Summary
Aquí, presentamos un protocolo para realizar una evaluación hemodinámica invasiva del ventrículo derecho y la arteria pulmonar en ratones utilizando un enfoque de cirugía de pecho abierto.
Abstract
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un trastorno cardiopulmonar crónico y grave. Los ratones son un modelo animal popular utilizado para imitar esta enfermedad. Sin embargo, la evaluación de la presión ventricular derecha (RVP) y la presión arterial pulmonar (PAP) sigue siendo técnicamente difícil en ratones. RVP y PAP son más difíciles de medir que la presión ventricular izquierda debido a las diferencias anatómicas entre los sistemas del corazón izquierdo y derecho. En este artículo, describimos un método de medición hemodinámica estable del corazón derecho y su validación utilizando ratones sanos y PAH. Este método se basa en la cirugía de pecho abierto y el soporte de ventilación mecánica. Es un procedimiento complicado en comparación con los procedimientos de tórax cerrados. Mientras que se requiere un cirujano bien entrenado para esta cirugía, la ventaja de este procedimiento es que puede generar parámetros RVP y PAP al mismo tiempo, por lo que es un procedimiento preferible para la evaluación de los modelos de HAP.
Introduction
La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un trastorno cardiopulmonar crónico y grave con elevación de la presión arterial pulmonar (PAP) y la presión ventricular derecha (RVP) que es causada por la proliferación celular y la fibrosis de las pequeñas arterias pulmonares 1. Los catéteres de la arteria pulmonar, también llamados catéteres Swan-Ganz2,se utilizan comúnmente en el monitoreo clínico de RVP y PAP. Además, se ha utilizado clínicamente un sistema de monitorización PAP inalámbrico3,4,5. Para imitar la enfermedad para su estudio en ratones, se utiliza un entorno hipóxico para simular manifestaciones clínicas humanas de HAP6. En la evaluación de PAP en animales, los animales grandes son relativamente fáciles de monitorear a través de catéteres de arteria pulmonar utilizando la misma técnica que para sujetos humanos, pero los animales pequeños como ratas y ratones son difíciles de evaluar debido a su pequeño tamaño corporal. La medición hemodinámica del sistema ventricular derecho en ratones es posible con un catéter de tamaño ultrapequeño 1 Fr7. En la literatura8,9, se ha informado de un método para medir RVP y PAP en ratones, pero la metodología carece de una descripción detallada. RVP y PAP son más difíciles de medir que la presión ventricular izquierda debido a las diferencias anatómicas entre los sistemas del corazón izquierdo y derecho.
Para obtener parámetros PAP y RVP en el mismo ratón, describimos un enfoque basado en cirugía de pecho abierto para mediciones hemodinámicas del corazón derecho, su validación con ratones sanos y PAH, y cómo evitar la generación de datos artificiales durante el complicado pecho abierto Cirugía. Aunque esta técnica es mejor realizada por un cirujano bien entrenado, tiene la ventaja de poder evaluar PAP y RVP en el mismo ratón.
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Protocol
El protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Fuwai, Academia China de Ciencias Médicas, Peking Union Medical College (NO.0000287). Los animales experimentales fueron alojados y alimentados de acuerdo con las directrices de bienestar animal en China.
NOTA: Los ratones C57BL machos de ocho a 12 semanas de edad se alojaban en un entorno con un ciclo de luz oscuro de 12 h/ 12 h. Los ratones de la HAP fueron alojados durante 4 semanas bajo una concentración de oxígeno del 10%, mantenida según una cámara de hipoxia controlada por oxígeno para inducir hipertensión pulmonar, y los ratones de control fueron alojados en el aire de la habitación (21% de oxígeno) en condiciones idénticas. Las mediciones de RVP y PAP se realizaron al final de las 4 semanas de desafío de hipoxia.
1. Preparación preoperatoria
- Remoje el catéter del transductor de presión (tamaño: 1 Fr) en una salina del 0,9% a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes del experimento hemodinámico.
- Filtrar la solución de 2,2,2-tribromoetanol con filtro de 0,22 m y almacenar en un refrigerador de 4 grados.
- Prepare herramientas y suministros de cirugía limpia, como guantes para la cirugía.
- Preparar 10 ml de solución enzimática digestiva al 1,0% para la limpieza del catéter.
- Conecte el catéter del transductor de presión a un sistema de volumen de presión.
- Calibre el transductor de presión antes de obtener mediciones de presión para cada ratón.
- Gire la perilla de calibración a 0 mmHg y 25 mmHg para enviar una señal de presión de verificación al software de adquisición de datos y configurar el ajuste de calibración en el software.
- Gire la perilla al transductor y ajuste la perilla de equilibrio a la línea base cero.
- Configure un estereomicroscopio estándar y una mesa quirúrgica animal pequeña y controlada por temperatura para el mantenimiento de la temperatura corporal durante la cirugía.
- Configure un sistema de iluminación ligera para la microcirugía para proporcionar suficiente luz sobre el área quirúrgica.
2. Cirugía de pecho abierto y medición hemodinámica
- Anestetizar ratones con 250 mg/kg de 2,2,2-Tribromoetanol mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Si es necesario, repita las dosis suplementarias a 1/3 a 1/2 de la dosis original durante el procedimiento.
- Retire el pecho y el cuello con una afeitadora y loción para depilar(Figura 1A, 2A).
- Asegure cada ratón en la posición supina en una mesa quirúrgica de animales pequeños con control de temperatura para ayudar a mantener la temperatura corporal (37 oC) durante la cirugía.
- Limpie el sitio quirúrgico con 70% de ethanal.
- Una vez que la anestesia esté en vigor, confirme la inducción adecuada de la anestesia utilizando un pellizco en el dedo del dedo del mundo.
- Haga una incisión de línea media en la piel del cuello(Figura 1A).
- Diseccionar el músculo esquelético usando fórceps curvos y exponer la tráquea(Figura 1B, 1C).
- Realice la intubación a través de la boca utilizando un catéter de vaina intravenosa de 22 G modificado. Confirme que el tubo está en la tráquea utilizando fórceps (Figura 1D).
- Conecte el tubo a un pequeño respirador de animales. Calcular y ajustar la velocidad de respiración y el volumen de marea en función del peso corporal de acuerdo con el manual de usuario del ventilador10. Por ejemplo, establezca la velocidad de respiración en 133/min y el volumen de marea en 180 s para un ratón de 30 g basado en el cálculo descrito.
- Fije el tubo para la ventilación con cinta adhesiva.
- Confirme la inducción adecuada de la anestesia con un pellizco en el dedo del dedo del dedo del tiempo.
- Haga una incisión de línea media en la piel del pecho y diseccione cuidadosamente los músculos del pecho usando una herramienta de cauterización(Figura 2B, 2C).
- Cortar el esternón usando tijeras a través del medio y exponer la cavidad torácica (Figura 2D).
- Prevenir cualquier sangrado usando la herramienta de cauterio durante el procedimiento de cirugía de pecho abierto.
- Exponer el ventrículo derecho con retractores(Figura 2E).
- Inserte el catéter de transductor de presión empapado en salina a través de un pequeño túnel creado con una aguja de 25 G en el ventrículo derecho para medir rVP(Figura 2F y Figura 3A, 3C).
- Sostenga el cable del catéter y cruce la válvula pulmonar de manera coaxial con la arteria pulmonar. Observe la forma de onda de presión y obtenga una señal PAP estable(Figura 3B, 3D).
- Registre datos hemodinámicos utilizando el sistema de adquisición de datos y el software.
- Después de las mediciones finales, eutanasia a los ratones humanamente a través de la inyección de i.p. de una dosis excesiva de 2,2,2-Tribromoetanol solución.
- Retire cuidadosamente el catéter del sistema cardíaco derecho y colóquelo en una jeringa de 1 ml que contenga un 1% de solución enzimática digestiva.
- Utilice agua destilada para lavar continuamente el catéter con cuidado y guardarlo en la caja original.
3. Análisis de datos para hemodinámica
NOTA: Los datos hemodinámicos se registraron y analizaron utilizando el software de análisis11 (Tabla de materiales).
- Para cada ratón, seleccione al menos 10 ciclos de latidos continuos y estables sin ruido para obtener los datos promedio de datos RVP o PAP para cada parámetro.
- Utilice la prueba t-testde Student para comparar los grupos normales de control del aire e hipoxia. NOTA: p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos se presentan como la media de SD.
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Representative Results
El catéter del transductor de presión se insertó en el ventrículo derecho(Figura 3A)a través de un túnel expandido por una aguja de 25 G, y se obtuvo una forma de onda RVP típica(Figura 3C). El catéter se ajustó continuamente y avanzó lentamente y se mantuvo en el mismo eje que la arteria pulmonar mientras pasaba a través de la válvula pulmonar(Figura 3B). Cuando el sensor de presión se insertó con éxito en la arteria pulmonar, apareció una forma de onda PAP típica con una muesca dicrótica característica(Figura 3D). Para evitar la generación de datos artificiales, observamos si la forma de onda tenía ruido(Figura 4) o si el nivel cero del catéter se había desviado(Figura 5). Si esto ocurriera, se realizaron correcciones y estos segmentos con ruido se excluyeron del análisis de datos.
La HAP se caracteriza por una elevación sostenida en PAP y RVP, causada por una mayor resistencia en pequeñas arterias pulmonares. La HAP se define por un PAP medio de 25 mmHg en reposo, medido durante el cateterismo cardíaco derecho en la clínica12. Medimos el RVP y el PAP en ratones con la hipoxia crónica inducida (mantenida al 10% de oxígeno durante 4 semanas) o un grupo de control (mantenido en el aire normal). Los resultados se muestran en la Figura 6. En comparación con los del grupo de control de aire normal, PAP sistólico(Figura 6A), PAP diastólico(Figura 6B), PAP medio(Figura 6C)y presión sistólica ventricular derecha(Figura 6D) aumentaron significativamente en el grupo de hipoxia crónica. Los investigadores también han informado de que en comparación con la hipoxia sola, una combinación de un inhibidor de VEGFR con hipoxia crónica durante 3 semanas para inducir la HAP grave en ratones puede resultar en un aumento significativo de RVP13,18.
Figura 1: Intubación para soporte de ventilación mecánica en ratones. (A) El pelaje del cuello se retira utilizando loción de depilación para obtener un área limpia para la cirugía. Se realiza una incisión de línea media en la piel del cuello. (B) El músculo esquelético que cubre la tráquea está expuesto. (C) Los músculos esqueléticos se diseccionan sin rodeos para exponer la tráquea. La flecha amarilla indica la tráquea. (D) El tubo (modificado con un catéter intravenoso de 22 G) se inserta en las vías respiratorias, con la colocación confirmada mediante fórceps. La flecha amarilla indica el tubo dentro de la tráquea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cirugía de pecho abierto para lamedición hemodinámica en el sistema ventricular derecho. (A) El pelaje torácico se extrae utilizando loción de depilación para obtener un área limpia para la cirugía. (B) Se realiza una incisión de línea media para exponer los músculos esqueléticos del pecho y el esternón. (C) Se utiliza una herramienta de cauterio para minimizar el sangrado durante la apertura del pecho (la flecha indica la punta de la cauterización). (D) El esternón se corta a lo largo de la línea media (la línea de tablero amarilla). (E) Se utilizan dos retractores para exponer el corazón (la flecha superior indica la pared auricular derecha, y la flecha inferior indica la pared libre ventricular derecha). (F) Se inserta un catéter de transductor de presión (la flecha inferior) en la cámara ventricular derecha utilizando una herramienta de punción (aguja de tamaño 25 G, la flecha superior) para producir un pequeño túnel en la pared libre del ventventderecho derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curvas RVP y PAP representativas. El catéter del transductor de presión se inserta en la cámara ventricular derecha (A) para obtener la forma de onda RVP (C). El catéter del transductor de presión pasa a través de la válvula pulmonar y luego permanece en la arteria pulmonar(B)para generar la forma de onda PAP. Las flechas indican la muesca dicrótica característica en la forma de onda PAP (D), que es un signo de un cierre de la válvula pulmonar. RA - Aurícula derecha, RV - ventrículo derecho, PA - arteria pulmonar, LV - ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ruido de forma deonda RVP causado por tocar la superficie del sensor de presión a la pared ventricular. El punto de flecha muestra un fuerte aumento de la presión en la curva RVP (el canal superior), que produce simultáneamente un cambio artificial en dP/dt (el canal inferior). dP/dt se calcula a partir de RVP. Las líneas discontinuas indican ruido dP/dt. Si el ruido está constantemente presente, el ajuste de la posición del sensor del catéter en el ventrículo puede prevenir el ruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Deriva cero del transductor de presión durante lamedición RVP. La ventana izquierda muestra un RVP diastólico final ligeramente elevado. La ventana expandida derecha muestra el aumento del RVP diastólico final (las flechas indican el RVP diastólico final). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Hipertensión arterial pulmonar inducida por hipoxia en ratones C57BL. (A) PAP sistólico (sPAP). (B) PAP diastólico (dPAP). (C) Media PAP (mPAP). (D) Presión sistólica ventricular derecha (RVSP). (E) y (F), formas de onda PAP representativas para ratones de control y PAH respectivamente *p < 0,05; Prueba t-testdel estudiante; grupo de control n a 10; grupo de hipoxia n.o 3. Los datos se presentan como la media de la SD. PAP , la presión arterial pulmonar, la presión ventricular derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La intubación traqueal es el primer paso importante para las cirugías de pecho abierto. El método clásico de intubación traqueal para animales pequeños, como ratas o ratones, consiste en hacer una incisión en forma de T en la tráquea e insertar directamente tubos traqueales de tipo Y en la tráquea. En la práctica, encontramos que este método no es fácil durante el funcionamiento. El tubo traqueal tipo Y es demasiado grande para animales pequeños y forma un ángulo con la tráquea. Por lo tanto, es difícil fijar el tubo en su lugar. Además, una vez que el tubo de intubación sale accidentalmente de las vías respiratorias durante la cirugía de pecho abierto, por lo general resulta en la muerte de los animales debido a la pérdida de soporte de ventilación mecánica. Por lo tanto, modificamos el método de intubación endotraqueal14 haciendo una incisión en la piel, separando la capa muscular para exponer la tráquea(Figura 1C),e insertando directamente el tubo traqueal en las vías respiratorias a través de la boca de un animal. La colocación de tubos en la tráquea se puede confirmar convenientemente sujetando la tráquea utilizando fórceps(Figura 1D). Después de extraer la aguja guía y sólo con el catéter de vaina, se utiliza un catéter intravenoso de 22 G como tubo de intubación. El tubo se puede fijar fácilmente después de la intubación. Esta es una manera segura de controlar la intubación durante la cirugía y puede mejorar significativamente la tasa de éxito de la cirugía de pecho abierto de animales pequeños. Sin embargo, este método requiere entrenamiento y práctica.
El enfoque de pecho cerrado para la medición hemodinámica del corazón derecho se ha descrito en detalle15,16. Una limitación del método de pecho cerrado es que sólo se puede utilizar para evaluar RVP, porque el catéter no puede acceder a la arteria pulmonar en ratones. Utilizamos una incisión torácica de línea media donde se encuentra la pared libre ventricular derecha, justo debajo del esternón(Figura 2D). Después del cateterismo ventricular derecho para obtener RVP, es fácil insertar el catéter de manera coaxial con la arteria pulmonar para obtener PAP(Figura 2E). Cuando el esternón se corta durante la cirugía de pecho abierto, se utiliza una herramienta de electrocoagulación para evitar el sangrado de la sección de corte esternal para evitar la disminución artificial de la presión arterial causada por la pérdida de sangre(Figura 2C). Es opcional para esta cirugía de pecho abierto utilizar un catéter de bucle P-V para obtener RVP e información de volumen17. Sin embargo, es mejor no usarlo para obtener PAP debido a su mayor tamaño. Aunque este método es mejor realizado por un cirujano bien entrenado, es preferible al enfoque de pecho cerrado porque permite el mantenimiento de la intubación traqueal y la prevención del sangrado durante la cirugía de pecho abierto para evitar la muerte de animales.
Además, la pared libre ventricular derecha se perfora con una aguja de 25 G o más pequeña para reducir la resistencia durante la inserción del catéter en el ventrículo. Durante el cateterismo, la superficie del sensor de presión no debe desviarse del bisel de la aguja para evitar daños accidentales en el sensor del catéter por la superficie metálica afilada. Es preferible no utilizar una aguja grande para perforar la pared libre ventricular, ya que generalmente causa sangrado adicional, y el volumen sanguíneo insuficiente en circulación también causa datos de presión artificial.
Debido al pequeño volumen del ventrículo y al tamaño irregular de la cámara ventricular derecha en ratones, el sensor de presión del catéter toca fácilmente la pared libre ventricular derecha durante la alta frecuencia cardíaca. Esto genera ruido en la curva de presión ventricular(Figura 4),afectando directamente al análisis de presión ventricular. En este caso, el ángulo y la profundidad del catéter deben ajustarse hasta que el ruido desaparezca para obtener una forma de onda de presión ventricular suave de nuevo.
El pequeño tamaño del catéter de transductor de presiónde 1 P 7 lo convierte en un transductor de presión muy preciso y preciso. La deriva cero generalmente no se experimenta durante una prueba de catéter estándar en solución salina in vitro a menos que el catéter esté defectuoso o dañado. Sin embargo, en presencia de sangre corporal, los componentes sanguíneos que se adhieren a la superficie del sensor de presión pueden hacer que el catéter se someta a una deriva cero durante un experimento in vivo(Figura 5). Para abordar este problema, hacemos lo siguiente: retire temporalmente el catéter de la cámara ventricular y coloque la punta del sensor del catéter en una solución de enzima digestiva caliente del 1,0%; incubarlo para digerir los componentes sanguíneos unidos a la superficie del sensor; y después de limpiar suavemente el catéter con gasa empapada en salina, inserte el catéter de vuelta a la cámara ventricular para obtener una forma de onda de presión ventricular estable y no cero.
La preparación de un catéter de transductor de presión también es esencial para obtener datos estables. La punta del sensor de presión del catéter debe empaparse durante al menos 30 minutos en 0,9% de salina a temperatura ambiente antes del procedimiento in vivo para mantener la estabilidad del catéter. De esta manera, las características eléctricas del catéter de presión se pueden estabilizar de manera óptima.
Finalmente, el período de hipoxia es viable de 3 a 4 semanas para el modelo de hipertensión inducida por hipoxia en ratones6,14,17,18. Nuestros datos mostraron que 4 semanas de hipoxia pueden inducir un modelo de hipertensión pulmonar estable en ratones C57BL, y los niveles de PAP y RVP son comparables con la literatura. Se necesitan más estudios para abordar cuánto tiempo se puede mantener el modelo de HAP si los ratones se vuelven a poner en condiciones normoxic para diferentes protocolos de hipoxia.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación está respaldada por el Proyecto de Educación y Reforma Docente de Peking Union Medical College (10023-2016-002-03), el Fuwai Hospital Youth Fund (2018-F09) y el Director Fund of Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluación de Materiales de Implantes Cardiovasculares (2018-PT2-ZR05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-5G | For anesthesia |
| Animal temperature controller | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | For temperature control |
| Dissection forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | For surgery |
| Gemini Cautery System | Gemini | GEM 5917 | For surgery |
| Intravenous catheter (22G) | BD angiocath | 381123 | For intubation |
| LabChart 7.3 | ADInstruments | For data analysis | |
| Light illumination system | Olympus | For surgery | |
| Mikro-Tip catheter | Millar Instruments, Houston, TX | SPR-1000 | For pressure measurement |
| Millar Pressure-Volume Systems | Millar Instruments, Houston, TX | MVPS-300 | For pressure measurement |
| O2 Controller and Hypoxia chamber | Biospherix | ProOx 110 | For chronic hypoxia |
| PowerLab Data Acquisition System | ADInstruments | PowerLab 16/30 | For data recording |
| Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | For surgery |
| Small animal ventilator | Harvard Apparatus | Mini-Vent 845 | For surgery |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | For surgery |
| Surgery tape | 3M | For surgery | |
| Terg-a-zyme enzyme | Sigma-Aldrich | Z273287-1EA | For catheter cleaning |
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