Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Mausmodell der Salmonellen-getriebenen Darmfibrose, die den wichtigsten pathologischen Merkmalen der Morbus Crohn ähnelt, einschließlich transmuraler Entzündungen und Fibrose. Diese Methode kann verwendet werden, um Wirtsfaktoren zu bewerten, die fibrotische Ergebnisse mit mutierten Mäusen verändern, die auf einem c57Bl/6 genetischen Hintergrund gehalten werden.
Abstract
Gewebefibrose, die durch die pathologische Ansammlung extrazellulärer Matrix wie Kollagen gekennzeichnet ist das Ergebnis einer anhaltenden Entzündung und dysregulierten Reparatur. Bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) führt Fibrose zu wiederkehrenden Stricture-Formationen, für die es keine andere wirksame Therapie als chirurgische Resektion gibt. Aufgrund seines späten Beginns sind die Prozesse, die Fibrose antreiben, weniger untersucht und weitgehend unbekannt. Daher stellen fibrotische Komplikationen eine große Herausforderung bei IBD dar. In diesem Protokoll wird ein robustes In-vivo-Modell der Darmfibrose beschrieben, bei dem Streptomycin-Vorbehandlung von C57Bl/6-Mäusen, gefolgt von oraler Gavage mit Deminfizierung s. Fibrose des Cecums. Methoden zur Vorbereitung von S. Typhimurium -AroA zur Impfung, Quantifizierung von Pathogenlasten im Cecum und Milz und Bewertung der Kollagenablagerung in Darmgewebewerden werden erläutert. Dieses experimentelle Krankheitsmodell ist nützlich für die Untersuchung von Wirtsfaktoren, die CD-ähnliche Darmfibrose entweder verstärken oder verschlimmern.
Introduction
Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD) sind die beiden Hauptformen der IBD und werden als chronische und schubförmige entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes 1,2charakterisiert. Diese Störungen haben einen großen Einfluss auf die Lebensqualität der Patienten. Symptome von IBD sind Bauchschmerzen, Durchfall, Übelkeit, Gewichtsverlust, Fieber, und Müdigkeit3. Jüngste Studien haben genetische und Ökologische Faktoren identifiziert, die zur Pathogenese von Krankheiten beitragen; Es wird angenommen, dass solche Risikofaktoren zur Störung der Epithelbarriere beitragen, die zur Translokation oder Überprobenahmung von luminalen Antigenen4führt. Als Folge löst dies eine abnorme Entzündungsreaktion auf die beginnende Flora aus, die durch Darmimmunzellen vermittelt wird4. Merkmale der IBD-assoziierten Komplikationen können sich auf Standorte außerhalb des GI-Traktes erstrecken, die verschiedene Organe einschließlich Gelenke, Haut und Leberbetreffen 1,2. Markenzeichen von UC sind schwere und diffuse Entzündungen, die typischerweise im Dickdarm1lokalisiert sind. Krankheitspathologie wirkt sich auf die Schleimhaut und Submukose des Darms, was zu oberflächlichen Schleimhautgeschwüren1. Im Gegensatz dazu kann CD jeden Teil des GI-Traktes beeinflussen, obwohl Beweise für Krankheiten häufig im Dickdarm und distalen Ileum2gefunden werden. Darüber hinaus ist die Entzündung in CD transmural, die alle Schichten der Darmwandbetrifft 2.
Mehrere identifizierte IBD-Anfälligkeitsgene würden darauf hindeuten, dass die Dysregulation der Epithelbarriere oder -immunität einen kritischen Beitrag zum Fortschreiten der Krankheit s.5leistet. Mutationen in Dernuleotid-Oligomerisierungsdomäne 2 (NOD2), ausgedrückt durch Monozyten, wurden mit einer erhöhten Anfälligkeit für CD in Verbindung gebracht; Dies zeigt einen Zusammenhang zwischen dem veränderten angeborenen Immundetektion von bakteriellen Komponenten und der Krankheit6. Neuere genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben zusätzliche Wege ergeben, die potenziell an der Pathogenese von IBD beteiligt sind, einschließlich genetischer Variationen in: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R-abhängigen Pfaden verbunden mit adaptiver Immunität, MUC1, MUC19und PTGER4 bei der Wartung von Darmbarrieren und ATG16L-vermittelter Autophagie7,8,9. Während diese bevölkerungsbasierten genetischen Studien unser Verständnis von IBD verbessert haben, sind Anfälligkeitsallele allein wahrscheinlich nicht ausreichend, um chronische Krankheiten zu ins Leben zu erhalten und zu erhalten3. Andere nicht-genetische Faktoren wie Veränderungen in der Darmmikrobiomzusammensetzung und eine Verringerung der Diversität wurden mit Darmentzündungen in Verbindung gebracht. Es ist jedoch unklar, ob Darmdysbiose vorsteht oder die Folge von dysregulierten Immunantworten3ist. Obwohl die Ätiologie der IBD unklar bleibt, wurde unser Verständnis der Pathogenese der Krankheit durch experimentelle Mausmodelle der Darmentzündung10,11verbessert. Diese Modelle stellen einzeln nicht vollständig die Komplexität der menschlichen Krankheit dar, aber sie sind wertvoll für die Aufklärung pathophysiologischer Pfade, die für IBD relevant sein könnten, und für die Validierung vorläufiger therapeutischer Strategien10, 11. Solche Mausmodelle verlassen sich in der Regel auf die Einleitung von Entzündungen durch chemische Induktion oder Infektion, Immunzelltransfer oder genetische Manipulation. Darüber hinaus beinhalten diese Strategien oft Störungen in der epitheliaalen Integrität oder Modulation der angeborenen oder adaptiven Immunität.
Salmonella enterica serovars sind Darmpathogene, die Menschen und Mäuse infizieren können. Nach der Einnahme können Salmonellen den Darm durch direkte Invasion von Epithelien, M-Zellen oder Antigen-präsentierenden Zellen12besiedeln. Mäuse oral mit S infiziert Typhimurium führt zur Kolonisierung in erster Linie von systemischen Stellen wie der Milz und mesenterischen Lymphknoten mit relativ geringer Häufigkeit im GI-Trakt12. Jedoch, Vorbehandlung von Mäusen mit Streptomycin verbessert die Effizienz der Salmonellen-Kolonisation des Darms durch Verringerung der Wirt schutzfördernde Wirkung der normalen Mikrobiota13. Zu den pathologischen Merkmalen dieses Modells gehören die Störung oder Ulzeration der Epithelbarriere, granulozyte Rekrutierung und schwere Ödeme13. Alternativ kann eine Infektion mit der Impfstoffklasse S. Typhimurium -AroA Mutant führt zu chronischer Kolonisation des Zecums und Dickdarms, die bis zum Tag 40 nach der Infektion14anhält. Die S. Typhimurium -AroA-Stamm hat einen Defekt in der Biosynthese von aromatischen Aminosäuren; Dies macht den mutierten Stamm avirulent und kann als hochwirksamer Impfstoff verwendet werden15. Eine orale Infektion bei Mäusen führt zu einer Th1- und Th17-Zytokin-assoziierten Entzündungsreaktion, einer umfassenden Gewebeumgestaltung und Kollagenablagerung. Gewebepathologie ist verbunden mit erhöhten Niveaus der pro-fibrotischen Faktor wie TGF-Nr. 1, CTGF, und IGF14. Die in diesem Modell berichtete transmurale fibrotische Narbenbildung erinnert an Strengeformationen, die häufig bei IBD beobachtet werden. Die Induktion von Fibrose durch Salmonellen erfordert Virulenz, kodiert durch Salmonella Pathogenitätsinseln (SPI)-1 und 2 12. Wichtig ist, dass dieses S. Tymphimurium -AroA-Infektionsmodell ist ein nützliches System für die Untersuchung von fibrotischen Reaktionen bei mutierten Mäusen, die auf einem C57/Bl6-Hintergrund gehalten werden. Die C57/Bl6-Sorte ist extrem empfindlich gegenüber S. Typhiumurim SL1344-Infektion aufgrund einer Funktionsverlustmutation im Gen, die das natürliche resistenzassoziierte Makrophagenprotein (NRAMP)-116,17kodiert. Wir haben herausgefunden, dass IL-17A und ROR-abhängige lymphoide Zellen wichtige Beiträge zur Pathogenese in diesem Modell18sind.
Eine hauptverkompliktäre CD ist die dysregulierte und übermäßige Ablagerung der extrazellulären Matrix (ECM) einschließlich Kollagen2,19. Obwohl der GI-Trakt eine relativ hohe Regenerationsfähigkeit hat, kann fibrotische Narbenbildung durch ungelöste Wundheilungsreaktionen entstehen, die mit chronischen und schweren Entzündungen verbunden sind20,21. In CD führt dies zu schädlichen Auswirkungen auf die Gewebearchitektur, die zu einer signifikanten Organbeeinträchtigung führt21,22. Die transmurale Natur der entzündung, die in CD beobachtet wird, geht letztlich der Verdickung der Darmwand voraus, die mit symptomatischer Stenose oder Striktbildung verbunden ist21. Etwa ein Drittel der CD-Patienten benötigen eine Darmresektion für diese Komplikation22. Es gibt keine wirksamen antifibrotischen Therapien in IBD, da die Verwendung von Immunsuppressiva wie Azathioprin oder Anti-TNF-Biologika keine Auswirkungen haben oder nur geringfügig den Bedarf an chirurgischen Eingriffen reduziert19,23 . Während Fibrose wird angenommen, dass die Folge der chronischen Entzündung, Zellen mesenchymaler Herkunft wie Fibroblasten und Pericyten werden gedacht, um die primären zellulären Quellen von ECM in fibrotischen Narben21,24. Chronische S. Typhimurium -AroA-Infektion ist ein robustes Mausmodell der Darmfibrose, das Einblicke in die Pathogenese von CD-ähnlichen Merkmalen bieten kann.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care Committee der University of British Columbia genehmigt.
1. Herstellung von Salmonella Typhimurium -AroA-Kulturen zur oralen Gavage von Mäusen
- Aus einem gefrorenen Glycerinbestand von S. Typhimurium -AroA, bereiten Sie eine Streifenplatte mit LB-Agar mit 100 g/ml Streptomycin mit einer sterilen Impfschleife vor. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Streifenplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- Einen Tag vor der Infektion Antibiotika vorbereiten, indem Sie 0,5 g Streptomycin in 2,5 ml Wasser auflösen. Nach der Filtersterilisation Streptomycin-Lösung, oral gavage die Mäuse mit einer Glühbirne-tippsed 22G Gavage Nadel und 1 ml Spritze mit 100 l Streptomycin-Lösung (20 mg Streptomycin/Dosis). Mit einer Impfschleife 3 ml LB-Brühe (50 g/ml Streptomycin) in einem Kulturrohr mit einer einzigen Kolonie impfen. Salmonellenkultur aerob bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 RPM inkubieren.
- Am Tag der Infektion, bereiten endgültige Infektionsdosis durch Durchführung 2 aufeinander folgenden 1/10 Verdünnungen der über Nacht Salmonellenkulturen in sterilen PBS. Dies würde zu einem Inokulum von 100 l führen, das etwa 3 x 106 KBE enthält.
- Mit einer 22G-Gavage-Nadel mit Glühbirne und einer 1 ml Spritze jede Maus mit 100 l der vorbereiteten Salmonellen verkleben.
HINWEIS: Bereiten Sie Salmonellenkulturen mit aseptischen Techniken vor. Die endgültige Inokulationskonzentration von Salmonellen kann durch Plattieren von seriellen Verdünnungen auf LB-Agar mit Streptomycin überprüft werden. Die Sorte S. Typhimurium -AroA kann durch Kontaktaufnahme mit Professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca) erworben werden.
2. Bewertung der Salmonellenbelastungen im Gewebe
- Bereiten Sie 2 ml sichere, runde Bodenmikroröhrchen mit 1 ml sterilem PBS und einer autoklavierten Edelstahlperle vor. Vorwiegen der Schläuche vor der Gewebesammlung.
- Resektcecal und Milzgewebe von Mäusen, die durch Kohlendioxid-Exposition eingeschläfert wurden. Sammeln Sie Gewebe von einzelnen Tieren in separaten Röhrchen. Wiegen Sie die Rohre, um Gewebegewichte zu bestimmen.
- Homogenisieren Sie mit einem Mischermühlengerät für 15 min bei 30 Hz. Übertragen Sie 900 l PBS pro Brunnen in einem 96-well 2-ml Megablock. Die Pipette 100 l Desgewebe homogenisiert sich in den ersten Brunnen, mischt sich gut und führt serielle Verdünnungen durch, indem 100 l zu nachfolgenden Bohrungen hinzugefügt werden, bis eine Verdünnung von 10-6 erhalten ist. Platte 10 l jeder Verdünnung in Triplicaten auf LB-Agar mit 100 g/ml Streptomcyin.
- Zählen und multiplizieren Sie die durchschnittliche KBE mit dem Faktor 100, da 10 l der 1000-L-Probe plattiert wurde und der entsprechende Verdünnungsfaktor. Teilen Sie das Gewebegewicht gesamt KBE durch Gewebegewichte, um KBE pro Gramm Gewebe zu bestimmen.
HINWEIS: Bewahren Sie alle Proben während der Gewebeverarbeitung auf Eis oder bei 4 °C auf. Verwenden Sie Breit-Orifice-Pipettenspitzen, wenn Sie serielle Verdünnungen mit Gewebehomogenaten durchführen. Bereiten Sie den 96-Well-Megablock mit PBS im Voraus vor.
3. Picrosirius Rote Färbung und Quantifizierung von Kollagen.
- Fix Cecal Gewebe über Nacht in 10% gepuffertes Formalin und bereiten für Paraffin Einbettung. Schneiden Sie 5-m Abschnitte für Picrosirius Rote Färbung, wie zuvor beschrieben25.
- Erfassen Sie zusammengesetzte Bilder ganzer Cecal-Querschnitte auf einem Hellfeldmikroskop.
- Öffnen Sie Fidschi (ImageJ) und ziehen Sie die .tif-Bilddatei auf die Symbolleiste.
- Wählen Sie in der Menüleiste Bild > Typ > RGB-Stapel aus, um das Bild in rote, grüne und blaue Kanäle aufzuteilen. Schieben Sie die horizontale Leiste am unteren Rand des Bedienfelds, um den Kanal auf Grün festzulegen.
- Öffnen Sie Bild > Anpassen > Schwellenwertwerkzeug. Passen Sie die minimalen und maximalen Grenzwerte an, um Hintergrundsignale zu eliminieren. Sobald der gewünschte Schwellenwert festgelegt ist, schließen Sie das Schwellenwertwerkzeug, und wechseln Sie zu Analysieren > Messungen festlegen. Deaktivieren Sie Bereich, Flächenfraktion, Limit auf Schwellenwertund Anzeigebeschriftung.
- Gate the tissue section with either Freehand selections or Polygon selections tool and measure the % area positive for collagen by click Analyze > Measure.
- Normalisieren Sie den absoluten Bereich positiv für Kollagenfärbung zu Gewebebereich.
HINWEIS: Fidschi (ImageJ) ist ein Open-Source-Programm, das bei https://fiji.sc heruntergeladen werden kann. Bilder mit denselben Aufnahmebedingungen (d. h. Helligkeit und Fokus) müssen identische Schwellenwerte für eine genaue Quantifizierung aufweisen. Wenn es eine Hintergrundfärbung innerhalb des ausgewählten Gewebes gibt, messen Sie den absoluten Bereich und subtrahieren Sie ihn vom Bereich positiv für Kollagen aus dem gesamten Gewebe.
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Representative Results
Streptomycin-Behandlung gefolgt von einer oralen Infektion mit S. Typhimurium -AroA führt zu robusten Darmentzündungen und Fibrose vor allem im Cecum (Abbildung 1). Typische Krankheitsbelastungen von 108 bis 109 KBE pro 1 g Cecum und 104 KBE pro 1 g Milz können von infizierten Tieren zurückgewonnen werden (Abbildung 2). Die Beurteilung der Fibrose in picrosirius rot gefärbten Cecal-Abschnitten zeigt Spitzenfibrose 21 Tage nach der Infektion, während ein Großteil der Pathologie durch Tag 42 pi gelöst wird (Abbildung 3 und Abbildung 4). Kollagenablagerung ist am ausgeprägtesten in der Submukosa des Darms, während Fibrose in der Schleimhaut milder ist.
Abbildung 1. Diagramm der Cecal-Sektion für Histologie, Salmonellenlastbewertung und Zytokinquantifizierung.
Segment 1, das die Cecal-Spitze darstellt, kann für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, während Segment 2 in 10% gepuffertem Formalin für die Histologie fixiert wird und Segment 3 für die bakterielle Aufzählung homogenisiert wird.
Abbildung 2. Pathogenbelastungen in Ceca und Milz.
Salmonellen KBE pro Gewebegewicht während der Infektion. Diese Zahl wurde von Lo et al.26geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Picrosirius rot gefärbte Querschnitte des Darmgewebes.
Helle Feldbilder von Ceca von nicht infizierten Tieren und Tieren 21 und 42 Tage nach S. Typhimurium -AroA-Infektion. Schuppenstange, 200 m. Diese Zahl wurde von Lo et al.26geändert.
Abbildung 4. Quantifizierung der Kollagenablagerung durch morphometrische Analysen.
(A) PSR+ Färbung normalisiert in Gewebebereich. Signifikanz bestimmt durch einseitigen ANOVA Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Post-Test. **, P < 0,01, N.S., P > 0,05. Diese Zahl wurde von Lo et al.26geändert. (B) Beispiel für die Kollagenquantifizierung im Cecalgewebe mit Fidschi. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Unser Verständnis der Pathogenese von IBD wurde durch Mausmodelle von Darmentzündungen erheblich verbessert. Obwohl solche einzelseitigen Modelle nicht alle Merkmale der komplexen und multifaktoriellen menschlichen Krankheit rekapitulieren, waren sie nützlich bei der Identifizierung von Schlüsselmerkmalen des Krankheitsverlaufs. Fibrotische Strenge im Zusammenhang mit IBD bleibt ein großer unerfüllter klinischer Bedarf, da aktuelle Behandlungen bei der Umkehrung der Krankheitsentwicklung wirkungslos sind. Darüber hinaus ist Darmfibrose aufgrund von Einschränkungen in aktuellen Tiermodellen schwierig, in einem Labor zu untersuchen. Chronische Exposition gegenüber TNBS bei BALB/c-Mäusen hat gezeigt, dass eine robuste Kollagenablagerung im Dickdarm induziert wird, die durch IL-13 und TGF-B1-Signalisierung27,28angetrieben wird. Darmfibrose wird jedoch nicht häufig in anderen routinemäßig verwendeten Labormodellen der Kolitis wie DSS-Behandlung, IL-10-Mangel oder Adoptiv-T-Zelltransfermodellen beobachtet. Grassl et al. zeigten, dass eine chronische Magen-Darm-Infektion von C57Bl6 mit dem abgeschwächten,AroA-mutierten Salmonella-Stamm zu einer robusten Fibrose in den Schleimhaut- und Submukosalregionen des Cecum12führt. Sie berichteten, dass Spitzenfibrose trat drei Wochen nach der Infektion und war mit Th1 und Th17 Immunität underhöhte pro-fibrotische Faktoren TGF-B1, CTGF, und IGF-11 verbunden. Diese Pathologie erinnert an CD, da die schwere Entzündung und Fibrose transmural ist. Während IBD in der Regel progressiv ist, ist eine wichtige Einschränkung des chronischen Salmonellen-Infektionsmodells die vorübergehende Natur der fibrotischen Immunpathologie. Bei C57Bl/6-Mäusen wird die Darmerkrankung in der Regel bis Zur sechsten Woche nach einer Infektion gelöst. Trotz dieses Mangels können die letzten Stadien dieses Infektionsmodells genutzt werden, um Faktoren oder Prozesse zu identifizieren, die bei der Förderung der Krankheitsremission beteiligt sind26.
Obwohl bakterielle Pathogen-gesteuerte Modelle der Kolitis gut untersucht sind, gibt es keinen Zusammenhang zwischen Salmonellen und CD. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass das Ausmaß der fibrotischen Erkrankung in den letzten Stadien der chronischen Salmonellenbesiedlung nicht direkt mit Krankheitserregern korreliert, was darauf hindeutet, dass die Pathologie "selbstvermehrt" ist, sobald schwere Darmerkrankungen Entzündung wird durch Salmonella29initiiert. Im Gegensatz dazu ist der anhänger-invasive Escherichia coli (AIEC) Pathovar aufgrund seiner hohen Prävalenz in der Ilealschleimhaut von Patienten30stark mit der Entwicklung von CD verbunden. Darüber hinaus führt die anhaltende AIEC-Kolonisation (bis zu 9 Wochen) des Ileums, des Cecums und des Dickdarms mehrerer Mausstämme, einschließlich C57Bl/6, zu einer robusten Matrixakkumulation im Darm über flagellin-Expression und zeigt somit das fibrogene Induktionspotenzial dieser pathobiont31,32. Die jüngste Entwicklung von infektionsgetriebenen Modellen der Darmfibrose hat robuste experimentelle Modelle der IBD geliefert. Diese haben neue Systeme zur Sezieren der Beziehung zwischen enterischen Bakterienarten einschließlich ihrer Virulenzfaktoren und Wirtsanfälligkeitsfaktoren, die unser Verständnis von IBD-assoziierter Fibrose verbessern können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Ingrid Barta für die Histologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
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