Summary
A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.
Abstract
Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.
Introduction
N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.
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Protocol
Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
- Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução para eluente: 1 M amônio bicarbonato, tampão armazenado: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), solução de limpeza para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
NOTA: O nível de pH é fundamental neste protocolo. A lusão do IgG requer um pH muito baixo, e há um risco de perda de ácidos siálicos devido à hidlíse ácida. Portanto, a elução ocorre em segundos, e o pH é rapidamente restaurado à neutralidade, preservando a integridade do IgG e dos ácidos síalicos. - Prepare as amostras: descongele a amostra de plasma congelado e, em seguida, centrífuga a 80 x g por 10 min, e deixe a proteína G placa monolítica e os produtos químicos acima mencionados para 30 min à temperatura ambiente (RT).
- Transfira uma amostra de 100 μL (que pode ser usada para detectar 2x para evitar a primeira falha) em uma placa de coleta de 2 mL (aqui, um total de seis amostras padrão, uma amostra de controle [água ultra-pura], e 89 amostras de plasma foram projetadas para 96 placas de poço e aleatoriamente atribuídas para a placa).
- Diluir as amostras com 1x PBS por 1:7 (v/v).
- Limpe uma placa de filtro hidrofílico de polipropileno (GHP) de 0,45 μm com 200 μL de água ultra-pura (repita 2x).
- Transfira as amostras diluídas para a placa de filtro e filtre as amostras na placa de coleta usando uma bomba de vácuo (pressão de vácuo de controle em 266,6-399,9 Pa).
- Preparação das placas monolíticas g proteicas
- Descarte o tampão de armazenamento.
- Limpe as placas monolíticas com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 1x PBS, 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico, 2 mL de 10x PBS, 2 mL de 1x PBS (sequencialmente), e remover o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Transfira as amostras filtradas para a placa monolítica G de proteína para a ligação e limpeza igg, em seguida, limpe as placas monolíticas com 2 mL de 1x PBS (repita a limpeza 2x).
- Elute IgG com 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo, em seguida, adicione 170 μL de 1 M bicarbonato de amônio na placa de coleta.
- Detectar a concentração de IgG usando um espectrômetro de absorção (comprimento de onda ideal = 280 nm).
- Abra o software e selecione o modo proteína-CY3.
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela (repita 1x).
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em Sample no software para detectar a água ultra-pura.
- Desenhe 2 μL de amostra IgG e carregue-a na tela e clique na Amostra no software para detectar a amostra.
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela.
- Feche o software.
NOTA: A fórmula para calcular a concentração de IgG é a seguinte:
CIgG = absorvente x coeficiente de extinção (13,7) x 1.000 μg/mL
- Coloque o IgG extraído para secar em forno a 60 °C e preserve o IgG extraído (300 μL extraído IgG por 4 h).
- Remover 300 μL de IgG extraído se a concentração for superior a 1.000 μg/mL.
- Remover 350 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 500-1.000 μg/mL.
- Remover 400 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 200-500 μg/mL.
- Remover 600 μL de IgG extraído se a concentração for menor que 200 μg/mL.
NOTA: A concentração de IgG deve ser de preferência >200 μg/mL para detecção subsequente. A quantidade média de IgG deve ser de preferência >1,200 μg, que pode ser testado 2x no caso de o primeiro teste falhar.
- Limpeza da proteína G placa monolítica para reutilização
- Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 1 mL de 0,1 M NaOH (para remover proteínas precipitadas), 4 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 30% propan-2-ol (para remover proteínas hidrofóbicas encadernadas), 2 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Lave a placa com 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) e adicione 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) para a placa, em seguida, deixe a placa em 4 °C.
2. Liberação de glicano
- Prepare o IgG seco e armazenar os produtos químicos, incluindo 1,33% SDS, 4% Igepal (loja longe da luz), e 5x PBS na RT.
- Prepare a enzima PNGase F diluindo a enzima 250 U com 250 μL de água ultra-pura.
- Desnaturação do IgG
- Adicione 30 μL de 1,33% SDS e misture vórtice, transfira a amostra para um forno de 65 °C por 10 min, em seguida, retire-o do forno e deixe descansar por 15 min.
- Adicione 10 μL de 4% igepal e coloque-o na incubadora tremer por 5 min.
- Remoção e liberação de glicanos
- Adicione 20 μL de 5x PBS e 30-35 μL de 0,1 mol/L NaOH para regular um pH de 8,0, e misture vórtice. Adicione 4 μL de enzima PNGase F e misture vórtice. Em seguida, incubar por 18-20 h em um banho de água 37 °C.
- Coloque os glicanos liberados para secar em um forno a 60 °C para 2,5-3,0 h.
- Salve os glicanos liberados a -80 °C até mais medições.
NOTA: Este passo é fundamental. A chave para a liberação de glicano é melhorar a atividade da enzima PNGase F para maximizar sua eficiência.
3. Rotulagem e purificação de glicanos
- Prepare o reagente de rotulagem 2-aminobenzamida (2-AB) com 0,70 mg de 2-AB, 10,50 μL de ácido acético, 6 mg de cianoboroborodiride de sódio (NaBH3CN) e 24,50 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) (volume total = 35 μL). Em seguida, adicione o ácido acético, 2-AB, e NaBH3CN no DMSO em ordem.
- Rotular os glicanos usando 35 μL de reagente de rotulagem 2-AB, transfira os glicanos rotulados para o oscilador por 5 min, transfira para o forno por 3 h a 65 °C e, em seguida, transfira para a RT por 30 min.
NOTA: Toda a etapa de rotulagem de glicanos deve ser realizada enquanto protegida da luz. - Pré-trate uma placa de filtro GHP de 0,2 μm com 200 μL de 70% de etanol, 200 μL de água ultra-pura e 200 μL de 96% acetônio (4 °C), depois remova resíduos usando uma bomba de vácuo.
- Purificação de glicano rotulado de 2 AB
- Adicione 700 μL de 100% acetônio ao glicano rotulado de 2 AB e transfira para uma incubadora tremer por 5 min.
- Centrífuga a 134 x g por 5 min (4 °C).
- Transfira a amostra para uma placa de filtro GHP de 0,2 μm por 2 min e remova a filtragem (líquido corrente) usando uma bomba de vácuo.
- Lave glican rotulado 2-AB com 200 μL de 96% acetonitrile (4 °C) e retire o filtrado (líquido fluindo) usando uma bomba de vácuo 5x-6x.
- Glican rotulado como Elute 2-AB com 100 μL de água ultra-pura 3x.
- Transfira o glicano rotulado de 2 AB para um forno para secar a 60 °C por 3,5 h.
- Salve os n-glicanos rotulados em -80 °C até mais medição.
4. Cromatografia de interação hidrofílica e análise de glicanos
- Condicionamento de instrumentos UPLC e preparação de fases móveis
- Prepare fases móveis, incluindo solvente A: formato de amônio de 100 mM (pH = 4,4), solvente B: 100% acetônio, solvente C: 90% de água ultra-pura (10% metanol) e solvente D: 50% metanol (água ultra-pura).
- Abra o software para controlar as fases móveis.
- Lave instrumentos UPLC a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) equilibrando-se por 30 min, depois a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) equilibrando-se por 20 min, em seguida, uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min equilíbrio.
- Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 μL de uma mistura de 100% acetônio e água ultra-pura em uma proporção de 2:1 (v/v). Em seguida, centrífuga a 134 × g por 5 min (4 °C) e carregar 10 μL do N-glicans rotulados nos instrumentos UPLC.
- Separe os n-glicanos rotulados a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min com um gradiente linear de 75% a 62% acetônio por 25 min. Em seguida, realize uma coluna analítica de escada/glicopeptide em um UPLC a 60 °C (aqui, as amostras foram mantidas a 4 °C antes da injeção).
- Detecte n- fluorescência glicana na excitação e emissões comprimentos de onda de 330 nm e 420 nm, respectivamente.
- Integrar os glicanos com base no pico de posição e tempo de retenção.
- Calcule o valor relativo de cada Pico glicano (GP) / todos os picos de glicanos (GPs) (porcentagem, %) da seguinte forma: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.
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Representative Results
Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a quantidade de glicanos em cada pico foi expressa como percentual da área integrada total.
Para avaliar a repetibilidade e a estabilidade do método, a amostra padrão foi testada em paralelo seis vezes. Como mostrado na Tabela 2,o coeficiente de variação (CV) de 24 GPs variou de 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) dos quais estavam abaixo de 10%. GPs com proporções relativamente pequenas (≤1.16%) apresentaram erros de medição elevados (mais de 10% do CV). Além disso, os perfis de IgG N-glican combinados de 76 indivíduos(Figura 2)indicaram que a posição do GP era estável, a forma do GP foi semelhante e a integração para as amostras manteve os mesmos intervalos. Os resultados acima indicam que o método é estável e repetível.
Como mostrado na Tabela 3, um adicional de 36 características derivadas que descrevem as abundâncias relativas de galactosilação, sialylation, bisecting GlcNAc, e fucosylation núcleo foram calculados pelos restantes 24 glicanos medidos diretamente. Por exemplo, o G2/G0 (GP12/GP2) refletiu o nível de galactosiloação (di/a-) sem fucosylation do núcleo e glacnac bissecando. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) refletiu o nível de galactosiloação (di/mono-) com fucosylation do núcleo e sem bisecting GlcNAc. Finalmente, o G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) refletiu o nível de galactosiloção (mono-/a-) com fucosylation do núcleo e GlcNAc bisesese. Estes cálculos de glicanos derivados seguem um princípio, para ver a mudança de apenas um traço de glicosilação.
Figura 1: Cromatograma UPLC de um indivíduo. IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. Gp8 representa a soma do GP 8a e GP 8b. Gp16 representa a soma do GP 16a e GP 16b. A estrutura dos glicanos em cada pico cromatográfico e a porcentagem média de estruturas individuais são mostradas na Tabela 1 e na Tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Cromatograma UPLC de 76 indivíduos. Os perfis igg n-glicanos foram combinados de 76 indivíduos para demonstrar a repetibilidade e estabilidade do método. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Tabela 1: Estrutura dos 24 glicanos igg iniciais. GP: pico glicano; F: fucose; R: número de antenas ligadas à sequência central (existente de dois NAcetylglucosamine (GlcNAc) e três resíduos de mannose); B: B: B: B. B. B: B. B. B. B. B. B. B. B. B. B. G: galactose; S: ácido siálico. Os esquemas estruturais são definidos da seguinte forma: quadrado azul: GlcNac; círculo verde: mannose; triângulo vermelho: fucose núcleo / fucose antenas; círculo amarelo: galactose; rhomb roxo: ácido siálico.
| Pico glicano | Média (SD) | CV (%) | Pico glicano | Média (SD) | CV (%) |
| GP1 GP1 | 0.23 (0.017) | 7.28 | GP13 GP13 | 0.50 (0.043) | 8.64 |
| GP2 GP2 | 0.24 (0.034) | 13.97 | GP14 GP14 | 19.54 (0.36) | 1.84 |
| GP3 GP3 | 0.96 (0.16) | 16.73 | GP15 GP15 | 1.16 (0.14) | 11.63 |
| GP4 GP4 | 19.52 (0.58) | 2.98 | GP16 GP16 | 2.79 (0.19) | 6.93 |
| GP5 GP5 | 0.17 (0.024) | 13.86 | GP17 GP17 | 1.29 (0.13) | 9.78 |
| GP6 GP6 | 3.19 (0.26) | 8.22 | GP18 GP18 | 13.16 (0.51) | 3.85 |
| GP7 GP7 | 0.29 (0.033) | 11.51 | GP19 GP19 | 2.12 (0.21) | 9.76 |
| GP8 GP8 | 16.45 (0.62) | 3.77 | GP20 GP20 | 0.12 (0.018) | 14.91 |
| GP9 GP9 | 8.97 (0.52) | 5.74 | GP21 GP21 | 1.05 (0.17) | 16.09 |
| GP10 GP10 | 2.97 (0.22) | 7.34 | GP22 GP22 | 0.18 (0.025) | 14.16 |
| GP11 GP11 | 0.30 (0.041) | 13.82 | GP23 GP23 | 2.14 (0.14) | 6.45 |
| GP12 GP12 | 1.27 (0.026) | 2.08 | GP24 GP24 | 1.43 (0.13) | 9.12 |
Tabela 2: Precisão do método. A amostra padrão é testada em paralelo seis vezes para avaliar a repetibilidade e a estabilidade do método. CV: Coeficiente de Variação; GP: Pico glicano; SD: Desvio padrão.
| Glicanos derivados | Fórmulas | Glicanos derivados | Fórmulas |
| Galactosia | Fucosylation Fucosylation | ||
| G2/G0 G2/G0 | GP12/GP2 GP12 | F1/F0 F1/F0 | GP4/GP2 GP4/GP2 |
| GP14/GP4 GP14 | GP6/GP3 GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 GP15/GP6 | (GP8+ GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 G2/G1 | GP12/GP7 GP12/GP7 | GP14/FGP12 GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8+ GP9) | GP15/GP13 GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10+ GP11) | GP18/GP17 GP18/GP17 | ||
| G1/G0 G1/G0 | GP7/GP2 GP7/GP2 | GP23/GP21 GP23/GP21 | |
| (GP8+ GP9)/GP4 | GP24/GP22 GP22 GP24/GP22 | ||
| (GP10+ GP11)/GP6 | |||
| Sialylation Sialylation | Bisseção glcnac | ||
| S2/S0 S2/S0 | GP21/GP12 GP2 | B1/B0 B1/B0 | GP3/GP2 GP3/GP2 |
| GP22/GP13 GP22/GP13 | GP6/GP4 GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 GP23/GP14 | (GP10+GP11)/ (GP8+ GP9) | ||
| GP24/GP15 GP24/GP15 | GP13/GP12 GP13/GP12 | ||
| S2/S1 S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 GP23/GP18 | GP19/GP18 GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 GP24/GP19 | GP22/GP21 GP22/GP21 | ||
| S1/S0 S1/S0 | GP17/GP12 GP17/GP12 | GP24/GP23 GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 GP19/GP15 | |||
Tabela 3: Cálculo dos glicanos derivados. GP: pico glicano; F: fucose; B: B: B: B. B. B: B. B. B. B. B. B. B. B. B. B. G: galactose; S: ácido siálico.
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Discussion
UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas para purificar o IgG com 96 amostras ao mesmo tempo para detecção de alta produtividade. A capacidade da proteína G para vincular o IgG é maior do que a da proteína A, conforme descrito em estudos anteriores15,16.
Além disso, as estruturas do IgG N-glican estão claramente separadas. Os glicanos igg derivados descrevem o nível de galactosilação, sialylation, bisecting GlcNAc, e fucosylation do núcleo, que são calculados pelos primeiros IgG N-glycans. Em um estudo anterior, alguns glicanos derivados (FBn,FBG0n / G0n,FBn / Fntotal, Bn / (Fn + FBn),FBG2n / FG2n, FG2n / (BG2n + FBG2n), BG2n / (FG2n + FBG2n))poderia refletir a mudança nos múltiplos níveis de glicosionação, mas não refletiu o nível de glicosionação específica15.
Recentemente, um estudo em larga escala mostrou que a galactosila IgG (referida como gal-ratio) pode servir como um biomarcador promissor para o rastreamento do câncer em vários tipos de câncer17. A distribuição da galactosilação igg é medida pelo cálculo das intensidades relativas dos agalactosilados (G0) vs. monogalactosiato (G1) e digalactosiato (G2) N-glicans de acordo com a fórmula (G0/[G1 + G2 x 2]). A gal-ratio reflete o nível de galactosia com fucosylation do núcleo e sem bisecting GlcNAc. Portanto, múltiplos glicostídeos Iniciais igg nforam combinados com um glicano derivado, representando o nível de um traço específico de glicosilação. Os cálculos de glicanos derivados seguem um princípio que explora as mudanças em apenas um traço de glicosilação fixado sobre outras características de glicosilação.
No protocolo atual, o pH é importante para manter a estabilidade das estruturas igg e glicanas, especialmente para a estabilização da sialylation terminal. Portanto, o valor do pH da solução deve ser estritamente controlado, e o pH da solução exposta ao IgG deve ser restaurado, bem como glicanos mantidos em um nível neutro de pH. Além disso, a etapa de liberação de glicanos é fundamental neste protocolo. A chave para a liberação de glicano é melhorar a atividade da enzima PNGase F para maximizar sua eficiência. Por exemplo, verificou-se que 18-20 h é ideal para a digestão PNGaseF. Este passo tem de ser plenamente reagido.
Existem algumas limitações desta técnica. O método utilizado não pode diferenciar glicanos liberados das porções Fab e Fc da IgG. Glicanos de Fab e Fc são conhecidos por serem diferentes. Com os desenvolvimentos em glicoproteômica, técnicas de detecção podem medir os níveis de IgG combinando N-glicanos para explorar o papel de IgG N-glicosianos e n-glicosividade em doenças. O custo do equipamento é relativamente baixo; no entanto, o custo por amostra é bastante alto.
Em resumo, este protocolo introduz UPLC para que ele possa ser amplamente utilizado. Avaliação abrangente e padronização dos métodos analíticos são necessários antes que quantidades significativas de tempo e recursos sejam investidos em estudos de grande escala. À medida que o UPLC se torna mais amplamente utilizado, os efeitos de IgG N-glicans e n-glicosilação em certas doenças podem ser mais precisamente determinados, e os biomarcadores de glicosilação podem ser usados para aplicações clínicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
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