Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En høj-throughput In Situ metode til vurdering af Hepatocyt Nuklearploidy i mus

Published: April 19, 2020 doi: 10.3791/60095
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1,3
1Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM)

Summary

Vi præsenterer en robust, omkostningseffektiv og fleksibel metode til måling af ændringer i hepatocytnummer og nukleart trick i faste/kryoreserverede vævsprøver, der ikke kræver flowcytometri. Vores tilgang giver en kraftfuld prøve-dækkende underskrift af levercytologi ideel til sporing af udviklingen af leverskader og sygdom.

Abstract

Når leveren er skadet, hepatocyt numre falde, mens cellestørrelse, nuklear størrelse og ploidy stigning. Udvidelsen af ikke-parenkymale celler såsom cholangiocytter, myofibroblaster, sformidler og inflammatoriske celler indikerer også kroniske leverskader, vævsremodellering og sygdomsprogression. I denne protokol, Vi beskriver en simpel høj-throughput tilgang til beregning af ændringer i den cellulære sammensætning af leveren, der er forbundet med skade, kronisk sygdom og kræft. Vi viser, hvordan oplysninger udvundet fra to-dimensionelle (2D) væv sektioner kan bruges til at kvantificere og kalibrere hepatocyt nukleare ploidy i en prøve og gøre det muligt for brugeren at finde specifikke ploidy delmængder i leveren in situ. Vores metode kræver adgang til fast / frosset levermateriale, grundlæggende immuncytokemi reagenser og enhver standard højt indhold imaging platform. Det fungerer som et effektivt alternativ til standard flow cytometri teknikker, som kræver afbrydelse af frisk indsamlet væv, tab af rumlig information og potentielle disaggregering bias.

Introduction

Hepatocytter i pattedyrleveren kan gennemgå blokeret cytokinese til fremstilling af binukleare celler og DNA-endoreplication til fremstilling af polyploidkerner, der indeholder op til 16N DNA-indhold. Samlet cellulære og nukleare trick stigning under postnatal udvikling, aldring og som reaktion på forskellige cellulære belastninger1. Polyploidiseringsprocessen er dynamisk og reversibel2, selv om dens præcise biologiske funktion fortsat er uklar3. Øget ploidy er forbundet med nedsat spredningskapacitet4, genetisk mangfoldighed2, tilpasning til kronisk skade5 og kræftbeskyttelse6. Hepatocyte ploidy ændringer opstår som følge af ændret døgnrytme7, og fravænning8. Mest bemærkelsesværdigt, den ploidy profil af leveren er ændret ved skade og sygdom9, og overbevisende beviser tyder på, at specifikke kneb ændringer, såsom øget ≥8N kerner eller tab af 2N hepatocytter, give nyttige underskrifter til sporing af ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) progression3,10, eller den differentierede virkning af virusinfektioner11.

Generelt er leverskader og regenerering forbundet med øget hepatocytcellestørrelse og nukleart område12, sammen med et reduceret samlet antal hepatocytter, især dem med 2N-DNA-indhold10,11. Parenkymal skade i leveren er også ofte ledsaget af udvidelse af ikke-parenkymale celler (NPC'ere), herunder stromale myofibroblaster, inflammatoriske celler og bipotente leverstamceller. Metoder med høj overførselsmængde, der giver en kvantitativ cytologisk profil af parenkymale celletal og nukleart kneb, samtidig med at der er taget højde for ændringer i NPC'er, har derfor et betydeligt potentiale som forskning og kliniske værktøjer til at spore leverens respons under skade og sygdom. Overbevisende seneste in situ analyse af ploidy spektre i humane prøver af hepatocellulært karcinom viser også, at nukleart trick er dramatisk øget inden for tumorer og er specifikt forstærket i mere aggressive tumor undertyper med reduceret differentiering og tab af TP5313. Derfor er der en stærk mulighed for, at metodiske fremskridt i kvantitativ vurdering af nukleart arbejde vil hjælpe med fremtidige prognostiske profilering af leverkræft.

I denne protokol beskrives en fleksibel metode med høj gennemløb til sammenlignende analyse af sektioner af muselevervæv, som giver detaljeret cytometrisk profilering af hepatocytnumre, NPC-respons og en internt kalibreret metode til vurdering af nukleart ploidy (figur 1). Hepatocytter adskiller sig fra NPC'ere ved hepatocyt nuklear faktor 4 alpha (HNF4α) immunmærkning, før karakterisering af nuklear størrelse og nuklear morfometri. "Minimalt DNA-indhold" estimeres for alle cirkulære nukleare masker ved at integrere middelværdien Hoechst 33342 intensitet (en proxy for DNA-tæthed) med interpoleret tredimensionel (3D) nuklear volumen. Hepatocyt minimal DNA-indhold kalibreres derefter ved hjælp af NPC'ere til at generere en nuklear ploidy profil.

Billederhvervelse, nuklear segmentering og billedanalyse udføres ved hjælp af billedbehandling med højt indhold, hvilket gør det muligt at screene store områder med todimensionale (2D) leversektioner, der indeholder titusindvis af celler. En skræddersyet program er fastsat for automatiseret efterbehandling af højt indhold billedanalyse data til at producere en prøve-dækkende ploidy profil for alle cirkulære hepatocyt kerner. Dette udføres ved hjælp af gratis at downloade software til at beregne nukleare kneb baseret på stereologisk billedanalyse (SIA)10,11,14,15. SIA-metoden er tidligere blevet valideret af flowcytometri som en nøjagtig, om end besværlig, metode til vurdering af hepatocyt nukleart trick i leveren14, under forudsætning af cirkulær nuklear morfologi og en monoton sammenhæng mellem nuklear størrelse og DNA-indhold. I denne protokol måles begge nukleare parametre ved vurdering af nuklear morfometri og Hoechst 33342-mærkning. Beregning af "minimalt DNA-indhold" for hver atommaske efterfølges af kalibrering af hepatocytnukleart ploidy ved hjælp af NPC'ere, som har et kendt 2−4N DNA-indhold og derfor tjener som en nyttig intern kontrol.

Sammenlignet med konventionelle flow cytometri metoder16 den beskrevne fremgangsmåde gør det muligt hepatocyt nukleare ploidy, der skal vurderes in situ og kræver ikke adgang til frisk væv eller disaggregation metoder, der kan bias resultater og være vanskeligt at standardisere. Som med alle SIA-baserede tilgange er kerneploidi-underklasserne >2N underrepræsenteret ved 2D-prøvetagning på grund af skæring af større kerner uden for ækvatorialplanet. Den vævsdækkende ploidy-profil beskriver også minimums-DNA-indholdet for alle cirkulære hepatocytnukleare masker og diskriminerer ikke direkte mellem mononukleare hepatocytter og binukleare celler, der har to diskrete ("ikke-rørende") kerner af samme ploidi. Denne protokols enkelhed giver imidlertid mulighed for at tilpasse den til yderligere parametre såsom internuklear afstand eller celleperimeteranalyse, som vil gøre det lettere at identificere tonukleare celler, hvilket giver en mere detaljeret vurdering af celleploidi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev tidligere godkendt af CIPF's etiske komité. Mus blev anbragt i et patogenfrit anlæg på Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, Spanien), registreret som forsøgsdyrsopdrætter, bruger og forsyningscenter (reg. nr. ES 46 250 0001 002) i henhold til gældende europæiske og spanske dyrevelfærdsbestemmelser (53.2013 rd/2013).

1. Vævshøst og forberedelse af prøver

BEMÆRK: Denne protokol beskriver, hvordan man fryser væv uden forudgående fiksering eller kryopræservering. For tidligere faste/kryopræparerede prøver fortsættes til punkt 2 og udelades trin 3.1. Alle analyser er udført med voksne kvindelige C57BL/6 mus i alderen 12-16 uger.

  1. Ofre dyr ved fentanyl/pentobarbital intraperitoneal injektion efterfulgt af cervikal dislokation. Med musen vender ventrale side op, åbne bughulen og udsætte leveren ved at gribe huden med pincet og udføre en lodret snit fra bunden af underlivet til bunden af brystbenet ved hjælp af kirurgisk saks.
  2. Fjern forsigtigt galdeblæren med fine pincet, dissekere leveren og skyl den valgte leverlobule i en 10 cm petriskål fyldt med fosfat-bufferet saltvand (PBS).
    BEMÆRK: Det anbefales at sammenligne den samme leverlap for hvert dyr, i dette tilfælde blev medianappen anvendt.
  3. Fyld et mærket kryomold med optimal skæretemperatur (OLT) medium ved stuetemperatur (RT). Undgå OLT bobler. Hvis de vises, skubbe dem til kanten af formen ved hjælp af en nål eller pipette spids.
  4. Integrer leverlobule i en fyldt OCT cryomold og straks placere den på tøris for at sikre hurtig frysning. Opbevar cryomolds ved -80 °C indtil kryosektion.

2. Kryosektion

  1. Transport cryomolds på tøris for at undgå væv nedbrydning. Før kryosektionekvirering sat i kryotom at indstillet til -20 °C i 20 min.
  2. Skub prøven ud ved at trykke på bunden af plastkromolden. Påfør flydende OCT til varm prøve disk på RT, position i kryoat og vedhæfte en OCT indlejret leverprøve. Påfør forsigtigt tryk, og vent 3 min, før OCT fryser, så prøven klæber til disken.
    BEMÆRK: Undgå at håndtere prøven med fingrene så meget som muligt for at undgå vævsnedbrydning.
  3. Lås prøven fast i kryoøreproppens arm, og juster retningen, så prøvens kant er parallel med kryodebladet. Udskåret i prøven, indtil vævet er nået.
  4. Prøven sammentages med en tykkelse på 6 μm. Anbring et mærket polyamidbelagt objektglas over prøven i 5 s for at lade prøven sidde fast på sliden. Placer slæden på RT i 3−5 min. og fortsæt derefter direkte til afsnit 3 for at opnå de bedste resultater.
    BEMÆRK: Til behandling af flere friskfrosne prøver er der opnået reproducerbare resultater ved midlertidigopbevaring af objektglas i en glideboks på tøris, indtil alle prøver er blevet behandlet. Når du bruger denne fremgangsmåde, kan alle objektglas være ækvilibrerere til RT, før du fortsætter til afsnit 3. Formalin faste paraffin indlejrede (FFPE) prøver kan anvendes, selv om baggrund autofluorescens øges ved denne metode. For at gå fra FFPE prøver, afsnit ved 4 μm. Monteres ved at fange sektioner fra 40 °C vandbad på polyamidbehandlede objektglas. Der opvarmes i 1 time ved 60 °C, derefter deparaffiniseres ved seriel RT-vask (5 min) i Coplin-krukker indeholdende xylen (x2), ethanol 100% (x2), 96% (x2), 70% (x1) og dH2O (x1). For at eksponere antigener placeres objektglassene i citratbufferen i 20 minutter ved 90 °C, før hærdningsobjekterne i PBS ved RT. Fortsæt til trin 3.2.

3. Fluorescens immunmærkning

  1. Fastgør vævssektioner i en røghætte ved at anvende 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 10 min ved RT. Overfør lysglas til en PBS fyldt Coplin krukke og vask i 3 min ved hjælp af forsigtig omrøring (gentag 3x).
    BEMÆRK: Fra nu af og indtil afslutningen af immunfarvningsprocessen skal du undgå tørring af prøven.
  2. Tør området omkring hver vævssektion og omgiv ved hjælp af en hydrofob pen. Permeabilisermed 0,5% nonionisk overfladeaktivt stof (dvs. Triton X-100) i PBS i 15 min. ved RT. Derefter vaskes I PBS fyldt Coplin krukke i 3 min ved hjælp af blid omrøring (gentag 2x).
  3. Blok ved hjælp af en filtreret opløsning af 1% kvæg serum albumin (BSA), 5% hest serum, 0,2% nonionic overfladeaktivt stof i PBS (i mindst 1 time på RT).
  4. Inkuber med primær HNF4α antistof fortyndet i blokerende buffer over natten ved 4 °C i et mørkt fugtigt farvningskammer (se Materialetabel for antistoffer og specifikke fortyndinger).
  5. Placer glider i en PBS fyldt Coplin krukke og vask i 3 min ved hjælp af blid omrøring (gentag 4x).
  6. Inkuber med Alexa-488 konjugeret sekundært antistof og Hoechst fortyndet i filtreret 1% BSA og 0,2% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS i 2 timer ved RT i et mørkt fugtigt farvningskammer (se Materialetabel for antistoffer og specifikke fortyndinger).
  7. Placer glider i en PBS fyldt Coplin krukke og vask i 3 min ved hjælp af blid omrøring (gentag 4x). DdH2O vaskes i 3 minutter ved forsigtig omrøring (gentag 2x).
  8. Monter objektglas ved at placere to dråber fluorescerende monteringsmedier på en dæksel (24 x 60 mm) og lægge objektglas over den, hvilket eliminerer bobler ved at anvende et let tryk. Til langtidsopbevaring skal der forsegles dæksel ved kanter med klar neglelak og opbevares i mørke ved 4 °C.
  9. Før du fortsætter, skal du kontrollere objektglas ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop for at sikre god fiksering og immunmærkning.
    BEMÆRK: Se figur 2A,B for forventede resultater.

4. Fluorescens billede erhvervelse

BEMÆRK: Til dette trin kræves der en billeddannelsesplatform med højt indhold (Materials- og Materialebordet),der understøtter automatisk fluorescensbilledanskaffelse.

  1. Tænd billedbehandlingssystemet, og åbn en ny anskaffelsesprotokol.
  2. Vælg målsætningen 10x, bemærk synsfeltets område (i dette tilfælde 0,6 mm2).
  3. Indstil parametre til erhvervelse af fluorescensbilleder ved hjælp af de relevante excitations- og emissionsfiltre (i henhold til trin 3.6). For Hoechst og Alexa-488 skal du vælge "DAPI" og "GFP"-kanaler med henholdsvis 390/18 og 438/24 nm excitation og 432.5/48 og 475/24 nm emission.
  4. Fokusprøven og sørg for, at signalintensiteten ikke mættes. Sørg for, at billedoptagelse sker med samme eksponeringstid for alle billederne, eller brug et system, hvor fluorescensintensiteten korrigeres for eksponeringstiden.
  5. Scan prøven og anskaf tilstrækkelige billeder til at opnå fuldstændig dækning af vævssektionen (ca. 20-50 synsfelter, afhængigt af prøvestørrelsen).
  6. Gennemgå billeddatabasen, manuelt fjerne (i) dårligt fokuserede felter, (ii) dem ved grænserne for hvert væv sektion (for at undgå biasing celletæthed beregninger), og (iii) dem, der indeholder foldede / fysisk beskadigede områder af væv sektion, hvis de findes.

5. Automatiseret fluorescensbilledanalyse

BEMÆRK: Dette trin kræver passende billedanalysesoftware (Materialetabel),der kan: (1) automatisk identificere Hoechst-mærkede kerner i billeder ved 405 nm (nuklear segmentering), 2) vurdering af middelkræntintensitet og mormormortit, og 3) tærskelværdi for at bestemme +/- status for nuklear fluorescens ved 488 nm (HNF4α). Der kræves en vis grundlæggende operatøruddannelse/ekspertise for visuelt at vurdere og justere segmenterings- og tærskelparametre i programmet for at sikre, at kerner og HNF4α+/- status er optimalt gated (figur 2).

  1. I billedanalysesoftwaren skal du åbne anskaffelsesfilen, der indeholder Hoechst (405 nm) og HNF4α(488 nm) billeder fra trin 4.5, og oprette en ny analyseprotokol.
  2. Definer bølgelængder, der skal anvendes til nuklear segmentering (Hoechst, 405 nm) og til hepatocyt/NPC tærskelanalyse (HNF4α, 488 nm).
  3. Juster softwarens nukleare segmenteringsparametre (f.eks. "minimum nukleart område" og nuklear detektion "følsomhed") for at sikre, at kernerne er optimalt adskilte.
    BEMÆRK: God segmentering af hepatocytter bør prioriteres højere end i NPC'ere. Hepatocytkerner er karakteristisk afrundede (interkvartilstørrelsesområde: 40−64 μm2). NPC kerner, såsom dem af sinusformede endothelia, er fladtrykt / elliptisk eller uregelmæssig i form og generelt mindre og tættere pakket end hepatocytter (interkvartil størrelse interval: 30−43 μm2). For muselever en minimalt nukleart område ≥23 μm2 og detektions "følsomhed" på 65% blev anvendt (se figur 2C,D for forventede resultater). Følsomhed bestemmer, hvordan pixelklynger genkendes som individuelle kerner baseret på deres intensitet og bør empirisk testes for hvert eksempel, der er indstillet af brugeren, før du fortsætter med automatiseret billedanalyse.
  4. Tærskelintensiteten ændres ved 488 nm for at sikre optimal gating af hepatocytter (HNF4α+) og ikke-parenkymale celler (HNF4α-).
    BEMÆRK: Se figur 2C,D for forventede resultater. Værdien af tærskelintensiteten er relativ og vil afhænge af farvningseffektivitet og anskaffelsesindstillinger som f.eks. Det bør derfor standardiseres af brugeren. Brug kendte HNF4α-celler såsom endotelceller og periportalNic som en intern negativ kontrol og tonukleare hepatocytkerner som en positiv reference for farvning. Test analyseparametrene ved hjælp af et lille antal billeder for at sikre god nuklear segmentering og intensitetstærskeladskillelse, før analyseparametre anvendes på hele datasættet.
  5. Vælg følgende nukleare parametre, der skal kvantificeres: 1) nukleart område baseret på Hoechst-farvning (μm2), (2), den gennemsnitlige nukleare Hoechst-intensitet (RU), 3) nuklear forlængelsesfaktor (gennemsnitligt forhold mellem kernens korte akse og kernens lange akse hvor et centersymmetrisk objekt (ikke-aflang] objekt har en værdi på 1, (4) Nuc 1/(formfaktor), dvs. Værdier spænder fra 1 til uendeligt, hvor 1 er en perfekt cirkel, (5) HNF4α status (positiv-1 eller negativ-0), og (6) nukleare x / y koordinater baseret på "tyngdepunkt" (cg), en metode til at lokalisere midten af objektet fra gråtonebilleder med sub-pixel præcision.
  6. Kør analysen for alle eksempeldatasæt, og eksporter numeriske data fra trin 5.5 til regnearkssoftware.

6. Analyse af data

BEMÆRK: Dataanalysetrinnet kan udføres ved hjælp af standardregnearkssoftware.

  1. Beregn hepatocyt- og ikke-hepatocytcellenumre.
    1. Det samlede antal analyserede leversektioner beregnes for hver prøve ved at gange antallet af visningsfelter med synsfeltets område (trin 4.2).
    2. Arbejde med regnearkfiler genereret for hver lever sektion, filtrere data ved at vælge kun HNF4α + kerner. Beregn det samlede antal analyserede HNF4α+-kerner, og divider dette med det samlede analyserede areal for at opnå gennemsnitlig hepatocyttæthed for hver prøve (Figur 2F).
    3. Udfør den samme beregning for ikke-parenkymale celler ved at filtrere regnearket for HNF4α-celler (Figur 2E).
  2. Beregn distribution af hepatocyt-kernestørrelse.
    1. Brug regnearkssoftware til at filtrere data for kun at vælge HNF4α+ kerner.
    2. Plot værdier af nukleare område i et histogram (Figur 2G). Indstil placeringsbredden til 5 μm2.
      BEMÆRK: Frekvensværdier kan korrigeres for areal (kerner/mm2) pr. trin 6.1.1.
  3. Udfør hepatocyt nukleare ploidy analyse.
    BEMÆRK: Regnearksdataene fra trin 5.6 bruges til at generere en nuklear ploidy-profil for hver prøve. Denne proces er blevet automatiseret og kan udføres ved hjælp af en brugerdefineret skriftlig software, der er frit tilgængelig til download med understøttende oplysninger og demonstration datasæt påhttps://github.com/lukeynoon(seSupplerende filer). Kildekoden er til rådighed for brugere, der ønsker at tilpasse metoden. En beskrivelse af algoritmen, sammen med instruktioner til installation og brug er skitseret nedenfor. Programmet bruger regnearksdata til automatisk at adskille hepatocytkerner i to grupper. (1) dem med "simple" cirkulære kerner og (2) "komplekse" ikke-cirkulære kerner repræsentant for binukleare celler med "2c ploidy. Det minimale nukleare DNA-indhold (en funktion af nukleart område og DNA tæthed) er næste beregnet for alle "simple" kerner. Et efterfølgende trin kalibrerer derefter automatisk HNF4α+ hepatocyt nukleart ploidy ved hjælp af HNF4α- kerner som en kendt 2−4N intern kontrol.
    1. Hent og installer software.
      1. Hent det pakkede program fra: https://github.com/lukeynoon
      2. Start MATLAB. Gå til app-fanen for værktøjsturen, klik på Installer app, og åbn det downloadede program, der kaldes"Ploidy_Application.mlappinstall". Der vises en meddelelse, der bekræfter den vellykkede installation.
        BEMÆRK: Ansøgningen er nu klar til brug og vil forblive i APP fanen af toolstrip.
    2. Formatere inputdata.
      BEMÆRK: Før automatiseret analyse af kernearbejde skal alle regnearksfiler, der indeholder billeddata med højt indhold (trin 5.6), lagres og formateres i overensstemmelse med følgende instruktioner.
      1. I hver eksporteret datafil (. XLS 97-2004-projektmappe) fra trin 5.6 omfatter et ark, der kaldes "Cellemål", der indeholder alle de data, der er nødvendige for den ploidy-analyse, der er beskrevet i kolonner (figur 3A). Sørg for, at regnearkslayoutet, herunder kolonneoverskriftsnavne, forbliver uændret i forhold til figur 3A, da analysemetoden finder de korrekte kolonnedata ved at søge efter disse navne (se demonstrationsdatasæt i Supplerende filer som reference). Hvis for eksempel, højt indhold billedanalyse software ikke producerer en "Light flux" kolonne (Figur 3A), manuelt indsætte en "Light flux" kolonne på samme sted, dvs kolonne K og fylde den med nuller.
      2. For hver forsøgstilstand (f.eks. give "Injured-d14" et kontroldatasæt, som vil blive anvendt til at beregne den interne kontrol for 2−4N nuklear ploidy kalibrering (trin 6.3.4.3). Her skal du vælge leverprøver fra ubehandlede voksne littermates ("Control-d0"; Figur 3B-D).
      3. For biologiske replikater (pr. betingelse) skal hvert regneark opbevares i sin egen mappe (som i figur 3B). Navngiv mappepræfikserne trinvist, f.eks. SampleN", som pr filnavne indeholdt i. Derfor skal alle datasætmapper (f.eks. "Control-d0") indeholde en række undermapper ("Sample1", "Sample2" osv.), der hver indeholder en regnearksfil med samme tilsvarende navn.
    3. Kør programmet.
      1. Inden for MATLAB skal du starte "Ploidy_Application" ved at klikke på ikonet under fanen MY APPS på toolstrip (Figur 3C). Den Ploidy_Application grafiske brugergrænseflade (GUI) vises (Figur 3C).
      2. Klik på knappen Kurve for at styre dataknappen for at navigere til den mappe, hvor kontroldataene findes (f.eks. Denne datasti vises derefter i grænsefladen (f.eks. /Users/Desktop/Control-d0).
      3. Skriv derefter i "mappepræfiks" det navn, der skal gives til outputfilerne (f.eks.
        BEMÆRK: Dette præfiks kan ændres til tekst, forudsat at mapperne og filnavne forbliver trinvist navngivet.
      4. Klik på knappen Sti til andre data, og naviger til den mappe, hvor de sammenlignende data replikeres (f.eks. Denne datasti vises derefter i grænsefladen (f.eks. /Users/Desktop/Injured-d14).
      5. Klik på Kør!. Når analysen er fuldført, står der på statuslinjen "Analyse fuldført!..".
        BEMÆRK: Ansøgningen vil for hver prøve rapportere stratificering af "simple" kerner til ≤2n, 2n−4n, 4n−8n og 8n+ målt i absolutte tal og som en procentdel af det samlede antal (figur 3D). Disse filer gemmes automatisk i hver eksempelmappe som: "Count_2n.txt", "Count_2n_to_4n.txt", "Count_4n_to_8n.txt", "Count_8n_and_higher.txt", "Percentage_2n.txt", "Percentage_2nto4n.txt", "Percentage_4nto8n.txt", "Percentage_8n_and_higher.txt". Den Ploidy_Application vil automatisk gemme en liste for hver prøve, af alle de individuelle ploidy skøn for "simple" hepatocyt og ikke-hepatocyt kerner i "Ploidy_All_Hepatocytes.txt" og "Ploidy_NonHepatocytes.txt". For kontroldatasættet gemmer metoden også de minimale DNA-indholdstærskler, der beregnes til stratificering af kneb (se trin 6.3.4.3.7) i en fil med navnet "Normalised_Thresholds_Control". Endelig vil ansøgningen producere en mappe til både kontrol og de valgte sammenlignende tilstand data kaldes "Resumé". Denne mappe indeholder to undermapper, "Ploidy" og "Stratificering", som indeholder gennemsnittet af alle de angivne prøver (figur 3D).
    4. Beskrivelse af metoden.
      BEMÆRK: I det følgende afsnit beskrives i detaljer den metode, der anvendes af Softwaren til Nuclear Ploidy Analysis. Hvis brugeren vælger ikke at bruge programmet, kan disse trin følges ved hjælp af regnearkssoftware til at beregne den nukleare ploidy profil manuelt.
      1. Adskil kerner i "simple" eller "komplekse" i henhold til nuklear morfemis.
        1. Beregn et "cirkularitetsindeks" for alle kerner, defineret som den nukleare "forlængelsesfaktor" divideret med "Nuc 1/(form factor)", hvor en værdi på 1,0 angiver en perfekt cirkel.
          BEMÆRK: "Nuklear forlængelse" og "Nuc 1/(formfaktor)" er to diskrete mål for et objekts "cirkularitet", der vurderer komplementære, ikke-overlappende morfometriske kriterier. Førstnævnte måler et objekts lange og korte akser, mens sidstnævnte sammenligner længden af et objekts omkreds med dets område. For at styrke definitionen af nuklear cirkularitet, der anvendes i denne protokol, er disse to målinger blevet kombineret i et enkelt "cirkularitetsindeks". En tidligere metode til vurdering af nukleart arbejde ved hjælp af den beskrevne metode anvendte kun nuklear forlængelse17. Mens acceptable resultater blev opnået ved hjælp af denne fremgangsmåde, forfatterne har bemærket, at en sammensat "cirkularitet indeks" forbedrer forskelsbehandling af manuelt udvalgte kerner fra mononukleare og binukleare hepatocytter (data ikke vist).
        2. Kerner med et cirkularitetsindeks ≤ 0,8 som "komplekse" og kernerne > 0,8 som "simple".
      2. Anslå "minimalt" DNA-indhold (m) for alle "simple" kerner.
        1. Den nukleare radius (r) beregnes ved hjælp af formlen:
        2. Beregn nukleart volumen (v) ved hjælp af volumenet af en kugleformel:
        3. Generér en relativ værdi for minimalt DNA-indhold (m) ved hjælp af formlen:
      3. Kalibrer datasættet ved hjælp af NPC-kernerne (HNF4α-) som en intern 2−4N-kontrol.
        BEMÆRK: NPC'ere har et 2−4N DNA-indhold afhængigt af cellecyklusstatus. Derfor øges gennemsnitsværdien af NPC's "minimale" DNA-indhold (NPCm)med personskade (figur 4A). Kalibreringsfejlen minimeres ved at fastsætte en øvre grænse på NPCm, der repræsenterer en 4c-tærskel (figur 4B).
        1. I regnearket skal du kun vælge NPC-kerner med værdier for "m", der ligger inden for 1 standardafvigelse (SD) af tilstanden (dette filtrerer støj fra mulig segmenteringsfejl).
        2. Inden for dette filtrerede område undersøges nukleare områder og de tilsvarende gennemsnitlige Hoechst-intensiteter (figur 4C).
        3. Det mindste nukleare område inden for dette filtrerede område anslås med maksimal nuklear Hoechst-intensitet (dvs. det punkt, hvor kurvens linje skifter retning i det filtrerede datasæt som vist af den røde cirkel i figur 4C). Denne værdi repræsenterer en 2N−4N overgangstilstand (t), over hvilken prøveudtagning af 4c kerner dominerer over 2c kerner, hvilket resulterer i en maksima af gennemsnitlig hoechst intensitet.
          BEMÆRK: Denne værdi bestemmes automatisk af softwaren. Regnearksbrugere kan dog manuelt vælge dette punkt som overgangsstørrelse.
        4. Det minimale DNA-indhold, der repræsenteres af denne overgangsstørrelse (tm),beregnes ved følgende trin 6.3.4.2.
        5. Hvis du vil anslå 4N-skulderen af NPC m-datasættet, skal du føje 1 SD til værdien af tm.m Det resulterende antal (figur 4B) beskriver den øvre grænse for NPC's minimale DNA-indhold, der skal anvendes til nuklear ploidy stratificering (S4c).
        6. 16.3.4.3.1−6.3.4.3.5 for alle "kontrolprøver".
          BEMÆRK: I figur 3anvendes f.eks.
        7. Der beregnes en gennemsnitlig 4c-stratificeringstærskel (S4c) for "kontrolprøver", og dette skal ekstrapoleres 2c (S2c) og 8c (S8c)for minimalt DNA-indhold (m). Stratificeringstærskler genereres og lagres automatisk af softwaren (trin 6.3.3.3).
          BEMÆRK: Afhængigt af undersøgelsens udformning kan de gennemsnitlige stratificeringstærskelværdier beregnes for hver betingelse eller for specifikke forhold (f.eks. sund kontrollever). Nuclear Ploidy Analysis-softwaren kræver imidlertid, at en af et sæt af 2 filer er udpeget som "kontrol" med henblik på beregning af relative knebværdier.
        8. Der beregnes en ploidy-værdi for alle kerner ved hjælp af den S2c-værdi, der genereres i trin 6.3.4.3.7 pr.:
        9. Stratificering af "simple" hepatocytkerner (HNF4α+) kerner i 2c/4c/8c/>8c parenteser efter følgende kriterier: "2c" HNF4α+ = p ≤ 2; "4c" HNF4α+ = 2 < p ≤ 4; "8c" HNF4α+ = 4 < p ≤ 8; ">8c" HNF4α+ = 8 < p.
        10. For at rekonstruere den geografiske mønster af ploidy-undergrupper skal de nukleare data i hvert eksempelregneark adskilles i forhold til de tilsvarende felter, hvor de blev anskaffet. Brug derefter tilknyttede nukleare x/y-koordinater (fra trin 5.5) til at plotte ploidy-undergrupper i 2D (figur 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode er blevet anvendt til at måle virkningen af kolestatisk skade på den voksne muselever ved at fodre dyr i 0−21 dage med en hepatoksisk kost indeholdende 0,1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)17. Kronisk DDC fodring resulterer i hepatocellulære skade øget ploidy og periportal udvidelse af NPC'ere. Brugeren skal være opmærksom på, at der kan være musestamme og aldersafhængige forskelle i nukleart arbejde, og at alle analyser er udført med voksne hunner C57BL/6 mus i alderen 12-16 uger.

Efter HNF4α immunmærkning (protokol afsnit 3) er det vigtigt at kontrollere alle objektglas ved hjælp af konventionel fluorescensmikroskopi for at sikre god kvalitet fiksering og farvning (figur 2A). Udtværing eller udviskning af Hoechst kan indikere utilstrækkelig fiksering eller prøveforringelse før fiksering (figur 2B), i hvilket tilfælde der vendes tilbage til protokolpunkt 2, og tiden mellem skæring og fiksering (trin 3.1). En vellykket immunmærkning med HNF4α-antistoffet kan let bedømmes på nuværende tidspunkt ved klar forskelsbehandling af positivt mærkede hepatocytkerner, typisk større og mere afrundede end nPC'ers (figur 2A). Fladtrykt / elliptisk endotelkerner i parenkym, eller tætte pletter af celler, der udvider sig i periportal områder efter DDC skade kan tjene som en nyttig visuel reference til at identificere HNF4α- NPC'ere ved vurderingen af succes / svigt af immunfarvning.

Nuklear adskillelse og HNF4α tærskelparametre (trin 5.2-5.4) skal optimeres omhyggeligt forud for automatisk billedanalyse (trin 5.6), så de i det store og hele afspejler det visuelle mønster af immunfarvning observeret ved konventionel fluorescensmikroskopi ved slutningen af protokolpunkt 3 (Figur 2C). Eksempler på optimal vs. suboptimal nuklear segmentering og HNF4α-tærskelprotokoller er sammenfattet i figur 2D. Efter billedanalyse (trin 6.1.3) bør dataene afspejle et stigende antal NPC'ere i leveren med DDC-skade (figur 2E) fra 52 % ± 2,0 % af kernerne i kontrollever til 72,8 % ± 1,4 % efter 21 dages DDC-behandling. Hepatocytter udgør 48,0% ± 2,0% af det samlede antal kerner i kontrollever, i overensstemmelse med tidligere analyser af leverhistologi, der viser, at hepatocytter optager 70-85% af vævsvolumen, men kun 45−50% af de samlede leverceller18,19. Der observeres en lille, men signifikant reduktion i antallet af HNF4α+ kerner i løbet af de første 14 dage med DDC-fodring (figur 2F). Et frekvensfordelingsområde for det nukleare hepatocytområde (trin 6.2) viser et topareal på HNF4α+ i kontrollever i størrelsesområdet 40−50 μm2 og et klart højreskift i nuklear størrelse efter DDC-skade (figur 2G); overensstemmelse med øget ploidy og hepatocellulære hypertrofi12.

Ved sunde (dag 0) kontrollever har 63,4 % ± 1,7 % af HNF4α+ kerner en "simpel" cirkulær morfom (figur 5A). Dette tal falder til 46,8% ± 5,7% (P = 0,042) efter 21 dages DDC skade, hvilket afspejler øget kompleksitet i nuklearmormormortri formentlig forbundet med skift mellem ploidy stater under polyploidisation (se "Fortolkning af nuklearmorfometri" nedenfor). Repræsentative eksempler på nukleare ploidyfordelinger, der er opnået ved hjælp af denne metode i kontrolleversektioner, er vist i figur 5A, som beskriver, hvordan interpolation af DNA-indhold gør det muligt at stratificering af individuelle celler i en enkelt prøve. Gennemsnitsværdier for delmængder af "komplekse" og "simple" HNF4α+ celler er også vist (figur 5A). Dataene er i overensstemmelse med tidligere estimater af polyploidi hos 80−90% af voksne murinehepatocytter2. Hyppigheden af komplekse kerner (36,6% ± 1,7%) i kontrol lever også tilnærmelsesvis til binukleare celler (35%)20, selv om data bør nøje betragtes som et mål for nukleare snarere end cellulære ploidy (se "Fortolkning af nukleare morfometri" nedenfor). Sammenligning af relative kneb mellem kontrol (dag 0) og DDC-behandlede grupper bør afspejle et betydeligt tab af 2c og 4c hepatocytkerner med skade sammen med et øget antal >8c celler (figur 5B). Relative positionsoplysninger for hver ploidy-undergruppe kan afhøres ved scatter plot af x-y-koordinater, der er knyttet til hver kerne i datasættet, eller ved at hente 2D-placeringen af bestemte hepatocyt-delmængder i billedanalysesoftwaren med højt indhold (figur 5C).

Kalibrering
For at vurdere gyldigheden af den anvendte NPC-kalibreringsmetode blev der udført dobbelt immunmærkning af leversektioner ved hjælp af antistoffer mod HNF4α og proliferativmarkør Ki-67 (figur 6A,B). Disse data viste berigelse for Ki-67, som mærker celler i alle aktive faser af cellecyklussen, på højre side af NPC's minimale DNA-fordelingskurve (mellem S2c og S4c) - hvor NPC'ere forventes at replikere DNA og derfor har >2c ploidy (figur 6A). Efter intern kalibrering af alle undersøgte kontrolprøver og tilskadekomne leverprøver Ki-67, blev væsentligt beriget (P < 0,0001) i "simple" NPC kerner med en anslået ploidy på >2c (82,5% ± 6,6% SD, n = 12) sammenlignet med dem med ≤2c ploidy (17,5% ± 6,6% SD, n = 12) (Figur 6B), hvilket indikerer vellykket ploidy kalibrering. Disse data understøtter gyldigheden af den anvendte metode. Også, under forudsætning af nøjagtige tærskelværdier af Ki67, de giver nogle kvantitative indsigt i, i hvilket omfang subekvatriske nukleare masker fra højere ploidy grupper "forurene" grupper nedenfor.

For yderligere at teste gyldigheden af NPC-kalibreringsmetoden blev der indført en ekstern kalibrator på grundlag af det tidligere rapporterede nukleare volumen af mus 2N hepatocytter (155,8 μm3)14. Når dette tal blev anvendt i kombination med en gennemsnitlig værdi af Hoechst intensitet for HNF4a- kerner den resulterende skøn for gennemsnitlighepatocyt ploidy i kontrol leverenvar umulig at skelne fra den interne (S2c) kalibrator (Figur 6C). Desuden var skøn over gennemsnitlighepatocyt-ploidi hos mus af C57BL/6-musestammen af sammenlignelig alder også ens, hvilket bekræfter, at forudgående empirisk viden om 2N hepatocyt-kernestørrelse ikke er påkrævet, hvilket gør denne internt kontrollerede metode til vurdering af nukleart ploidi fuldt autonomt.

Fortolkning af nuklear mormormortri
Den beskrevne metode giver en ploidy udlæsning for hepatocyt kerner med "simple" cirkulære morfemur. Udelukkelse af "komplekse" kerner er baseret på den hypotese, at de repræsenterer en andel af binukleare hepatocytter med overlappende / rørende nukleare masker, hvilket gør nøjagtig ploidy bestemmelse for denne delmængde mere udfordrende (Figur 7A). Det er vigtigt at bemærke, at adskillelse af kerner i henhold til cirkularitet ikke gør det muligt for brugeren at skelne mellem kernerne af mononukleare hepatocytter og kerner af binukleare celler, hvor to kerner af lignende ploidy er klart adskilt i cellen. Dette blev empirisk testet ved manuelt at vælge binukleare og mononukleare celler fra billeddatasættene og vurdere deres adskillelse ved hjælp af algoritmen (figur 7B). Kerner af binukleare hepatocytter, der var fysisk tæt (Figur 7C), men "ikke røre" blev kategoriseret af algoritmen som "simple", mens dem, der var "rørende" var klart diskrimineret som "kompleks". Derfor giver denne analyse ikke en udlæsning af cellulære kneb i leveren, da kerner af binukleare celler er opdelt mellem de "enkle" og "komplekse" underklasser (se Diskussion). Men, en vis indsigt i skiftet mellem stater cellulære og nukleare kneb kan opnås fra disse data blot ved at plotte histogrammer af nuklearmorfometri og nuklear størrelse og anvende en model for, hvordan "komplekse" og "simple" stater er overgået mellem under polyploidisering (Figur 7D). I kontrollever observeres tre faser (I−III) af nuklear morfometri klart (figur 7E). De repræsenterer klyngedannelse af henholdsvis cirkulære 2N (I), 4N (II) og 8N (III) (III) (som vist i figur 7D). Mononuclear 16N hepatocytter er yderst sjældne i voksne muselever16,18,21, dermed 16N cellulære ploidy gruppe består næsten udelukkende af binukleare celler med 8N kerner, placeret inden for, og til højre, af fase III ( Figur7E), forklarer faldet i cirkularitet til højre for fase III. Interessant, efter skade (DDC dag 14), en kvantitativ skift i retning af øget kompleksitet ("binuclearity") begynder i fase I (afspejler 2n til 2x2n) og fase III (afspejler 8n til 2x8n), før det er endeligt konsolideret i alle tre faser (I−III). Forfatterne spekulere, at dette skift i retning af øget kompleksitet skyldes en øget cellulær trick som følge af gået i stå cytokinese, mens til højre for fase III den modsatte tendens er observeret, på grund af øget repræsentation af cirkulære 16N mononukleare celler i den skadede lever på grund af endoreplication. Disse observationer skal naturligvis testes ved at tilpasse metoden til korrekt højde for cellulære kneb (se Diskussion).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over arbejdsgangen. Levervæv høstes (1), kryosektioner (2), fast og immunmærket med et HNF4α-antistof, der gør det muligt at diskriminere parenkymale og ikke-parenkymale celler ( NPC'ere (3). Når prøverne er behandlet, digitaliseres de ved hjælp af en billedplatform med højt indhold ved hjælp af automatiseret billedoptagelse (4) og analyse (5). Celler er segmenteret af Hoechst nuklear fluorescens og HNF4α immunfluorescens tærskelværdi. Dernæst beregnes Hoechst nukleare område ("A") og cirkularitet ("C"). Endelig analyseres dataene (6); HNF4α- NPC'er er kvantificeret (i) og HNF4α+ hepatocytkerner er opdelt i to delmængder ("simple" og "komplekse") i henhold til nuklear cirkularitet (ii). Interpolation af hepatocyt nukleart trick udføres derefter for alle "simple" kerner som en funktion af nuklear radius (r) og betyder Hoechst fluorescens intensitet (som en proxy for nuklear DNA tæthed) (iii). Dataene stratificeres derefter ved hjælp af NPC'ere som en intern 2N-kalibrator (iv), før der udarbejdes et eksempelresumé (v). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Billedanalyse med højt indhold og cytometrisk profilering af museleveren under kronisk DDC-fodring. aA) Et repræsentativt konfokalbillede af HNF4α/Hoechst immunfluorescensfarvning af den voksne muselever efter 21 dages fodring med en diæt indeholdende 0,1% DDC billedet viser afrundede HNF4α+ hepatocyte kerner ("H") og udvidelse af HNF4α- NPC'ere i områder omkring portalvenen ("PV"). (B) Eksempler på optimal ("korrekt") og suboptimal ("forkert") nuklear Hoechst farvning indikerer dårlig fiksering. (C) Anvendelse af billedanalyseplatform med høj overførselsgrad til adskillelse af hepatocytter og NPC'ere i henhold til kernekraftfarvning og HNF4α immunmærkning. Softwaremasker (røde/grønne linjer) viser, hvordan kerner er korrekt segmenteret i henhold til Hoechst fluorescens og sorteret i hepatocytter (+) eller NPC'ere (-) i henhold til HNF4α status. (D) En vejledning til optimering af opsætningen til segmenterings-/tærskelanalyse. Overlejret atommasker, der genkendes af softwaren, er angivet med grønne/blå linjer til nuklear segmentering og grøn/blå (HNF4α+) eller rød/blå (HNF4α-) til tærskelanalyse (H = hepatocyte). Fejlfinding: Den nukleare detektionsfølsomhed er indstillet for lavt (i) eller for høj (ii). Tærskel for HNF4α indstillet for lav (iii) eller for høj (iv). (E,F) Kvantitativ analyse af NPC og hepatocytkerner under DDC-fodring: (E) HNF4α- og (F) HNF4α+ nukleare tætheder sammenlignes med tidspunktet for DDC-behandling (dage). I alt 5,7 x 105 celler blev analyseret, fra 4−6 dyr pr. timepunkt. Data præsenteres som gennemsnit + SEM. **P < 0,01 og ***P < 0,001. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne midler. Signifikans P-værdier blev beregnet ved hjælp af Fishers mindst signifikante forskel (LSD) test. (G) Frekvensfordeling af det nukleare område HNF4α+ under DDC-behandling. Dataene viser en højre-skift i hepatocyt nukleare område under skade i overensstemmelse med cellulære hypertrofi og polyploidisation. I alt 2,5 x 105HNF4α+ kerner blev analyseret fra 4−6 dyr pr. timepunkt. Dette tal er blevet ændret fra Manzano-Núñez et al.17. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Automatiseret analyse af hepatocyt nukleare kneb ved hjælp af brugerdefineret skrevet software. (A) Skærmbillede, der viser korrekt formatering af regnearksdata til input til den nukleare ploidy analyse software. Kolonner, der indeholder vigtige data (trin 5.5 i protokollen), er fremhævet gule. Alle kolonnetitler skal nøje svare til de angivne. (B) Skærmbillede, der viser, hvordan individuelle regnearksfiler, der indeholder data fra biologiske replikater ("Sample1", "Sample2" osv.), skal navngives og organiseres i undermapper for hver betingelse (med titlen "Control-d0" og "Injured-d14" i dette eksempel). (C) Skærmbillede efter vellykket installation af ploidy ansøgning (rød cirkel). Når programmet er lanceret (ved at klikke på "Ploidy_Appl..") i my apps fanen af toolstrip "Ploidy_GUI" vises (nederste panel). Eksperimentnavnet ("Eksempel") og stierne til kontrolelementet (f.eks. Run Softwaren beregner, kalibrerer og stratifies nukleare kneb for alle prøver ved hjælp af "Control-d0" datasæt til at generere tærskler for minimalt DNA-indhold. (D) Dataoutput fra Ploidy_Application viser individuelle datafiler, der automatisk gemmes i hver eksempelmappe (i) med absolutte og procentvise tal for "simple" kerner i hver ploidy-gruppe. For hver betingelse (i dette tilfælde både "Control-d0" og "Injured-d14" genereres der også automatisk en sammenfattende mappe, der indeholder gennemsnitlige skøn over kerneploidi for alle "simple" hepatocyt og ikke-hepatocyt kerner (ii) og en opdeling af, hvordan nukleart ploidy er stratificeret for hver prøve (iii). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Anvendelse af NPC'ere som intern ploidy-kalibrator. (A) Graf, der viser virkningen af DDC-skade på gennemsnitligt minimalt DNA-indhold (m) af hepatocyt (HNF4α+) og NPC (HNF4α-) kerner. Alle data normaliseres til dag 0 NPC'ere (n = 4 dyr pr. timepunkt). (B) Histogram, der beskriver fordelingen af NPCm-værdier i en enkelt repræsentativ leverprøve (dag 0, i alt 7.180 kerner). Skemaet (ovenfor) viser, hvordan cirkulære NPC-masker kan stamme fra celler med et 2−4c DNA-indhold. Formålet med kalibreringsmetoden er at definere den stratificeringstærskel, der repræsenterer 4c (S4c) ved den øvre grænse for NPCm-fordelingen (stiplet linje), samtidig med at støj minimeres på grund af segmenteringsfejl i ekstremer af fordelingskurven. CC) Ændringer i middelværdien Hoechst-intensitet og nukleart område for NPC-kerner (HNF4α-) afbildes. For at undgå segmenteringsfejl kontrolleres kun de kerner med en tilsvarende NPCm-værdi inden for 1 SD i tilstanden SPCm-værdien (gul boks). Inden for dette område beregnes 2c−4c-overgangsstørrelsen (t) og bruges som ankerpunkt i dataene til at estimere S4c. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Høj-throughput in situ analyse af nukleare kneb i museleveren under kronisk DDC fodring. (A) Analyse af kontrol voksen lever ved hjælp af den beskrevne metode. HNF4α+ hepatocytkerner fra 2D-leversektioner er opdelt efter Hoechst nukleare cirkularitet i to grupper: "simple" og "komplekse". (Øverst) Repræsentativfluorescens Hoechst billeder af celler, der tilhører disse to grupper er vist. (Venstre) Scatterplot, der viser stratificering af simple HNF4α+ kerner fra en prøve (dag 0) i henhold til interpoleret ploidy-værdi, nukleart område og gennemsnitlig nuklear Hoechst-intensitet. (Højre) Cirkeldiagram med detaljer om den typiske nedbrydning af HNF4α+ celler i kontrolleveren (dag 0) med angivelse af andelen af hver kerneploidi-underklasse. I alt 6,7 x 104 HNF4α+ kerner fra 4 dyr blev analyseret. (B) Virkningen af DDC leverskade på hepatocyt nukleare kneb ved høj-throughput in situ analyse. Grafer viser det relative fald i andelen af 2c og 4c hepatocyt kerner inden for de første 14 dage af DDC fodring mens >8c polyploid kerner dramatisk stigning i antal. I alt 1,5 x 105 HNF4α+ kerner blev analyseret (n = 4 dyr pr. timepoint). Data præsenteres som gennemsnit + SEM. **P < 0,01 og ***P < 0,001. Envejs ANOVA blev brugt til at sammenligne midler. Signifikans P-værdier blev beregnet ved hjælp af Tukey's multisammenligningstest. (C) Eksempel for at vise, hvordan nukleare ploidy underklasser kan spores rumligt inden for parenkyma ved hjælp af denne metode, ved at afhøre højt indhold billeddannelse data med de samme kvantitative kriterier, der anvendes til ploidy stratificering (cirkularitet, nuklear størrelse og gennemsnitlige Hoechst intensitet). Hoechst fluorescens billeder er vist med software masker (røde prikker) mærkning 2c kerner i leveren på to tidspunkter under kronisk DDC fodring (dag 14 og 21). Portalvene (blå stiplet linje) og periportalområder, hvor NPC'ere udvides (gul linje) er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Kritisk vurdering af NPC-kalibreringsmetoden. (A,B) Prolifererende NPC'ere kategoriseres med succes med en >2c ploidy-score. (A) Histogram af NPC minimalt DNA-indhold fra kontrollever, der er immunmærket med antistoffer mod HNF4α og proliferativmarkør Ki-67 (n = 4, data præsenteres som middel + SEM). Stratificeringstærskler for 2c (S2c) og 4c (S4c) er angivet. (B) Stratificering af NPC'ere efter den beskrevne metode resulterer i en betydelig berigelse af Ki-67 immunmærkning i kerner tildelt en >2c ploidy score (n = 12). Data præsenteres som middelværdi + SEM. Ikke-parrede t-test blev brugt til at sammenligne midlet ****P < 0,0001. cC) Ekstern validering af NPC-kalibreringsmetoden. Skøn over gennemsnitligt nukleart hepatocyt-ploidy, der blev opnået ved hjælp af den interne NPC-kalibratormetode, blev sammenlignet med dem, der blev opnået ved kalibrering af de samme prøver (Kontrol C57BL/6 muselever 3−4 måneder, n = 4) med et kendt nukleart volumen for 2N hepatocytter14. Data præsenteres også fra to uafhængige analyser21,22, der beskriver hepatocyt nukleart trick fra mus med samme stamme i alderen 2-6 måneder (vist til højre for den stiplede linje). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Hepatocyt nuklearmormormormortri har en "kompleks" forhold til cellulære kneb. (A) Resumé af, hvordan hepatocyt cellulære ploidy (2N, 4N, 8N og 16N) er delvist adskilt ved 2D-analyse af nuklearmorfometri. Binukleare celler (rød) er opdelt mellem "simple" ("S") og "komplekse" ("C") morfomer afhængigt af, om kerner synes at være rørende eller ej. (B,C) Individuelle hepatocytter blev manuelt udvalgt og analyseret for nuklear mormormortri og internuclear afstand. (B) Binukleare hepatocytter med "rørende" kerner var "komplekse" (100% ≤0,8), mens mononukleare celler (sorte) og binukleare hepatocytter med ikke-rørende atommasker var "simple" (94% >0,8). (C) "Simple" kerner af binukleare hepatocytter kunne skelnes fra kerner af mononukleare celler på grund af signifikant reduceret internuklear afstand (n = 3, i alt 94 analyserede kerner). (D) Model, der nærmer sig, hvordan cellulære kneb ser ud fra panel A, kan fordeles i form af 2D nuklearmorfometri og nukleart område, hvilket resulterer i klyngedannelse af simple cirkulære former i fire faser (I-IV). (E) Sammenligning af hnf4α+ nukleare morfomer/størrelsesparceller i kontrollever (dag 0) og efter 14 dage (venstre) og 21 dage (højre) for DDC-skade. Morfemetifaserne er angivet ovenfor (I−V). Pile angiver forskydninger i nuklearmormormortri som følge af skade, der er i overensstemmelse med binuclearization af 2c ("a"), 4c ("b") og 8c ("c") kerner, sammen med øget mononuclearization af 16N cellulære ploidy klasse (d). I alt 29−30 x 103 kerner analyseret pr. tilstand (n = 2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende filer: Demonstrationsdatasæt. Klik her for at se disse filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En tilgang med højt indhold og høj gennemløb til analyse af vævsremodellering og estimering af hepatocytnukleart ploidi i murineleveren er beskrevet. Når en bruger er fortrolig med proceduren, kan han behandle, afhøre og analysere flere prøver inden for en periode på 3-5 dage og generere store testbare datasæt, der giver en detaljeret underskrift af leverens tilstand. I betragtning af enkeltheden i prøvepræparatmetoden er resultaterne sammen med det store antal celler og vævsområdet analyseret (i gennemsnit 14 mm2/prøve). Automatisering af billedoptagelse og -analyse fjerner også brugerfejl og potentielle bias fra disse vigtige trin. En vigtig nyskabelse er brugen af NPC'ere som en intern ploidy-kalibrator, der muliggør relativ vurdering af hepatocytnukleart DNA-indhold både inden for og mellem prøver. Indarbejdelse af et hnf4α-mærkningstrin er derfor afgørende for at give denne protokol en unik teknisk fordel i forhold til tidligere offentliggjorte 2D-metoder3,12,22. I modsætning hertil gør metodens relative enkelhed i forhold til 3D-rekonstruktionsarbejdsgange18 den teknisk mindre besværlig og potentielt mere fleksibel.

Sammenlignet med præcisionsmetoden for flowcytometri, en vigtig advarsel mod at ekstrapolere nukleart DNA-indhold fra 2D-vævssektioner, er den begrænsede tillid, der kan tilskrives kategoriseringen af individuelle kerner med hensyn til ploidy status. Hertil kommer den iboende bias inden for SIA-baserede tilgange til at overrepræsentere mindre ploidy undergrupper på grund af subekvatorial prøveudtagning. Ved at normalisere data til en intern standard og tage en stor befolkningsbaseret tilgang mindskes fejlen på grund af disse virkninger imidlertid og kan sammenlignes på tværs af stikprøver. Hepatocytter er kendetegnet ved en meget afrundet nuklear morfologi sammenlignet,11,14,15,med10f.eks.23 Den SIA-baserede tilgang er blevet forbedret i denne protokol for at tage højde for både nuklear cirkularitet og DNA-tæthed ved at integrere målinger af morfometri og gennemsnitlig Hoechst fluorescensintensitet, hvilket resulterer i en anslået "minimal DNA-indhold" deskriptor for individuelle kerner. Det er vigtigt, at anvendelsen af NPC'er som 2-4N-ploidy-kontrol udgør en vigtig intern standard for objektiv kalibrering og lagdeling af minimalt nukleart DNA-indhold, hvilket gør den beskrevne metode gældende for prøver af enhver art eller ethvert format, da der kan fremskaffes et passende antistof for HNF4α (eller lignende hepatocytnuklear markør).

Selv om vurdering af nukleare kneb har vist sig at give nyttige underskrifter for leversygdom progression10,13, for fuldt ud at fastslå mangfoldigheden af ploidy ændringer i leveren ville det være både ønskeligt og nødvendigt at tilpasse den beskrevne metode til at tage højde for hepatocellulære perimeter og dermed cellulære ploidy. Kortlægning af cellulære kneb er tidligere opnået ved mærkning af hepatocyt omkredsen ved hjælp af markører såsom beta catenin10,13,24, actin12,22 og cytokeratin10,11 i mennesker og mus leverprøver. Men, når dette blev testet efter DDC skade, dramatiske epitel remodeling udelukket pålidelig vurdering af hepatocellulære omkreds både af phalloidin (data ikke vist) eller antistoffer mod beta catenin17. Selv om denne fremgangsmåde er mulig, kan den derfor ikke anvendes på alle skademodeller, men hvis den opnås, vil det fremskynde kortlægningen af cellulær trick samt foretage skøn over hepatocytstørrelse og antal mere nøjagtige. Det er også sandsynligt, at mononukleare celler ved at tage højde for yderligere nukleare parametre, såsom internuklear afstand (figur 7C), kan blive diskrimineret fra "simple" tonukleare hepatocytter, og at yderligere adskillelse af "komplekse" tonukleare celler kan opnås ved radiale målinger af kernerne, som deres 2D-masker indeholder.

Da der findes validerede humane HNF4α-antistoffer for FFPE-væv25, og at intern kalibrering frigør denne metode med eventuelle artsspecifikke begrænsninger, anvendes protokollen næsten umiddelbart for humane prøver. Den har således et betydeligt potentiale til at tilvejebringe et benchmark for analyse af hepatocyt-kerneploidi og leverskader hos sygdomme hos mennesker med høj gennemløb. Også, ved multiplexing med andre antistoffer, denne metode kan afsløre nye roller for særlige hepatocyt delmængder og deres reaktion på leverskade og sygdom. Med henblik herpå har vi med succes kombineret metoden med immunfarvning for den proliferative nukleare markør Ki-67 (figur 6), som gør det muligt at indsamle nyttige oplysninger - herunder identifikation af ikke-prolifererende 2N-populationer af NPC'ere med henblik på forbedret intern kalibrering af kneb (middag, ikke-offentliggjorte data 2019). Ved at koble fleksibilitet med de positionerbare og kvantitative data, som metoden giver, foreslår vi derfor, at dens fremtidige anvendelser vil forbedre forståelsen af polyploidiets rolle i leveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af den spanske MINECO regering tilskud BFU2014-58686-P (LAN) og SAF-2017-84708-R (DJB). LAN blev støttet af en national MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 og Plan GenT-pris (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) og FMN af et regionalt ValI+D studenterkontor ved Valencias Generalitat ACIF/2016/020. RP vil gerne anerkende prof. Ewa K. Paluch for finansiering. Vi takker Dr. Alicia Martínez-Romero (CIPF Cytometri service) for hjælp med IN Cell Analyzer platform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) TestDiet 1810704 Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A11055 Dilution 1:500
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cryostat Leica CM1850 UV Leica biosystems CM1850 UV Tissue sectioning
Fluorescent Mounting medium Dako S3023
GraphPad Prism GraphPad Software Prism 8 Statistical software for graphing data
Hoechst 33342 Sigma-Aldrich B2261 Final concentration 5 µg/mL
IN Cell Analyzer 1000 GE Healthcare Bio-Sciences Corp High-Content Cellular Imaging and Analysis System
MATLAB MathWorks R2019a Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy
Microscope coverslides VWR International 630-2864 Size of 24 x 60 mm
Microsoft Office Excel Microsoft Speadsheet software
OCT Tissue Tek Pascual y Furió 4583
Paraformaldehyde Panreac AppliChem 141451.121
Pen for immunostaining Sigma-Aldrich Z377821-1EA 5mm tip width
Polysine Microscope Slides VWR International 631-0107
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α Thermo Fisher Scientific PA5-79380 Dilution 1:250 (alternative)
Rabit polyclonal Anti-HNF4α Santa Cruz Biotechnology sc-6556 Dilution 1:200 (antibody used in the study)
Tween 20 Sigma-Aldrich P5927

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
  2. Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
  3. Gentric, G., Desdouets, C. Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide? Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).
  4. Wilkinson, P. D., et al. The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice. Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).
  5. Wilkinson, P. D., et al. Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury. The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).
  6. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  7. Chao, H. W., et al. Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway. Nature Communications. 8 (1), 2238 (2017).
  8. Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents. Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).
  9. Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes. Cell Death & Disease. 8 (5), e2805 (2017).
  10. Gentric, G., et al. Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).
  11. Toyoda, H. Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis. Gut. 54 (2), 297-302 (2005).
  12. Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration. Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).
  13. Bou-Nader, M., et al. Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification. Gut. , (2019).
  14. Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis. Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).
  15. Guidotti, J. E., et al. Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  16. Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol. Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).
  17. Manzano-Núñez, F., et al. Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury. PLoS Biology. 17 (1), e2006972 (2019).
  18. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. eLife. 4, e11214 (2015).
  19. Baratta, J. L., et al. Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis. Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).
  20. Pandit, S. K., et al. E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells. Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).
  21. Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals. Genome. 44 (3), 350-360 (2001).
  22. Tanami, S., et al. Dynamic zonation of liver polyploidy. Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).
  23. Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).
  24. Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. Polyploidy and liver proliferation. Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).
  25. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419 (2015).

Tags

Medicin Udgave 158 lever polyploidi hepatocyt højt indhold billeddannelse hepatologi Hepatocyt nuklear faktor 4 alpha (HNF4α)
En høj-throughput In Situ metode til vurdering af Hepatocyt Nuklearploidy i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manzano-Núñez, F., Peters, … More

Manzano-Núñez, F., Peters, R., Burks, D. J., Noon, L. A. A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice. J. Vis. Exp. (158), e60095, doi:10.3791/60095 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter