Summary
여기에서, 우리는 오픈 흉부 수술 접근법을 사용하여 마우스에 있는 우심실 및 폐 동맥의 침략적인 혈역학 평가를 능력을 발휘하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
폐 동맥 고혈압 (PAH)는 만성 및 심한 심폐 장애입니다. 마우스는이 질병을 모방 하는 데 사용 하는 인기 있는 동물 모델. 그러나, 우심실 압력의 평가 (RVP) 및 폐 동맥 압력 (PAP) 쥐에 기술적으로 도전 남아. RVP와 PAP는 좌우 심장 시스템 사이의 해부학적 차이 때문에 좌심실 압력보다 측정하기가 더 어렵습니다. 이 백서에서는 건강한 PAH 마우스를 사용하여 안정된 우심혈역학 측정 방법과 그 유효성 검사를 설명합니다. 이 방법은 오픈 가슴 수술 및 기계 환기 지원을 기반으로합니다. 그것은 닫힌 가슴 절차에 비해 복잡한 절차입니다. 이 수술에 잘 훈련 된 외과 의사가 필요하지만,이 절차의 장점은 동시에 RVP및 PAP 매개 변수를 모두 생성 할 수 있다는 것입니다, 그래서 PAH 모델의 평가를위한 바람직한 절차입니다.
Introduction
폐 동맥 고혈압 (PAH)은 작은 폐 동맥의 세포 증식 및 섬유증에 의해 유발되는 폐 동맥 압력 (PAP) 및 우심실 압력 (RVP)의 상승과 만성 및 심한 심폐 장애입니다. 1. 또한 스완 간츠 카테터라고 폐 동맥 카테터2,일반적으로 RVP와 PAP의 임상 모니터링에 사용됩니다. 또한, 무선 PAP 모니터링 시스템은 임상적으로3,4,5를사용되어 왔다. 마우스에서 연구를 위한 질병을 모방하기 위하여는, 저산소 환경은 PAH6의인간적인 임상 표현을 시뮬레이션하기 위하여 이용됩니다. 동물에서 PAP의 평가에서, 큰 동물은 인간 피험자와 동일한 기술을 사용하여 폐 동맥 카테터를 통해 상대적으로 모니터링하기 쉽지만, 쥐와 마우스와 같은 작은 동물은 작은 체형 때문에 평가하기가 어렵습니다. 마우스에서 우심실 시스템의 혈역학 측정은 초소형 1 Fr 카테터7로가능합니다. 마우스에서 RVP 및 PAP를 측정하는 방법은 문헌8,9에보고되었지만, 방법론은 상세한 설명이 부족하다. RVP와 PAP는 좌우 심장 시스템 사이의 해부학적 차이 때문에 좌심실 압력보다 측정하기가 더 어렵습니다.
동일한 마우스에서 PAP 및 RVP 매개 변수를 모두 얻으려면 오른쪽 심장 혈역학 측정을 위한 개방형 흉부 수술 기반 접근법, 건강 및 PAH 마우스와의 검증, 복잡한 오픈 가슴 동안 인공 데이터 생성을 방지하는 방법에 대해 설명합니다. 수술. 이 기술은 잘 훈련 된 외과 의사에 의해 가장 잘 수행되지만, 동일한 마우스에서 PAP 및 RVP를 평가 할 수있는 장점이 있습니다.
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Protocol
동물 프로토콜은 후와이 병원, 중국 의학 아카데미, 북경 연합 의과 대학 (NO.0000287)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 실험동물은 중국의 동물복지 지침에 따라 사육되고 먹이를 주었다.
참고: 8-12주령의 수컷 C57BL 마우스는 12시간 암/12시간 광주기를 가진 환경에 보관하였다. PAH 마우스는 10%의 산소 농도 하에서 4주 동안 보관되었고, 산소 조절 저산소증 챔버에 의해 유지되어 폐 고혈압을 유도하고, 대조군 마우스는 동일한 조건하에서 실내 공기(21%의 산소)에 보관하였다. RVP 및 PAP 측정은 저산소증 도전의 4 주 끝에 수행되었다.
1. 수술 전 준비
- 혈역학 실험 전에 적어도 30 분 동안 실온에서 0.9 % 식염수로 압력 트랜스듀서 카테터 (크기 : 1 Fr)를 담급니다.
- 0.22 μm 필터로 2,2,2-Tribromoethanol 용액을 걸레로 걸레로 4도 냉장고에 보관하십시오.
- 청소 수술 도구 및 수술 장갑과 같은 용품을 준비합니다.
- 카테터 세척을 위해 1.0% 소화 효소 용액 10 mL을 준비하십시오.
- 압력 트랜스듀서 카테터를 압력 부피 시스템에 연결합니다.
- 각 마우스에 대한 압력 측정을 얻기 전에 압력 변환기를 보정합니다.
- 교정 노브를 0mmHg 및 25mmHg로 돌려 데이터 수집 소프트웨어에 검증 압력 신호를 보내고 소프트웨어의 교정 설정을 구성합니다.
- 노브를 트랜스듀서로 돌리고 밸런스 노브를 베이스라인 0으로 조정합니다.
- 수술 중 체온 유지를 위해 표준 입체 현미경과 온도 조절 작은 동물 수술 테이블을 설정합니다.
- 수술 부위에 충분한 빛을 제공하기 위해 미세 수술을위한 빛 조명 시스템을 설정하십시오.
2. 오픈 가슴 수술 및 혈역학 측정
- 복강 내 (즉) 주사를 통해 2,2,2-트리브로모에탄올 250 mg/kg으로 마우스를 마취시다. 필요한 경우, 절차 중 원래 복용량의 1/3 에서 1/2에 보충 복용량을 반복.
- 면도기와 제모 로션을 사용하여 가슴과 목 털을 제거합니다(그림 1A, 2A).
- 수술 중 체온(37°C)을 유지할 수 있도록 온도 조절이 가능한 작은 동물 수술 테이블에 각 마우스를 고정합니다.
- 수술 부위를 70 % 에탄으로 청소하십시오.
- 마취가 시행되면 발가락 핀치를 사용하여 적절한 마취 유도를 확인하십시오.
- 목 피부에 중간 선을 절개합니다(그림 1A).
- 곡면 집게를 사용하여 골격 근육을 해부하고 기관을 노출(그림 1B, 1C).
- 수정된 22 G 정맥 외피 카테터를 사용하여 입을 통해 삽관을 수행합니다. 튜브가 집게를 사용하여 기관에 있는지 확인합니다(그림1D).
- 튜브를 작은 동물 인공 호흡기에 연결합니다. 계산 및 인공호흡기 사용자 매뉴얼10에따라 체중에 따라 호흡 속도 및 조수 부피를 설정합니다. 예를 들어, 설명된 계산에 따라 30g 마우스에 대해 호흡 속도를 133/min 및 조석 부피를 180 μL로 설정합니다.
- 테이프를 사용하여 환기를 위해 튜브를 고정합니다.
- 발가락 핀치를 사용하여 적절한 마취 유도를 확인하십시오.
- 가슴 피부에 중간 선 절개를하고 소작 도구를 사용하여 가슴 근육을 조심스럽게 해부하십시오(그림 2B, 2C).
- 중간을 가로 질러 가위를 사용하여 흉골을 잘라 흉강을 노출(그림 2D).
- 오픈 가슴 수술 절차 동안 소작 도구를 사용하여 출혈을 방지 할 수 있습니다.
- 오른쪽 심실을 리트랙터로 노출합니다(그림2E).
- 식염수에 젖은 압력 트랜스듀서 카테터를 25G 바늘로 만든 작은 터널을 통해 오른쪽 심실로 삽입하여 RVP를 측정합니다(그림2F 및 그림 3A, 3C).
- 카테터 케이블을 잡고 폐 동맥과 동축 방식으로 폐 밸브를 교차합니다. 압력 파형을 관찰하고 안정적인 PAP 신호를 구한다(그림3B, 3D).
- 데이터 수집 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 혈역학 데이터를 기록합니다.
- 최종 측정 후, 2,2,2-트리브로모에탄올 용액의 초과 용량의 i.p. 주입을 통해 마우스를 인간적으로 안락사시한다.
- 오른쪽 심장 시스템에서 카테터를 조심스럽게 제거하고 1% 소화 효소 용액을 함유한 1 mL 주사기에 넣습니다.
- 증류수를 사용하여 카테터를 조심스럽게 세척하고 원래 상자에 보관하십시오.
3. 혈역학에 대한 데이터 분석
참고: 혈역학 데이터는 분석 소프트웨어11(재료 표)을사용하여 기록 및 분석하였다.
- 각 마우스에 대해 노이즈 없이 최소 10회 연속적이고 안정적인 하트비트 주기를 선택하여 각 매개 변수에 대한 RVP 또는 PAP 데이터의 평균 데이터를 가져옵니다.
- 학생의 t-test를사용하여 일반 공기 조절 및 저산소증 그룹을 비교합니다. 참고: p< 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
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Representative Results
압력 트랜스듀서 카테터를 25 G 바늘로 팽창된 터널을 통해 우심실(도3A)에삽입하고, 전형적인 RVP 파형(도3C)을수득하였다. 카테터를 지속적으로 조정하고 천천히 진행시키고 폐 판막을 통과하면서 폐 동맥과 동일한 축으로 유지하였다(그림3B). 압력 센서가 폐 동맥에 성공적으로 삽입되었을 때, 특유의 이각 노치를 가진 전형적인 PAP 파형이나타났다(도 3D). 인공 데이터의 생성을 피하기 위해, 우리는 파형이 노이즈를 가지고 있는지 여부를 관찰(그림 4)또는 카테터의 제로 레벨이 표류했는지 여부(그림 5). 이 경우 수정이 이루어졌고 노이즈가 있는 이러한 세그먼트는 데이터 분석에서 제외되었습니다.
PAH는 작은 폐 동맥에 있는 증가한 저항에 기인한 PAP와 RVP에 있는 지속적인 고도에 의해 특징입니다. PAH는 휴식 시 ≥25 mmHg의 평균 PAP에 의해 정의되며, 클리닉12에서오른쪽 심장 카테터 화 동안 측정됩니다. 우리는 유도 된 만성 저산소증 (4 주 동안 10 % 산소로 유지) 또는 대조군 (정상 공기에 보관)으로 마우스에서 RVP 와 PAP를 측정했습니다. 결과는 그림 6에표시됩니다. 정상 공기 대조군에 비해, 수축기 PAP(그림 6A),확장기 PAP(그림 6B),평균 PAP(그림 6C),및 우심실 수축기 압력(그림 6D) 만성 저산소증 그룹에서 모두 크게 증가했습니다. 조사자들은 또한 저산소증 단독과 비교하여, 생쥐에서 심한 PAH를 유도하기 위해 3주 동안 만성 저산소증과 VEGFR 억제제의 조합이 RVP13,18을현저히 증가시킬 수 있다고 보고하였다.
그림 1: 마우스의 기계적 환기 지지대 삽관(A) 목 털은 제모 로션을 사용하여 제거되어 수술을 위한 깨끗한 부위를 얻습니다. 목의 피부에 중간 선 절개가 이루어집니다. (B)기관을 덮는 골격근이 노출됩니다. (C)골격 근육은 기관을 노출하기 위해 무뚝뚝하게 해부됩니다. 노란색 화살표는 기관을 나타냅니다. (D)튜브 (22 G 정맥 카테터를 사용하여 변형)가 기도에 삽입되고 배압을 사용하여 배치가 확인됩니다. 노란색 화살표는 기관 내부의 튜브를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 오른쪽 심실 시스템에서 혈역학 측정을 위한 오픈 흉부 수술. (A)흉부 털은 제모 로션을 사용하여 제거되어 수술을 위한 깨끗한 부위를 얻습니다. (B)흉골 근육과 흉골을 노출시키기 위해 중간 선 절개가 이루어집니다. (C)소작 도구는 가슴 개폐 시 출혈을 최소화하기 위해 사용됩니다 (화살표는 소작 팁을 나타냅니다). (D)흉골은 중간선(노란색 대시 선)을 따라 절단됩니다. (E)두 개의 리트랙터가 심장을 노출하는 데 사용됩니다(위쪽 화살표는 오른쪽 심방 벽을 나타내고, 아래쪽 화살표는 오른쪽 심실 자유 벽을 나타냅니다). (F)압력 트랜스듀서 카테터(lower arrow)가 오른쪽 심실 자유 벽에 작은 터널을 생성하기 위해 펑크 도구(25 G 크기 바늘, 위화살)를 사용하여 우심실 챔버에 삽입된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 대표 RVP 및 PAP 곡선. 압력 트랜스듀서 카테터는 RVP파형(C)을얻기 위해 우심실 챔버(A)에 삽입된다. 압력 트랜스듀서 카테터는 폐 판막을 통과한 다음 폐동맥(B)에머무르며 PAP 파형을 생성한다. 화살표는 폐 밸브 폐쇄의 징후인 PAP파형(D)의특징적인 이각 노치를 나타냅니다. RA = 우심실, RV = 우심실, PA = 폐 동맥, LV = 좌심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 압력 센서 표면을 심실 벽에 닿음으로써 발생하는 RVP 파형 노이즈. 화살표 점은 RVP 곡선(위쪽 채널)의 압력이 급격히 증가하여 dP/dt(하부 채널)에서 인위적인 변화를 동시에 생성합니다. dP/dt는 RVP에서 계산됩니다. 파선은 dP/dt 노이즈를 나타냅니다. 소음이 지속적으로 발생하면 심실의 카테터 센서 위치를 조정하면 소음을 방지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: RVP 측정 중 압력 트랜스듀서의 드리프트 가 전혀 없습니다. 왼쪽 창은 인위적으로 약간 상승된 끝 확장기 RVP를 보여줍니다. 오른쪽 확장 창은 증가된 끝 확장기 RVP를 보여줍니다(화살표는 끝 확장기 RVP를 나타냅니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: C57BL 마우스에서 저산소증 유발 폐 동맥 고혈압. (A)수축기 PAP (sPAP). (B)확장기 PAP (dPAP). (C)평균 PAP (mPAP). (D)오른쪽 심실 수축기 압력 (RVSP). (e)및(F),대조군 및 PAH 마우스에 대한 대표적인 PAP 파형 * p< 0.05; 학생의 t-test; 대조군 n = 10; 저산소증 그룹 n = 3. 데이터는 평균 ± SD. PAP = 폐 동맥 압력, RVP = 우심실 압력으로 제시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기관 삽관은 열린 가슴 수술을위한 첫 번째 중요한 단계입니다. 쥐 또는 마우스와 같은 작은 동물을 위한 기관 삽관의 고전적인 방법은, 기관에 T 모양 절개를 만들고 기관에 Y형 기관 튜브를 직접 삽입하는 관련시킵니다. 실제로 이 방법은 작업 중에 쉽지 않다는 것을 알게 됩니다. Y형 기관 튜브는 작은 동물에게는 너무 크고 기관과 각도를 형성합니다. 따라서 튜브를 제자리에 고정하기가 어렵습니다. 또한, 일단 삽관 튜브 실수로 오픈 가슴 수술 중 기도에서 나온다, 그것은 일반적으로 기계적 환기 지원의 손실 때문에 동물 죽음결과. 따라서 피부에 절개를 하고, 근육층을 분리하여기관(도 1C)을노출시키고, 기관 튜브를 기도내로 직접 삽입하여피부(14)를 삽입하는 방법을 수정했습니다. 동물의 입. 기관 내의 튜브의 배치는 집게를 사용하여 기관을 클램핑하여 편리하게 확인할 수 있습니다(도 1D). 가이드 바늘을 제거하고 시스 카테터를 사용한 후, 22 G 정맥 카테터를 삽관 튜브로 사용한다. 삽관 후 튜브를 쉽게 고정할 수 있습니다. 이것은 수술 중 삽관을 관리하는 안전한 방법이며 작은 동물 오픈 가슴 수술의 성공률을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그러나 이 방법을 사용하려면 교육과 연습이 필요합니다.
오른쪽 심장 혈역학 측정을 위한 폐쇄가슴 접근법은상세 15,16에기재되어 있다. 폐쇄 흉부 방법의 한 가지 제한은 카테터가 마우스의 폐 동맥에 접근 할 수 없기 때문에 RVP만 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 우리는 오른쪽 심실 무료 벽이 있는 중간 선 가슴 절개를 사용, 흉골 바로 아래(그림 2D). 오른쪽 심실 카테터 삽입 후 RVP를 얻으려면, PAP를 얻기 위해 폐 동맥과 동축 방식으로 카테터를 삽입하는 것이 용이하다(도 2E). 흉부 수술 중 흉골이 절단되면, 전기 응고 도구는 혈액 손실에 의한 인공 혈압 감소를 방지하기 위해 흉골 절단 섹션 출혈을 방지하기 위해 사용된다(그림 2C). 이 오픈 가슴 수술은 P-V 루프 카테터를 사용하여 RVP 및 부피 정보17을모두 얻는 것은 선택 사항입니다. 그러나 더 큰 크기 때문에 PAP를 얻기 위해 사용하지 않는 것이 가장 좋습니다. 이 방법은 잘 훈련 된 외과 의사에 의해 가장 잘 수행되지만, 동물 의 죽음을 피하기 위해 개방 흉부 수술 중 기관 삽관및 출혈의 예방을 유지 할 수 있기 때문에 폐쇄 흉부 접근 방식에 바람직하다.
또한, 오른쪽 심실 무료 벽은 심실로 카테터를 삽입하는 동안 저항을 줄이기 위해 25G 또는 더 작은 바늘로 구멍을 뚫습니다. 카테터화 중에 압력 센서 표면이 날카로운 금속 표면에 의한 카테터 센서의 우발적 손상을 방지하기 위해 바늘의 경사에서 벗어나서는 안됩니다. 심실 자유 벽에 구멍을 뚫기 위해 큰 바늘을 사용하지 않는 것이 바람직하며, 일반적으로 출혈을 더 일으키고 혈액 량이 부족하여 인공 압력 데이터를 유발하기도 합니다.
마우스의 심실의 부피와 마우스의 우심실 챔버의 불규칙한 크기 때문에 카테터의 압력 센서는 높은 심장 박동 속도 동안 우심실 자유 벽에 쉽게 닿습니다. 이는 심실 압력곡선(그림 4)에서잡음이 발생하여 심실 압력 분석에 직접적인 영향을 미칩니다. 이 경우 카테터의 각도와 깊이는 소음이 사라질 때까지 조정하여 다시 매끄러운 심실 압력 파형을 얻습니다.
1 Fr 압력 트랜스듀서7의 작은 크기는 매우 정확하고 정확한 압력 트랜스듀서입니다. 제로 드리프트는 일반적으로 카테터가 결함이 있거나 손상되지 않는 한 시험관 내 식염수용액의 표준 카테터 테스트 중에 경험되지 않습니다. 그러나, 체내 혈액의 존재, 압력 센서 표면에 고수하는 혈액 성분은 생체 내 실험 동안 카테터가 제로 드리프트를 겪게 할 수있다(도 5). 이 문제를 해결하기 위해 우리는 다음을 수행합니다 : 일시적으로 심실 챔버에서 카테터를 제거하고 카테터의 센서 팁을 따뜻한 1.0 % 소화 효소 용액에 넣습니다. 센서 표면에 부착 된 혈액 구성 요소를 소화하기 위해 배양; 그리고 식염수에 담근 거즈로 카테터를 부드럽게 닦은 후 카테터를 다시 심실 챔버에 삽입하여 안정적이고 제로가 아닌 드리프트 심실 압력 파형을 얻습니다.
압력 트랜스듀서 카테터의 준비는 안정적인 데이터를 얻기 위해 필수적입니다. 카테터의 압력 센서 팁은 카테터의 안정성을 유지하기 위해 생체 내 시술 전에 실온에서 0.9 % 식염수로 적어도 30 분 동안 담가져야합니다. 이러한 방식으로, 압력 트랜스듀서 카테터의 전기적 특성은 최적으로 안정화될 수 있다.
마지막으로, 저산소증기간은 마우스6,14,17,18에서저산소증 유발 고혈압 모델에 대해 3~4주에서 실행 가능하다. 우리의 데이터는 저산소증의 4 주가 C57BL 마우스에 있는 안정한 폐 고혈압 모형을 유도할 수 있고, PAP와 RVP 수준은 문헌과 비교된다는 것을 보여주었습니다. 추가 연구는 마우스가 다른 저산소증 프로토콜을 위한 normoxic 조건에 다시 두는 경우에 PAH 모형이 유지될 수 있는 얼마를 다루기 위하여 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 북경 연합 의과 대학의 대학원 교육 및 교육 개혁 프로젝트 (10023-2016-002-03), 후와이 병원 청소년 기금 (2018-F09), 그리고 전 임상 연구의 베이징 주요 연구소의 이사 기금에 의해 지원됩니다 심혈관 임플란트 재료에 대한 평가 (2018-PT2-ZR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
References
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