Apresentamos um método robusto, econômico e flexível para medir mudanças no número de hepatócitos e ploidy nuclear em amostras de tecido fixo/criopreservado que não requerem citometria de fluxo. Nossa abordagem fornece uma poderosa assinatura amostral de citologia hepática ideal para rastrear a progressão de lesões hepáticas e doenças.
Quando o fígado está ferido, os números de hepatócitos diminuem, enquanto o tamanho da célula, o tamanho nuclear e a ploidy aumentam. A expansão de células não parenquiais como colangiocytes, miofibroblastos, progenitores e células inflamatórias também indicam danos crônicos no fígado, remodelação tecidual e progressão da doença. Neste protocolo, descrevemos uma abordagem simples de alto throughput para calcular mudanças na composição celular do fígado que estão associadas a lesões, doenças crônicas e câncer. Mostramos como as informações extraídas de seções de tecido bidimensional (2D) podem ser usadas para quantificar e calibrar ploidy nuclear hepatocito dentro de uma amostra e permitir que o usuário localize subconjuntos específicos de ploidy dentro do fígado in situ. Nosso método requer acesso a material hepático fixo/congelado, reagentes básicos de imunocitoquímica e qualquer plataforma de imagem padrão de alto conteúdo. Ele serve como uma poderosa alternativa às técnicas padrão de citometria de fluxo, que requerem interrupção do tecido recém-coletado, perda de informações espaciais e viés de desagregação potencial.
Hepatócitos no fígado de mamíferos podem sofrer citocinese paralisada para produzir células binucleares, e endoreplicação de DNA para produzir núcleos poliplóides contendo até 16N conteúdo de DNA. Aumento geral da ploididy celular e nuclear durante o desenvolvimento pós-natal, envelhecimento e em resposta a diversos estresses celulares1. O processo de poliploidização é dinâmico e reversível2,embora sua função biológica precisa ainda não esteja clara3. O aumento da ploidia está associado à redução da capacidade proliferativa4, diversidade genética2, adaptação à lesão crônica5 e proteção contra o câncer6. Alterações de ploidy hepatocito ocorrem como resultado de um ritmo circadiano alterado7, e desmame8. Mais notavelmente, o perfil ploidiano do fígado é alterado por lesão e doença9, e evidências convincentes sugerem que alterações específicas de ploidia, como o aumento de núcleos ≥8N ou perda de hepatócitos 2N, fornecem assinaturas úteis para o rastreamento da progressão da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)3,10, ou o impacto diferencial das infecções virais11.
Em termos gerais, a lesão hepática e a regeneração estão associadas ao aumento do tamanho das células hepatocitos e da área nuclear12,juntamente com o número global reduzido de hepatócitos, particularmente aqueles com teor de DNA 2N10,11. A lesão parenquimal no fígado também é frequentemente acompanhada pela expansão de células não parenquiais (NPCs), incluindo miofibroblastos estrômicos, células inflamatórias e células progenitoras hepáticas bipotentes. Métodos de alto throughput que fornecem um perfil citológico quantitativo de número de células parênquias e ploidia nuclear, ao mesmo tempo em que contabilizam mudanças nos NPCs, portanto, têm um potencial considerável como pesquisas e ferramentas clínicas para acompanhar a resposta do fígado durante lesões e doenças. Análises recentes convincentes in situ de espectroplóide em amostras humanas de carcinoma hepatocelular também demonstram que a ploidia nuclear é dramaticamente aumentada dentro dos tumores e é especificamente amplificada em subtipos tumorais mais agressivos com diferenciação reduzida e perda de TP5313. Assim, há uma forte possibilidade de que os avanços metodológicos na avaliação quantitativa da ploididia nuclear ajudem no futuro perfil prognóstico do câncer de fígado.
Neste protocolo, descreve-se uma metodologia flexível de alto desempenho para a análise comparativa das seções de tecido hepático do camundongo, que fornece perfis citométricos detalhados de números de hepatócitos, a resposta do NPC e um método previamente calibrado internamente para estimar ploidy nuclear (Figura 1). Os hepatócitos são distinguidos dos NPCs pela imunorotulagem do fator nuclear 4 alfa (HNF4α), antes da caracterização do tamanho nuclear e da morfometria nuclear. “Conteúdo mínimo de DNA” é estimado para todas as máscaras nucleares circulares, integrando a intensidade média de Hoechst 33342 (um proxy para a densidade de DNA) com volume nuclear tridimensional interpolado (3D). O conteúdo mínimo de DNA do hepatócito é então calibrado usando NPCs para gerar um perfil de ploidia nuclear.
Aquisição de imagens, segmentação nuclear e análise de imagens são realizadas por meio de imagens de alto conteúdo, permitindo que grandes áreas de seções hepáticas bidimensionais (2D) contendo dezenas de milhares de células sejam rastreadas. Um programa personalizado é fornecido para o pós-processamento automatizado de dados de análise de imagens de alto conteúdo para produzir um perfil ploidy em toda a amostra para todos os núcleos de hepatócitocircularcircular. Isto é realizado usando software gratuito para baixar software para calcular ploidia nuclear com base na análise de imagem estereológica (SIA)10,11,14,15. A metodologia SIA foi previamente validada pela citometria de fluxo como um método preciso, embora trabalhoso, para estimar ploidiy nuclear hepatocito no fígado14, assumindo morfologia nuclear circular e uma relação monótônica entre tamanho nuclear e conteúdo de DNA. Neste protocolo, ambos os parâmetros nucleares são medidos pela avaliação da mormetria nuclear e da rotulagem Hoechst 33342. O cálculo do “conteúdo mínimo de DNA” para cada máscara nuclear é seguido pela calibração da ploidia nuclear hepatocito usando NPCs, que têm um conteúdo conhecido de DNA 2-4N e, portanto, servem como um controle interno útil.
Em comparação com os métodos convencionais de citometria de fluxo16, a abordagem descrita permite que a ploidiiiiiide nuclear hepatocida seja avaliada in situ e não requer acesso a métodos de tecido fresco ou desagregação que podem influenciar os resultados e ser difíceis de padronizar. Como em todas as abordagens baseadas no SIA, as subclasses ploidiais nucleares >2N são sub-representadas pela amostragem 2D devido à secção de núcleos maiores fora do plano equatorial. O perfil ploidy em todo o tecido também descreve o conteúdo mínimo de DNA para todas as máscaras nucleares hepatocidas circulares, e não discrimina diretamente entre hepatocitos mononucleares e células binucleares que têm dois núcleos discretos (“não tocantes”) da mesma ploidy. No entanto, a simplicidade deste protocolo permite um espaço considerável para que ele seja adaptado para responder por parâmetros adicionais, como espaçamento internuclear ou análise de perímetro celular, o que facilitaria a identificação de células binucleares, proporcionando uma avaliação mais detalhada da ploidiia celular.
Uma abordagem de alto teor e alto throughput para a análise da remodelagem de tecidos e estimativa da ploidiiiiiie nuclear hepatocito no fígado de murina é descrita. Uma vez familiarizado com o procedimento, o usuário pode processar, imagem e analisar várias amostras em um período de 3 a 5 dias, gerando grandes conjuntos de dados técíveis que fornecem uma assinatura detalhada da saúde hepática. Dada a simplicidade do método de preparação da amostra, juntamente com o grande número de células e área tecidua…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Governo de Mineco espanhol concede bfu2014-58686-P (LAN) e SAF-2017-84708-R (DJB). A LAN foi apoiada pelo prêmio nacional MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 e plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C) e FMN por uma estudantil regional ValI+D da Generalitat ACIF/2016/020. Rp gostaria de reconhecer o Prof. Ewa K. Paluch para financiamento. Agradecemos à Dra. Alicia Martínez-Romero (serviço citometria da CIPF) pela ajuda com a plataforma IN Cell Analyzer.
3,5-diethoxycarboxynl-1,4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet mouse diet 5015 with 0.1% DDC |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A11055 | Dilution 1:500 |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Cryostat Leica CM1850 UV | Leica biosystems | CM1850 UV | Tissue sectioning |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Statistical software for graphing data |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | Final concentration 5 µg/mL |
IN Cell Analyzer 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | High-Content Cellular Imaging and Analysis System | |
MATLAB | MathWorks | R2019a | Data analytics software for automated analysis of nuclear ploidy |
Microscope coverslides | VWR International | 630-2864 | Size of 24 x 60 mm |
Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet software | |
OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
Pen for immunostaining | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5mm tip width |
Polysine Microscope Slides | VWR International | 631-0107 | |
Rabbit polyclonal Anti-HNF4α | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | Dilution 1:250 (alternative) |
Rabit polyclonal Anti-HNF4α | Santa Cruz Biotechnology | sc-6556 | Dilution 1:200 (antibody used in the study) |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P5927 |