным уровнем профиброзного фактора, таких как TGF-No1, CTGF, и IGF14. Трансморфальные фиброзные рубцы, зарегистрированные в этой модели, напоминают стриктурные образования, часто наблюдаемые в IBD. Индукция фиброза сальмонеллой требует вирулентности, кодированной патогенными островами Salmonella (SPI)-1 и 2 12. Важно, что это С. Модель инфекции Tymphimurium qAroA является полезной системой для изучения фиброзных реакций у мышей-мутантов, поддерживаемых на фоне C57/Bl6. Штамм C57/Bl6 чрезвычайно чувствителен к S. Typhiumurim SL1344 инфекция из-за потери функции мутации в гене кодирования естественной резистентности связанных макрофаг белка (NRAMP)-116,17. Мы обнаружили, что IL-17A и ROR-зависимые врожденные лимфоидные клетки являются важными факторами, способствующими патогенеза в этой модели18.
Основным осложнением CD является дисрегулируемое и чрезмерное осаждение внеклеточной матрицы (ECM), включая коллаген2,19. Хотя желудочно-кишечного тракта имеет относительно высокую способность к регенерации, фиброзные рубцы могут возникнуть из-за нерешенных реакций заживления ран, которые связаны с хроническим и тяжелым воспалением20,21. В CD, это приводит к пагубным последствиям для архитектуры тканей, что приводит к значительным нарушениям органов21,22. Трансмуральный характер воспаления наблюдается в CD в конечном счете предшествует утолщение стенки кишечника, связанные с симптоматическим стенозом или стриктурного образования21. Около трети пациентов cd требуют резекции кишечника для этого осложнения22. В IBD нет эффективных противофиброзных методов лечения, учитывая, что использование иммунодепрессантов, таких как азатиоприн или биопрепараты против ТНФЗ, не оказывает никакого влияния или лишь незначительно снижает потребность в хирургических вмешательствах19,23 . Хотя фиброз считается следствием хронического воспаления, клетки мезенхимального происхождения, такие как фибробласты и перициты, как полагают, являются основными клеточными источниками ECM в фиброзных рубцов21,24. Хронический С. Typhimurium ЗароА инфекции является надежной моделью мыши кишечного фиброза, которые могут предложить понимание патогенеза CD-подобных функций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии.
1. Подготовка сальмонеллы Typhimurium культур ароА для устных gavage мышей
- Из замороженного глицерола бульона С. Тифимур зароА, подготовить полоса пластины с помощью LB агар, содержащий 100 мкг /мл стрептомицина со стерильной инокуляции петли. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия. Полоса тыла может храниться до одной недели при 4 градусах Цельсия.
- За день до заражения подготовьте антибиотик, растворив 0,5 г стрептомицина в 2,5 мл воды. После фильтрации стерилизовать раствор стрептомицина, устно gavage мышей с помощью лампочки наконечником 22G gavage и шприц 1 мл со 100 зл стрептомицина раствор (20 мг стрептомицина / дозы). Используя инкуляционную петлю, привить 3 мл бульона LB (50 мкг/мл стрептомицина) в культурной трубке с одной колонией. Инкубировать сальмонеллы культуры аэробно на 37 градусов по Цельсию ночь с встряхиванием на 200 об/мин.
- В день заражения, подготовить окончательную дозу инфекции, выполняя 2 последовательных 1/10 разбавления ночных культур сальмонеллы в стерильных PBS. Это приведет к 100 МЛ инокулум, содержащий примерно 3 х 106 CFU.
- Используя лампу наконечником 22G gavage иглы и 1 мл шприц, gavage каждой мыши с 100 зл иглой подготовленных сальмонеллы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка культур сальмонеллы с использованием асептических методов. Окончательная концентрация прививки сальмонеллы может быть проверена путем покрытия серийных разбавлений на агарLB с стрептомицина. Штамм S. Typhimurium заароА можно получить, связавшись с профессором Макнаньи (kelly@brc.ubc.ca).
2. Оценка бремени сальмонеллы в тканях
- Приготовьте 2 мл безопасной блокировки, круглые нижние микротрубки с 1 мл стерильных PBS и автоклавированной нержавеющей стали. Предварительно взвесить трубки до сбора тканей.
- Резконизм цекаляющих и селезенковых тканей у мышей, усыпянных воздействием двуокиси углерода. Сбор ткани от отдельных животных в отдельных трубах. Взвесьте трубки, чтобы определить вес ткани.
- Гомогенизировать с помощью аппарата смесителя в течение 15 минут при 30 Гц. Передача 900 Л Л ПБС на скважину в 96-ну хорошо 2-мл мегаблока. Пипетка 100 л ткани гомогенаты в первый колодец, хорошо перемешать и выполнить серийные разбавления, добавив 100 зл к последующим скважинам до 10-6 разбавления не будет получено. Плита 10 л каждого разбавления в триплицирует на LB агар, содержащий 100 мкг/мл стрептомина.
- Подсчитайте и умножьте средний CFU в 100 раз, так как 10 л образца был покрыли, и соответствующий фактор разбавления. Разделите вес ткани общей CFU по весу ткани, чтобы определить CFU на грамм ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все образцы на льду или при 4 градусах По Цельсию во время обработки тканей. Используйте широкое провизию pipette советы при выполнении серийных разбавления с ткани гомогенатов. Заранее подготовьте мегаблок, содержащий PBS.
3. Picrosirius Красное окрашивание и количественная оценка коллагена.
- Исправить цекальные ткани на ночь в 10% буферизированных формалин и подготовиться к встраиванию парафина. Вырезать 5-мкм разделы для Picrosirius Красный окрашивания, как описано ранее25.
- Захват композитных изображений целых cecal поперечных сечений на ярком поле микроскопа.
- Откройте Фиджи (ImageJ) и перетащите и пересадите файл изображения .tif на панель инструментов.
- В меню бар, выберите Изображение и тип юgt; RGB стек разделить изображение на красный, зеленый и синий каналов. Сдвиньте горизонтальную панель в нижней части панели, чтобы установить канал на зеленый цвет.
- Открытое изображение (ru) и отрегулируйте инструмент порога. Отрегулируйте минимальные и максимальные лимиты, чтобы исключить любые фоновые сигналы. После того, как желаемый порог установлен, закрыть пороговый инструмент и перейти к анализу Проверьте область, площадь Фракция, Ограничение порога,и отображать этикетку.
- Ворота ткани разделе либо Freehand выбор или полигон выбор инструмент и измерить% области положительный для коллагена, нажав На анализ
- Нормализовать абсолютную область положительной для коллагена окрашивания в область ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи (ImageJ) является открытым исходным кодом программы, которые могут быть загружены в https://fiji.sc. Изображения с одинаковыми условиями захвата (т.е. яркость и фокус) должны иметь одинаковые предельные значения для точной количественной оценки. Если есть какие-либо фоновые окрашивания в выбранной ткани, измерить абсолютную площадь и вычесть его из области положительный для коллагена из всей ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стрептомицин лечение с последующим оральным инфекцией С. Тифимурий ЗароА приводит к сильному воспалению кишечника и фиброзу, особенно в цекуме(рисунок 1). Типичные патогенные нагрузки от 108 до 109 CFU на 1 г цекума и 104 CFU на 1 г селезенки могут быть восстановлены от инфицированных животных(рисунок 2). Оценка фиброза в picrosirius красные окрашенные цекалные секции указывают пик фиброз 21 дней после заражения в то время как большая часть патологии решается на день 42 pi(Рисунок 3 и Рисунок 4). Осаждение коллагена наиболее выражено в субмукозе кишечника, в то время как фиброз в слизистой оболочке мягче.
Рисунок 1. Диаграмма cecal секционирования для гистологии, оценки бремени сальмонеллы и количественной оценки цитокинов.
Сегмент 1, представляющий cecal наконечник может быть использован для анализа экспрессии генов, в то время как сегмент 2 будет зафиксирован в 10% буферизированном формалинове для гистологии, а сегмент 3 будет однороден для бактериального перечисления.
Рисунок 2. Патогенное бремя в ceca и селезенки.
Сальмонеллы CFU на вес ткани во время инфекции. Эта цифра была изменена с Lo et al.26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Picrosirius красные окрашенные поперечные сечения кишечной ткани.
Яркие полевые снимки ceca от неинфицированных животных и животных 21 и 42 дней после С. Инфекция Тифимуриум ЗароА. Шкала бар, 200 мкм. Эта цифра была изменена с Lo et al.26.
Рисунок 4. Количественная оценка осаждения коллагена с помощью морфометрических анализов.
(A) PSR' окрашивание нормализовано в область ткани. Значение определяется односторонним тестом ANOVA Kruskal-Wallis с пост-тестом Dunns. - П. Злт; 0,01, N.S., P Эта цифра была изменена с Lo et al.26. (B) Пример коллагена количественной оценки в цекаляной ткани с использованием Фиджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наше понимание патогенеза IBD было значительно усилено мышимодели кишечного воспаления. Хотя такие индивидуальные модели не подизглажают все особенности сложной и многофакторной болезни человека, они были полезны для выявления ключевых особенностей прогрессирования заболевания. Фиброзные строки, связанные с IBD остается одной из основных неудовлетворенных клинической необходимости, как нынешние методы лечения являются неэффективными в обратном развитии болезни. Кроме того, кишечный фиброз трудно изучать в лабораторных условиях из-за ограничений в современных моделях животных. Хроническое воздействие TNBS у мышей BALB/c, как было показано, вызывает надежное осаждение коллагена в толстой кишке, что приводится в движение IL-13 и TGF-B1 сигнализации27,28. Тем не менее, кишечный фиброз обычно не наблюдается в других обычно используемых лабораторных моделей колита, таких как лечение DSS, IL-10-дефицит, или приемных T-клеточных моделей передачи. Grassl et al. продемонстрировали, что хроническая желудочно-кишечная инфекция C57Bl6 с ослабленным штаммом мутантов Сальмонеллы приводит к сильному фиброзу в слизистых и подмышечных областях цекум12. Они сообщили, что пик фиброза произошло через три недели после заражения и был связан с T1 и Th17 иммунитета и повышенных профиброзных факторов TGF-B1, CTGF, и IGF-112. Эта патология напоминает CD, как тяжелое воспаление и фиброз трансмурфальный. Хотя IBD, как правило, прогрессивный, одним из важных ограничений хронической модели инфекции сальмонеллы является переходный характер фиброзной иммунопатологии. У мышей C57Bl/6 кишечные заболевания, как правило, решаются на шестой неделе после заражения. Несмотря на этот недостаток, последние этапы этой модели инфекции могут быть использованы для выявления факторов или процессов, участвующих в содействии ремиссии заболевания26.
Хотя бактериальные патогенные модели колита хорошо изучены, нет никакой связи между сальмонеллой и CD. Тем не менее, было предложено, что величина фиброзного заболевания на последних стадиях хронической колонизации сальмонеллы непосредственно не коррелирует с патогенным бременем, предполагая, что патология является "самораспространяющимся" после тяжелой кишечной воспаление инициируется сальмонеллы29. В отличие от этого, адепт-инвазивных Escherichia coli (AIEC) pathovar был тесно связан с развитием CD из-за его высокой распространенности в илальной слизистой оболочки пациентов30. Кроме того, стойкая колонизация AIEC (до 9 недель) из илеума, цекума и толстой кишки нескольких штаммов мыши, включая C57Bl/6, приводит к надежному накоплению матрицы в кишечнике через выражение flagellin, демонстрируя тем самым потенциал волокнистой индукции этого патобионт31,32. Недавнее развитие инфекционных моделей кишечного фиброза обеспечило надежные экспериментальные модели IBD. Они предоставили новые системы для вскрытия взаимосвязи между энтерическими бактериальными видами, включая их факторы вирулентности, и факторами восприимчивости хозяина, которые могут улучшить наше понимание фиброза, связанного с IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим Ингрид Барта за гистологические услуги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
References
- Danese, S., Fiocchi, C.
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J.
- Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
- Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
- Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
- Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
- Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
- Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Grassl, G. A., Finlay, B. B.
- Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
- Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
- Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
- Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
- Burke, J. P., et al.
- Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
- Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
- Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
- Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk? Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
- Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
- Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
- Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
- Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
- Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
- Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
- Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
- Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).
