Summary
Ce protocole décrit un modèle de souris de la fibrose intestinale salmonella conduite qui ressemble aux caractéristiques pathologiques clés de Crohn' la maladie de s comprenant l'inflammation transmurale et la fibrose. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les facteurs hôtes qui modifient les résultats fibrotiques à l'aide de souris mutantes maintenues sur un fond génétique C57Bl/6.
Abstract
La fibrose tissulaire caractérisée par l'accumulation pathologique de la matrice extracellulaire telle que le collagène est le résultat de l'inflammation persistante et de la réparation dysregulated. Dans la maladie inflammatoire d'entrailles (IBD), la fibrose mène aux formations récurrentes de restriction pour lesquelles il n'y a aucune thérapie efficace autre que la résection chirurgicale. En raison de son commencement tardif, les processus qui conduisent la fibrose sont moins étudiés et en grande partie inconnus. Par conséquent, les complications fibrotiques représentent un défi majeur dans IBD. Dans ce protocole, un modèle in vivo robuste de la fibrose intestinale est décrit où le pré-traitement de streptomycine des souris c57Bl/6 suivi du gavage oral avec le mutant salmonella Typhimurium de qualité vaccinale d'AroA mène à la colonisation persistante d'agent pathogène et fibrose du cecum. Méthodologies pour la préparation de S. Typhimurium 'AroA pour l'inoculation, quantifier les charges pathogènes dans le cecum et la rate, et évaluer le dépôt de collagène dans les tissus intestinaux sont expliqués. Ce modèle expérimental de maladie est utile pour examiner des facteurs d'hôte qui augmentent ou exacerbent la fibrose intestinale CD-like.
Introduction
La colite ulcéreuse (UC) et la maladie de Crohn (CD) sont les deux formes principales d'IBD et sont caractérisées en tant que désordres inflammatoires chroniques et rechutants du tractus gastro-intestinal 1,2. Ces troubles ont un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Les symptômes de la MII comprennent des douleurs abdominales, de la diarrhée, des nausées, une perte de poids, de la fièvre et de la fatigue3. Des études récentes ont identifié des facteurs génétiques et environnementaux qui contribuent à la pathogénie de la maladie; on pense que ces facteurs de risque contribuent à la perturbation de la barrière épithéliale entraînant la translocation ou le suréchantillonnage des antigènes luminals4. En conséquence, ceci initie une réponse inflammatoire aberrante à la flore commensal médiée par les cellules immunitaires intestinales4. Les caractéristiques des complications associées aux MII peuvent s'étendre à des sites au-delà du tractus gastro-intestinal affectant divers organes, y compris les articulations, la peau et le foie1,2. Les marques de l'UC incluent l'inflammation grave et diffuse typiquement localisée dans les deux points1. La pathologie de la maladie affecte la muqueuse et la sous-muqueuse de l'intestin entraînant des ulcérations muqueuses superficielles1. En revanche, CD peut affecter n'importe quelle partie du tractus gastro-intestinal bien que l'évidence de la maladie soit généralement trouvée dans le côlon et l'ilém distal2. En outre, l'inflammation dans le CD est transmural, affectant toutes les couches de la paroi intestinale2.
Plusieurs gènes de susceptibilité aux MII qui ont été identifiés indiqueraient que la dysrégulation de la barrière ou de l'immunité épithéliale est un facteur essentiel de la progression de la maladie5. Les mutations dans le domaine d'oligomerization de nucléotide 2 (NOD2) exprimées par des monocytes se sont avérées associées à la susceptibilité accrue au CD ; ceci met en évidence un lien entre la détection immunitaire innée altérée des composants bactériens et la maladie6. Des études d'association plus récentes à l'échelle du génome (GWAS) ont révélé d'autres voies potentiellement impliquées dans la pathogénie de la MII, y compris les variations génétiques dans : STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R voies dépendantes lié à l'immunité adaptative, MUC1, MUC19, et PTGER4 dans l'entretien des barrières intestinales, et ATG16L-mediated autophagie7,8,9. Bien que ces études génétiques basées sur la population aient amélioré notre compréhension des MII, les alleles de susceptibilité seuls sont probablement insuffisants pour initier et soutenir la maladie chronique3. D'autres facteurs non génétiques, y compris des altérations de la composition du microbiome intestinal et une réduction de la diversité, ont été associés à une inflammation intestinale. Cependant, il n'est pas clair si la dysbiose intestinale précède ou est la conséquence des réponses immunitaires dysrégulées3. Bien que l'étiologie de la MII reste incertaine, notre compréhension de la pathogénie de la maladie a été améliorée par des modèles expérimentaux de souris de l'inflammation intestinale10,11. Ces modèles individuellement ne représentent pas pleinement la complexité de la maladie humaine, mais ils sont précieux pour élucider les voies pathophysiologiques qui pourraient être pertinentes pour les MII et pour la validation des stratégies thérapeutiques provisoires10, 11. Ces modèles de souris reposent généralement sur l'initiation de l'inflammation par induction chimique ou d'infection, le transfert de cellules immunitaires, ou la manipulation génétique. En outre, ces stratégies impliquent souvent des perturbations dans l'intégrité épithéliale ou la modulation de l'immunité innée ou adaptative.
Salmonella enterica serovars sont des agents pathogènes intestinaux qui peuvent infecter les humains et les souris. Après l'ingestion, Salmonella peut coloniser l'intestin par invasion directe d'épithélia, de cellules M ou de cellules présentant des antigènes12. Souris infectées par la s. Typhimurium résultats dans la colonisation principalement des sites systémiques tels que la rate et les ganglions lymphatiques mésentériques avec une abondance relativement faible dans le tractusgastro-intestinal 12. Cependant, le prétraitement des souris avec la streptomycine améliore l'efficacité de la colonisation de Salmonella de l'intestin en diminuant les effets protecteurs d'hôte du microbiote normal13. Les dispositifs pathologiques de ce modèle incluent la perturbation ou l'ulcération de la barrière épithéliale, le recrutement de granulocyte, et l'oème grave13. Alternativement, l'infection par le vaccin de catégorie S. Typhimurium 'AroA mutant conduit à la colonisation chronique du cecum et du côlon qui persiste jusqu'au jour 40 après l'infection14. Le S. La souche Typhimurium 'AroA a un défaut dans la biosynthèse des acides aminés aromatiques; cela rend la souche mutante avirulente et peut être utilisé comme un vaccin très efficace15. L'infection orale chez les souris mène à une réponse inflammatoire associée de Th1- et de Th17-cytokine, au remodelage étendu de tissu, et au dépôt de collagène. La pathologie tissulaire est associée à des niveaux élevés de facteur pro-fibrotique tels que le TGF-1, le CTGF et l'IGF14. Les cicatrices fibrotiques transmuriques rapportées dans ce modèle rappellent les formations de restriction souvent observées dans IBD. L'induction de la fibrose par Salmonella nécessite une virulence codée par salmonella pathogenicité îles (SPI)-1 et 2 12. Fait important, ce S. Le modèle d'infection tymphimurium d'AroA est un système utile pour l'étude des réponses fibrotiques chez les souris mutantes maintenues sur un fond c57/Bl6. La souche C57/Bl6 est extrêmement sensible au S. Typhiumurim SL1344 infection due à une mutation de perte de fonction dans le gène codant la protéine macrophage associée à la résistance naturelle (NRAMP)-116,17. Nous avons constaté que les cellules lymphoïdes innées dépendantes de l'IL-17A et de la ROR sont des facteurs importants de la pathogénie dans ce modèle18.
Une complication majeure du CD est le dépôt dysrégulé et excessif de la matrice extracellulaire (ECM) y compris le collagène2,19. Bien que le tractus gastro-intestinal ait une capacité relativement élevée de régénération, les cicatrices fibrotiques peuvent survenir en raison de réponses non résolues de guérison des plaies qui sont associées à une inflammation chronique et sévère20,21. En CD, cela entraîne des effets délétères sur l'architecture tissulaire conduisant à une déficience importante des organes21,22. La nature transmurimurale de l'inflammation observée dans le CD précède finalement l'épaississement de la paroi intestinale associée à la sténose symptomatique ou à la formation de restriction21. Environ un tiers des patients de CD ont besoin de résection intestinale pour cette complication22. Il n'existe pas de thérapies antifibrotiques efficaces dans les MII étant donné que l'utilisation d'immunosuppresseurs tels que l'azathioprine ou les produits biologiques anti-TNMD n'a pas d'impact ou seulement modestement réduit l'exigence d'interventions chirurgicales19,23 . Tandis que la fibrose est vraisemblablement la conséquence de l'inflammation chronique, les cellules d'origine mesenchymal telles que des fibroblastes et des périrites sont vraisemblablement les sources cellulaires primaires de l'ECM dans la cicatrisation fibrotique21,24. S chronique. L'infection au Typhimurium est un modèle robuste de fibrose intestinale qui peut offrir un aperçu de la pathogénie des caractéristiques semblables à des CD.
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Protocol
Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l'Université de la Colombie-Britannique.
1. Préparation des cultures Salmonella Typhimurium 'AroA pour le gavage oral des souris
- À partir d'un stock de glycérol congelé de S. Typhimurium AroA, préparer une plaque de stries à l'aide d'agar LB contenant 100 g/mL de streptomycine avec une boucle inoculante stérile. Incuber toute la nuit à 37 oC. Les plaques de stries peuvent être stockées jusqu'à une semaine à 4 oC.
- Un jour avant l'infection, préparez l'antibiotique en dissolvant 0,5 g de streptomycine dans 2,5 ml d'eau. Après le filtre de la solution streptomycine stérévissante, gavage orale les souris à l'aide d'une aiguille à pointe d'ampoule 22G gavage et 1 mL seringue avec 100 L de solution de streptomycine (20 mg de streptomycine / dose). À l'aide d'une boucle inoculante, inoculer 3 ml de bouillon LB (50 g/mL de streptomycine) dans un tube de culture avec une seule colonie. Incuber la culture Salmonella aérobie à 37 oC pendant la nuit en secouant à 200 tr/min.
- Le jour de l'infection, préparer la dose finale d'infection en effectuant 2 dilutions consécutives 1/10 des cultures salmonella du jour au lendemain dans le PBS stérile. Il en résulterait un inoculum de 100 l contenant environ 3 x 106 CFU.
- À l'aide d'une aiguille à gavage 22G à pointe d'ampoule et d'une seringue de 1 ml, gavage chaque souris avec 100 l de la Salmonella préparée.
REMARQUE : Préparer les cultures de Salmonella en utilisant des techniques aseptiques. La concentration finale d'inoculation de Salmonella peut être vérifiée en placage des dilutions sérielles sur l'agar de LB avec la streptomycine. La souche S. Typhimurium 'AroA peut être obtenue en communiquant avec le professeur McNagny (kelly@brc.ubc.ca).
2. Évaluation des charges de Salmonella dans les tissus
- Préparer 2 mL de microtubes à fond rond avec 1 ml de PBS stérile et une perle en acier inoxydable autoclaved. Pré-peser les tubes avant la collecte des tissus.
- Reséquez les tissus cécal et spléniques de souris euthanasiées par l'exposition au dioxyde de carbone. Recueillir les tissus d'animaux individuels dans des tubes séparés. Peser les tubes pour déterminer les poids des tissus.
- Homogérisez à l'aide d'un appareil de mélangeur pendant 15 min à 30 Hz. Transférer 900 L de PBS par puits dans un mégabloc de 96 puits de 2 ml. Pipette 100 L de tissus homogénéise dans le premier puits, bien mélanger, et effectuer des dilutions en série en ajoutant 100 L aux puits suivants jusqu'à ce qu'une dilution de 10-6 soit obtenue. Plaque 10 l de chaque dilution dans des tripliques sur une gélose LB contenant 100 g/mL de streptomcyin.
- Compter et multiplier la moyenne de CFU par un facteur de 100 puisque 10 L de l'échantillon de 1000 L ont été plaqués, et le facteur de dilution approprié. Divisez le poids total des tissus CFU par poids tissulaire pour déterminer cFU par gramme de tissu.
REMARQUE : Conserver tous les échantillons sur la glace ou à 4 oC pendant le traitement des tissus. Utilisez des pointes de pipette à large orifice lors de l'exécution de dilutions en série avec des homogénéates tissulaires. Préparer le mégabloc de 96 puits contenant PBS à l'avance.
3. Picrosirius Teinture rouge et quantification du collagène.
- Fixez les tissus cécalifs pendant la nuit dans une formaline tamponnée de 10 % et préparez-vous à l'incorporation de paraffine. Coupez des sections de 5 m pour picrosirius Rouge comme décrit précédemment25.
- Capturez des images composites de sections transversales entières de cecal sur un microscope de brightfield.
- Ouvrez Fidji (ImageJ) et faites glisser et déposer le fichier d'image .tif sur la barre d'outils.
- Sur la barre de menu, sélectionnez Image 'gt; Type 'gt; RGB Stack pour diviser l'image en canaux rouges, verts et bleus. Faites glisser la barre horizontale au bas du panneau pour définir le canal en vert.
- Ouvrez l'image et l'outil D'ajustement. Ajuster les limites minimales et maximales pour éliminer les signaux d'arrière-plan. Une fois que le seuil souhaité est fixé, fermez l'outil de seuil et allez à analyser les mesuresde l'ensemble . Cochez la zone, La fraction de zone,limite au seuil,et l'étiquette d'affichage.
- Portez la section de tissu avec des sélections à main levée ou outil de sélection de polygone et mesurez la zone de % positive pour le collagène en cliquant sur Analyser 'gt; Mesurer.
- Normaliser la zone absolue positive pour la coloration du collagène à la zone tissulaire.
REMARQUE: Fidji (ImageJ) est un programme open-source qui peut être téléchargé à https://fiji.sc. Les images présentant les mêmes conditions de capture (c.-à-d. luminosité et mise au point) doivent avoir des limites de seuil identiques pour une quantification précise. S'il y a n'importe quelle tache de fond dans le tissu choisi, mesurez la zone absolue et soustrayez-la de la zone positive pour le collagène du tissu entier.
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Representative Results
Traitement de la streptomycine suivi d'une infection buccale par S. Typhimurium 'AroA conduit à une inflammation intestinale robuste et la fibrose en particulier dans le cecum (Figure 1). Les charges pathogènes typiques de 108 à 109 UFC pour 1 g de cecum et de 104 CFU par 1 g de rate peuvent être récupérées sur des animaux infectés (figure 2). L'évaluation de la fibrose dans les sections de cécal teintées rouges picrosirius indique la fibrose maximale 21 jours après l'infection tandis qu'une grande partie de la pathologie est résolue par le jour 42 pi (Figure 3 et Figure 4). Le dépôt de collagène est plus prononcé dans la submucosa de l'intestin tandis que la fibrose dans la muqueuse est plus douce.
Figure 1. Diagramme de section de cécal pour l'histologie, évaluation de charge de Salmonella, et quantification de cytokine.
Le segment 1 représentant la pointe cécale peut être utilisé pour l'analyse de l'expression génique, tandis que le segment 2 sera fixé en formaline tamponnée de 10 % pour l'histologie et le segment 3 sera homogénéisé pour l'énumération bactérienne.
Figure 2. Les charges pathogènes dans ceca et rates.
Salmonella (Salmonella) CFU par poids de tissu pendant le cours de l'infection. Ce chiffre a été modifié à partir de Lo et coll.26. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Sections croisées teintées rouges de Picrosirius du tissu intestinal.
Images de champ lumineuses de ceca des animaux et des animaux non infectés 21 et 42 jours après S. Infection au Typhimurium et à l'AroA. Barre à l'échelle, 200 m. Ce chiffre a été modifié à partir de Lo et coll.26.
Figure 4. Quantification des dépôts de collagène par des analyses morphométriques.
(A) coloration PSRMD normalisée à la zone tissulaire. Importance déterminée par un test ANOVA Kruskal-Wallis à sens unique avec Dunns post test. P , lt; 0,01, N.S., P - 0,05. Ce chiffre a été modifié à partir de Lo et coll.26. (B) Exemple de quantification du collagène dans le tissu cécal à l'aide de Fidji. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Notre compréhension de la pathogénie de la MII a été grandement améliorée par des modèles murins de l'inflammation intestinale. Bien que ces modèles individuels ne récapitulent pas toutes les caractéristiques de la maladie humaine complexe et multifactorielle, ils ont été utiles pour identifier les principales caractéristiques de la progression de la maladie. Les restrictions fibrotiques associées aux MII demeurent un besoin clinique non satisfait majeur, car les traitements actuels sont inefficaces pour inverser le développement de la maladie. En outre, la fibrose intestinale est difficile à étudier en laboratoire en raison des limitations dans les modèles animaux actuels. L'exposition chronique au TNBS chez les souris BALB/c a été montrée pour induire le dépôt robuste de collagène dans le côlon qui est conduit par IL-13 et TGF-B1 signalant27,28. Cependant, la fibrose intestinale n'est pas couramment observée dans d'autres modèles de laboratoire couramment utilisés de colite comme le traitement d'EST, IL-10-déficient, ou les modèles adoptifs de transfert de cellule T. Grassl et coll. ont démontré que l'infection gastro-intestinale chronique de C57Bl6 avec la souche Salmonella mutante atténuée d'AroA entraîne une fibrose robuste dans les régions muqueuses et submucosales du cecum12. Ils ont rapporté que la fibrose maximale s'est produite trois semaines après l'infection et a été associée à l'immunité de Th1 et de Th17 et aux facteurs pro-fibrotic élevés TGF-B1, CTGF, et IGF-112. Cette pathologie n'est pas sans rappeler le CD car l'inflammation et la fibrose graves sont transmuriques. Tandis que IBD est typiquement progressif, une limitation importante du modèle chronique d'infection de Salmonella est la nature transitoire de l'immunopathologie fibrotique. Chez les souris C57Bl/6, la maladie intestinale est généralement résolue par la semaine six après l'infection. Malgré cette lacune, les dernières étapes de ce modèle d'infection peuvent être utilisées pour identifier les facteurs ou les processus impliqués dans la promotion de la rémission de la maladie26.
Bien que les modèles de colite s'agitent par des agents pathogènes bactériens soient bien étudiés, il n'y a aucune association entre Salmonella et CD. Cependant, il a été proposé que l'ampleur de la maladie fibrotique au cours des derniers stades de la colonisation chronique de Salmonella ne soit pas directement corrélée avec les charges pathogènes suggérant que la pathologie est « auto-propagation » une fois grave intestinale l'inflammation est initiée par Salmonella29. En revanche, le pathovar d'Escherichia coli (AIEC) adhérent-invasif a été fortement lié au développement de CD en raison de sa prédominance élevée dans la muqueuse ilale des patients30. En outre, la colonisation persistante de l'AIEC (jusqu'à 9 semaines) de l'ilém, du cecum et du côlon de plusieurs souches de souris, y compris C57Bl/6, conduit à une accumulation de matrice robuste dans l'intestin par l'expression de flagelline démontrant ainsi le potentiel fibrogénique d'induction de cette pathobiont31,32. Le développement récent de modèles de fibrose intestinale fondés sur l'infection a fourni des modèles expérimentaux robustes de MII. Ceux-ci ont fourni de nouveaux systèmes pour disséquer la relation entre les espèces bactériennes entériques, y compris leurs facteurs de virulence, et les facteurs de susceptibilité de l'hôte qui peuvent améliorer notre compréhension de la fibrose associée aux MII.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts financier à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Ingrid Barta pour ses services d'histologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 ml round bottom safe lock tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| PBS | Gibco | 10010031 | |
| Large-Orifice Pipet Tips | Fisher | 2707134 | |
| 2 mL megablock plates | Sarstedt | 82.1972.002 | |
| Gavage needles | FST | 18061-22 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Mixer mill | Retsch | MM |
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