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अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन जी एन-ग्लाइकन विश्लेषण

Published: January 18, 2020 doi: 10.3791/60104
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1, 1, 1, 2, 2, 1,2,3, 1
1Beijing Key Laboratory of Clinical Epidemiology, School of Public Health, Capital Medical University, 2School of Public Health, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University
* These authors contributed equally

Summary

इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) एन-ग्लाइकन को हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी यूपीएलसी का उपयोग करके चिह्नित किया गया है। इसके अलावा, आईजीजी एन-ग्लिकन की संरचना स्पष्ट रूप से अलग हो गई है। यहां प्रस्तुत इस प्रयोगात्मक विधि का परिचय है ताकि इसका व्यापक रूप से शोध सेटिंग्स में उपयोग किया जा सके।

Abstract

ग्लिकॉमिक्स ओमिक्स सिस्टम रिसर्च में एक नई उपविशेषता है जो रोग संवेदनशीलता, दवा लक्ष्य खोज और सटीक दवा के लिए अगली पीढ़ी के बायोमार्कर की खोज में महत्वपूर्ण क्षमता प्रदान करता है। वैकल्पिक आईजीजी एन-ग्लाइकान कई आम पुरानी बीमारियों में सूचित किया गया है और नैदानिक अनुप्रयोगों में महान क्षमता है (यानी, निदान और रोगों की भविष्यवाणी के लिए बायोमार्कर) का सुझाव दिया । हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी (एचआईएलआईसी) अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) की विधि का उपयोग करके आईजीजी एन-ग्लाइकान को व्यापक रूप से चित्रित किया जाता है। UPLC अच्छी प्रजनन क्षमता और उच्च सापेक्ष मात्रात्मक सटीकता के साथ एक स्थिर पहचान प्रौद्योगिकी है। इसके अलावा, आईजीजी एन-ग्लिकन की संरचना स्पष्ट रूप से अलग हो जाती है, और प्लाज्मा में ग्लाइकन संरचना और सापेक्ष बहुतायत की विशेषता है।

Introduction

N-glycosylation मानव प्रोटीन के एक आम और आवश्यक के बाद अनुवाद संशोधन1 है और घटना और अपेक्षाकृत सही रोगों के विकास की भविष्यवाणी में मदद कर सकते हैं । इसकी संरचना की जटिलता के कारण, यह उम्मीद की जाती है कि 5,000 से अधिक ग्लाइकन संरचनाएं हैं, जो बीमारियों के लिए नैदानिक और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर के रूप में महान क्षमता प्रदान करतीहैं। इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) से जुड़े एन-ग्लाइकान को आईजीजी के कार्य के लिए आवश्यक दिखाया गया है, और आईजीजी एन-ग्लाइकोसिलेशनसमर्थक और विरोधी भड़काऊ प्रणालियों3के बीच संतुलन में भाग लेता है । अंतर आईजीजी एन-ग्लाइकोसिलेशन रोग के विकास और प्रगति में शामिल है, जो रोग विकृति में शामिल एक गड़बड़ी और कार्यात्मक तंत्र दोनों का प्रतिनिधित्व करता है। आईजीजी एन-ग्लाइकोसिलेशन की भड़काऊ भूमिका उम्र बढ़ने, भड़काऊ बीमारियों, ऑटोइम्यून रोगों और कैंसर4से जुड़ी रही है ।

डिटेक्शन तकनीक के विकास के साथ, निम्नलिखित तरीकों का सबसे व्यापक रूप से उच्च थ्रूपुट ग्लाइकॉमिक्स में उपयोग किया जाता है: हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी (एचआईएलआईसी) अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी फ्लोरेसेंस डिटेक्शन (यूपीएलसी-एफएएलआर), लेजर प्रेरित फ्लोरेसेंस के साथ मल्टीप्लेक्स केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस डिटेक्शन (एक्ससीजीई-एलआईएफ), मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिकोरेटन/आयनीकरण समय-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (माल्डी-टीओएफ-एमएस), और लिक्विड क्रोमेटोग्राफी इलेक्ट्रोस्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस) . इन तरीकों ने कम प्रवाह, अस्थिर परिणामों और खराब संवेदनशीलता विशिष्टता5,6की पिछली कमियों को दूर किया है।

UPLC व्यापक रूप से IgG N-ग्लाइकोसिलेशन और कुछ रोगों के बीच संबंध का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है (यानी,उम्र 7,मोटापा8,डिस्लिपिडमिया9,प्रकार द्वितीय मधुमेह10,उच्च रक्तचाप11,इस्कीमिक स्ट्रोक12,और पार्किंसंस रोग13)। अन्य तीन उपर्युक्त तरीकों की तुलना में, यूपीएलसी में निम्नलिखित लाभ5,14हैं। सबसे पहले, यह एक सापेक्ष मात्रात्मक विश्लेषण विधि प्रदान करता है, और डेटा विश्लेषण जिसमें कुल क्षेत्र सामान्यीकरण शामिल है, प्रत्येक नमूने की तुलनीयता में सुधार करता है। दूसरा, उपकरणों और आवश्यक विशेषज्ञता की लागत अपेक्षाकृत कम है, जो इसे लागू करने और नैदानिक अनुप्रयोगों में ग्लाइकोसिलेशन बायोमार्कर को बदलने के लिए आसान बनाता है । यहां प्रस्तुत UPLC के लिए एक परिचय है तो यह और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

प्रोटोकॉल में शामिल सभी विषयों को कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी, बीजिंग, चीन12की एथिक्स कमिटी ने मंजूरी दे दी है । अध्ययन की शुरुआत में प्रत्येक विषय से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. आइजी अलगाव

  1. बाध्यकारी बफर (फॉस्फेट बफरेड लवण, पीबीएस): 1x पीबीएस (पीएच = 7.4), बेअसर बफर: 10x पीबीएस (पीएच = 6.6-6.8), एल्यूंट: 0.1 एम फोरमिक एसिड (पीएच = 2.5), एलुएंट के लिए बेअसर समाधान: 1 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट, संग्रहीत बफर: 20% सहित रसायनों को तैयार करें: 20% इथेनॉल + 20 mM Tris + 0.1 M NaCl (पीएच = 7.4), प्रोटीन जी के लिए सफाई समाधान: 0.1 एम NaOH + 30% प्रोपन-2-ol.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में पीएच का स्तर महत्वपूर्ण है। आइजी के एलुशन के लिए बहुत कम पीएच की जरूरत होती है और एसिड हाइड्रोलिसिस के कारण सिलिक एसिड के नुकसान का खतरा रहता है। इसलिए, एल्यूशन सेकंड के भीतर होता है, और पीएच जल्दी से तटस्थता के लिए बहाल किया जाता है, आईजीजी और सियालिक एसिड की अखंडता को संरक्षित करता है।
  2. नमूने तैयार करें: जमे हुए प्लाज्मा नमूना पिघल तो 10 ग्राम के लिए ८० x ग्राम पर अपकेंद्री, और प्रोटीन जी अखंड थाली और कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 min के लिए ऊपर उल्लिखित रसायनों छोड़ दें ।
  3. एक 100 माइक्रोन नमूना स्थानांतरित करें (जिसका उपयोग पहली विफलता को रोकने के लिए 2x का पता लगाने के लिए किया जा सकता है) 2 मिलील संग्रह प्लेट में (यहां, कुल छह मानक नमूने, एक नियंत्रण नमूना [अल्ट्रा-शुद्ध पानी], और 89 प्लाज्मा नमूने 96 अच्छी प्लेटों और बेतरतीब ढंग से सौंपे गए के लिए डिज़ाइन किए गए थे थाली में) ।
  4. 1:7 (v/v) द्वारा 1x पीबीएस के साथ नमूनों को पतला करें ।
  5. अल्ट्रा-प्योर पानी (दोहराने 2x) के 200 माइक्रोन के साथ 0.45 माइक्रोएम हाइड्रोफिलिक पॉलीप्रोपाइलीन (जीएचपी) फिल्टर प्लेट साफ करें।
  6. पतला नमूनों को फिल्टर प्लेट में स्थानांतरित करें और नमूनों को वैक्यूम पंप (266.6-399.9 पीए पर वैक्यूम प्रेशर को नियंत्रित करें) का उपयोग करके संग्रह प्लेट में फ़िल्टर करें।
  7. प्रोटीन जी अखंड प्लेटों की तैयारी
    1. भंडारण बफर को त्यागें।
    2. अल्ट्रा-प्योर वॉटर के 2 एमएल, 1एक्स पीबीएस के 2 एमएल, 0.1 एम फोरिक एसिड का 1 एमएल, 10एक्स पीबीएस का 2 एमएल, 1x पीबीएस का 2 एमएल (क्रमिक रूप से) के साथ अखंड प्लेटों को साफ करें और वैक्यूम पंप का उपयोग करके बहने वाले तरल को हटा दें।
  8. फ़िल्टर किए गए नमूनों को आईजीजी बाइंडिंग और सफाई के लिए प्रोटीन जी अखंड प्लेट में स्थानांतरित करें, फिर 1x पीबीएस के 2 मिलील के साथ अखंड प्लेटों को साफ करें (सफाई 2x दोहराएं)।
  9. 0.1 एम फोरिक एसिड के 1 एमएल के साथ Elute IgG और वैक्यूम पंप द्वारा संग्रह प्लेट में नमूनों को फ़िल्टर, तो संग्रह प्लेट में 1 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट के 170 μL जोड़ें।
  10. अवशोषण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (इष्टतम तरंगदैर्ध्य = 280 एनएम) का उपयोग करके आईजीजी एकाग्रता का पता लगाएं।
    1. सॉफ्टवेयर खोलें और प्रोटीन-CY3 मोड का चयन करें।
    2. अल्ट्रा-प्योर पानी के 2 माइक्रोन ड्रा करें और इसे स्क्रीन में लोड करें, फिर स्क्रीन को साफ करने के लिए सॉफ्टवेयर में ब्लैंक क्लिक करें (1x दोहराएं)।
    3. अल्ट्रा-प्योर पानी के 2 माइक्रोन ड्रा करें और इसे स्क्रीन में लोड करें, फिर अल्ट्रा-प्योर वॉटर का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर में सैंपल पर क्लिक करें ।
    4. आईजीजी नमूने के 2 माइक्रोन ड्रा और स्क्रीन में लोड, तो नमूना का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर में नमूना क्लिक करें ।
    5. अल्ट्रा-प्योर पानी के 2 माइक्रोन ड्रा करें और इसे स्क्रीन में लोड करें, फिर स्क्रीन को क्लियर करने के लिए सॉफ्टवेयर में ब्लैंक पर क्लिक करें।
    6. सॉफ्टवेयर बंद करें।
      नोट: आईजीजी एकाग्रता की गणना का फार्मूला इस प्रकार है:

      सीआईजीजी = अवशोषण एक्स विलुप्त होने गुणांक (13.7) x 1,000 μg/mL
  11. निकाले गए आईजीजी को 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में सूखने के लिए रखें और निकाले गए आईजीजी (300 माइक्रोन 4 एच के लिए आईजीजी निकाले गए) को संरक्षित करें।
    1. यदि एकाग्रता 1,000 μg/mL से अधिक है तो निकाले गए आईजीजी के 300 माइक्रोन निकालें।
    2. यदि एकाग्रता 500-1,000 μg/mL के बीच है तो निकाले गए आईजीजी के 350 माइक्रोन निकालें।
    3. यदि एकाग्रता 200-500 μg/mL के बीच है तो निकाले गए आईजीजी के ४०० μL को हटा दें ।
    4. यदि एकाग्रता 200 μg/mL से छोटी है तो निकाले गए आईजीजी के 600 माइक्रोन निकालें।
      नोट: आईजीजी की एकाग्रता को बाद में पता लगाने के लिए अधिमानतः >gt;200 μg/mL होना चाहिए । आईजीजी की औसत राशि अधिमानतः 1,200 माइक्रोन होनी चाहिए, जिसे पहले परीक्षण में विफल रहने की स्थिति में 2x का परीक्षण किया जा सकता है।
  12. पुन: उपयोग के लिए प्रोटीन जी अखंड प्लेट की सफाई
    1. अल्ट्रा-प्योर पानी के 2 मिलील के साथ प्लेट को धोएं, 0.1 एम नाओएच का 1 एमएल (उपजी प्रोटीन को हटाने के लिए), अल्ट्रा-प्योर पानी का 4 एमएल, और 1x पीबीएस (क्रमिक रूप से) का 4 मिलीएल, फिर वैक्यूम पंप का उपयोग करके बहने वाले तरल को हटा दें।
    2. अल्ट्रा-प्योर पानी के 2 एमएल के साथ प्लेट को धोएं, 30% प्रोपन-2-ओल (बाउंड हाइड्रोफोबिक प्रोटीन को हटाने के लिए), अल्ट्रा-प्योर वॉटर का 2 एमल, और 1x पीबीएस (क्रमिक रूप से) का 4 एमएल, फिर वैक्यूम पंप का उपयोग करके बहने वाले तरल को हटा दें।
    3. प्लेट को 1 मिलीमीटर बफर (20% इथेनॉल + 20 एमएम ट्रिस + 0.1 एम नैसीएल) से धोएं और प्लेट में 1 मिलीमीटर बफर (20% इथेनॉल + 20 एमएम ट्रिस + 0.1 एम नैल) डालें, फिर प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।

2. ग्लाइकन रिलीज

  1. सूखे आईजीजी को तैयार करें और 1.33% एसडीएस, 4% इग्पाल (प्रकाश से दूर स्टोर) और आरटी में 5x पीबीएस सहित रसायनों को स्टोर करें।
  2. अल्ट्रा-प्योर पानी के 250 माइक्रोन के साथ 250 यू एंजाइम को कमजोर करके पीएनगैस एफ एंजाइम तैयार करें।
  3. आइजी की निंदा
    1. 1.33% एसडीएस के 30 माइक्रोन जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण करें, नमूने को 10 किमी के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्थानांतरित करें, फिर इसे ओवन से हटा दें और 15 किमी के लिए आराम करें।
    2. 4% इगेपाल के 10 माइक्रोन जोड़ें और इसे 5 मिन के लिए मिलाते हुए इनक्यूबेटर पर रखें।
  4. ग्लाइकान को हटाना और जारी करना
    1. 8.0 के पीएच को विनियमित करने के लिए 5x पीबीएस के 20 माइक्रोन और 0.1 मोल/एल नाओएच के 30-35 माइक्रोन जोड़ें, और भंवर द्वारा मिलाएं। पीएनगास एफ एंजाइम के 4 माइक्रोन जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण। फिर 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 18-20 घंटे का इनक्यूबेट।
    2. जारी ग्लाइकान को ओवन में 2.5-3.0 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सूखने के लिए रखें।
    3. आगे माप तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जारी ग्लाइकान को सहेजें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है। ग्लिकन रिलीज की कुंजी अपनी दक्षता को अधिकतम करने के लिए पीएनगैस एफ एंजाइम की गतिविधि में सुधार कर रही है।

3. ग्लाइकन लेबलिंग और शुद्धि

  1. 2-अमीनोबेंजामाइड (2-एबी) लेबलिंग रिएजेंट को 0.70 मिलीग्राम 2-एबी, 10.50 माइक्रोन ऑफ एसिटिक एसिड, 6 मिलीग्राम सोडियम साइनोबोरोहाइड्राइड (एनबीएच3सीएन) और डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) (कुल वॉल्यूम = 35 माइक्रोन) के 24.50 माइक्रोन तैयार करें। इसके बाद आदेश में डीएमएसओ में एसिटिक एसिड, 2-एबी और एबीएच3सीएन डालें।
  2. 2-एबी लेबलिंग रिएजेंट के 35 माइक्रोन का उपयोग करके ग्लाइकान लेबल करें, लेबल ग्लाइकान को 5 मिन के लिए ऑसिलेटर में स्थानांतरित करें, 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ओवन में स्थानांतरित करें, फिर 30 मिन के लिए आरटी में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रकाश से सुरक्षित रहते हुए पूरे ग्लाइकर लेबलिंग चरण को किया जाना चाहिए।
  3. 70% इथेनॉल के 200 माइक्रोन, अल्ट्रा-प्योर पानी के 200 माइक्रोन, और 96% एसिटोनिट्रिल (4 डिग्री सेल्सियस) के 200 माइक्रोन के साथ 0.2 माइक्रोन जीएचपी फिल्टर प्लेट का प्रीट्रीट करें, फिर वैक्यूम पंप का उपयोग करके कचरे को हटा दें।
  4. 2-एबी लेबल ग्लाइकन की शुद्धि
    1. 2-एबी लेबल ग्लाइकन में 100% एसीटोनिट्रिल के 700 माइक्रोन जोड़ें और 5 मिन के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    2. 5 मिन (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 134 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    3. नमूना को 2 मिन के लिए 0.2 माइक्रोन जीएचपी फिल्टर प्लेट में स्थानांतरित करें और वैक्यूम पंप का उपयोग करके फिल्ट्रेट (बहने वाला तरल) हटा दें।
  5. 2- एबी लेबल ग्लाइकन को 96% एसीटोनिट्रिल (4 डिग्री सेल्सियस) के 200 माइक्रोन के साथ और वैक्यूम पंप 5x-6x का उपयोग करके फिल्ट्रेट (बहने वाला तरल) निकालें।
  6. Elute 2-AB अल्ट्रा शुद्ध पानी 3x के १०० μL के साथ ग्लाइकन लेबल ।
  7. 3.5 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सूखने के लिए 2-एबी लेबल ग्लाइकन को ओवन में स्थानांतरित करें।
  8. लेबल एन-ग्लाइकान को अगले माप तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें।

4. हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी और ग्लाइकान का विश्लेषण

  1. यूपीएलसी उपकरणों की कंडीशनिंग और मोबाइल चरणों की तैयारी
    1. सॉल्वेंट ए: 100 एम एम अमोनियम फोर्टेट (पीएच = 4.4), सॉल्वेंट बी: 100% एसीटोनिट्रिल, सॉल्वेंट सी: 90% अल्ट्रा-प्योर वॉटर (10% मेथनॉल), और सॉल्वेंट डी: 50% मेथनॉल (अल्ट्रा-प्योर वॉटर) सहित मोबाइल चरणतैयार करें।
    2. मोबाइल चरणों को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर खोलें।
    3. 0.2 mL/min (50% विलायक बी और 50% विलायक सी) की प्रवाह दर पर UPLC उपकरणों को धोकर 30 मिन के लिए संतुलन, फिर 02 मीटर/मिन (25% विलायक ए और 75% विलायक बी) की प्रवाह दर पर 20 मिन के लिए संतुलन, फिर 0.4 mL/मिन संतुलन की प्रवाह दर।
  2. एक 2:1 अनुपात (v/v) पर १००% एसीटोनिट्रिल और अल्ट्रा शुद्ध पानी के मिश्रण के 25 μL के साथ लेबल एन-ग्लाइकान भंग । फिर, 5 मिन (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए 134 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र और लेबल एनके 10 μL लोड-glycans UPLC उपकरणों में ।
  3. 25 मिन के लिए 75% से 62% एसीटोनिट्रिल के रैखिक ढाल के साथ 0.4 mL/m की प्रवाह दर पर लेबल एन-ग्लाइकान अलग करें। फिर, 60 डिग्री सेल्सियस पर एक UPLC पर dextran अंशांकन सीढ़ी/ग्लाइकोपेडटाइड कॉलम द्वारा संचालित एक विश्लेषणात्मक प्रदर्शन करें (यहां, इंजेक्शन से पहले नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था)।
  4. क्रमशः 330 एनएम और 420 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग लंबाई में एन-ग्लाइकन फ्लोरेसेंस का पता लगाएं।
  5. पीक पोजीशन और रिटेंशन टाइम के आधार पर ग्लाइकान को एकीकृत करें।
  6. प्रत्येक ग्लाइकन पीक (जीपी)/सभी ग्लाइकन चोटियों (जीपीएस) (प्रतिशत,%) के सापेक्ष मूल्य की गणना करें इस प्रकार: GP1: GP1/जीपीएस * १००, GP2: GP2/जीपीएस * १००, GP3: GP3/जीपीएस * १००, आदि

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Representative Results

जैसा कि चित्र ा 1में दिखाया गया है, आईजीजी एन-ग्लाइकान का विश्लेषण पीक पोजीशन और रिटेंशन टाइम के आधार पर 24 प्रारंभिक आईजीजी ग्लाइकन चोटियों (जीपीएस) में किया गया था। एन- ग्लाइकन संरचनाएं पिछले अध्ययन(तालिका 1)15के अनुसार बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्शन के माध्यम से उपलब्ध हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम तुलनीय थे, कुल क्षेत्र सामान्यीकरण लागू किया गया था, जिसमें प्रत्येक चोटी में ग्लाइकान की मात्रा कुल एकीकृत क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी।

विधि की पुनरावृत्ति और स्थिरता का आकलन करने के लिए, मानक नमूने का समानांतर छह बार परीक्षण किया गया था। जैसा कि तालिका 2में दिखाया गया है, 24 जीपीएस के भिन्नता (सीवी) का गुणांक 1.84%-16.73%, 15 (62.50%) जिनमें से 10% से नीचे थे। अपेक्षाकृत छोटे अनुपात वाले जीपीएस (‧1.16%) उच्च माप त्रुटियों (सीवी के 10% से अधिक) दिखाया। इसके अलावा, आईजीजी एन-ग्लाइकन प्रोफाइल ७६ व्यक्तियों(चित्रा 2)से संयुक्त संकेत दिया है कि जीपी की स्थिति स्थिर थी, जीपी का आकार समान था, और नमूनों के लिए एकीकरण एक ही अंतराल बनाए रखा । उपरोक्त परिणामों से संकेत मिलता है कि विधि स्थिर और दोहराने योग्य है।

जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है, गैलेक्टोसिलेशन, सियालेशन, बाइकेटिंग ग्लैक्नैक और कोर फ्यूकोसिलेशन की सापेक्ष बहुतायतों का वर्णन करने वाले एक अतिरिक्त 36 व्युत्पन्न लक्षणों की गणना शेष 24 द्वारा सीधे मापी गई ग्लाइकान द्वारा की गई थी। उदाहरण के लिए, G2/G0 (GP12/GP2) ने कोर फ्यूकोसिलेशन और बाइकेटिंग ग्लैक्नैक के बिना गैलेक्टोसिलेशन (di-/a-) के स्तर को परिलक्षित किया । G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) ने कोर फ्यूकोसिलेशन के साथ और बिना बाइकेटिंग ग्लैक्नैक के गैलेक्टोसिलेशन (डी-/मोनो-) के स्तर को परिलक्षित किया । अंत में, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) ने कोर फ्यूकोसिलेशन और बाइकेटिंग ग्लैक्नैक के साथ गैलेक्टोसिलेशन (मोनो/ए-) के स्तर को परिलक्षित किया । व्युत्पन्न ग्लाइकान की ये गणनाएं केवल एक ग्लाइकोसिलेशन विशेषता के परिवर्तन को देखने के लिए एक सिद्धांत का पालन करती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एक व्यक्ति का UPLC क्रोमेटोग्राम। आईजीजी एन-ग्लाइकान का विश्लेषण पीक पोजीशन और रिटेंशन टाइम के आधार पर 24 प्रारंभिक आईजीजी ग्लाइकन चोटियों (जीपीएस) में किया गया था । GP8 जीपी 8a और जीपी 8b के योग का प्रतिनिधित्व करता है । GP16 जीपी 16a और जीपी 16b के योग का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक क्रोमेटोग्राफिक चोटी में ग्लाइकान की संरचना और व्यक्तिगत संरचनाओं का औसत प्रतिशत तालिका 1 और तालिका 2में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 76 व्यक्तियों के UPLC क्रोमेटोग्राम। विधि की पुनरावृत्ति और स्थिरता प्रदर्शित करने के लिए आईजीजी एन-ग्लिकन प्रोफाइल को 76 व्यक्तियों से जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: 24 प्रारंभिक आईजीजी ग्लाइकान की संरचना। जीपी: ग्लाइकन पीक; एफ: fucose; ए: कोर अनुक्रम (दो NAcetylglucosamine (GlcNAc) और तीन mannose अवशेषों के मौजूदा से जुड़े एंटीना की संख्या); बी: GlcNac bisecting; जी: गैलेक्टोज; एस: सियालिक एसिड। संरचनात्मक योजनाओं को इस प्रकार परिभाषित किया गया है: नीला वर्ग: GlcNac; ग्रीन सर्कल: मैननोस; लाल त्रिकोण: कोर fucose/एंटीना फ्यूकोस; पीला चक्र: गैलेक्टोज; बैंगनी रोम्ब: सियालिक एसिड।

ग्लाइकन पीक मतलब (एसडी) सीवी (%) ग्लाइकन पीक मतलब (एसडी) सीवी (%)
जीपी1 0.23 (0.017) 7.28 जीपी13 0.50 (0.043) 8.64
जीपी2 0.24 (0.034) 13.97 जीपी14 19.54 (0.36) 1.84
जीपी3 0.96 (0.16) 16.73 जीपी15 1.16 (0.14) 11.63
जीपी4 19.52 (0.58) 2.98 जीपी16 2.79 (0.19) 6.93
जीपी5 0.17 (0.024) 13.86 जीपी17 1.29 (0.13) 9.78
जीपी6 3.19 (0.26) 8.22 जीपी18 13.16 (0.51) 3.85
जीपी7 0.29 (0.033) 11.51 जीपी19 2.12 (0.21) 9.76
जीपी8 16.45 (0.62) 3.77 जीपी20 0.12 (0.018) 14.91
जीपी9 8.97 (0.52) 5.74 जीपी21 1.05 (0.17) 16.09
जीपी10 2.97 (0.22) 7.34 जीपी22 0.18 (0.025) 14.16
जीपी11 0.30 (0.041) 13.82 जीपी23 2.14 (0.14) 6.45
जीपी12 1.27 (0.026) 2.08 जीपी24 1.43 (0.13) 9.12

तालिका 2: विधि की सटीकता। विधि की पुनरावृत्ति और स्थिरता का आकलन करने के लिए मानक नमूने का समानांतर छह बार परीक्षण किया जाता है। सीवी: भिन्नता का गुणांक; जीपी: ग्लाइकन पीक; एसडी: मानक विचलन।

व्युत्पन्न ग्लाइकान सूत्र व्युत्पन्न ग्लाइकान सूत्र
गैलेक्टोसिलेशन फ्यूकोसिलेशन
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8+ GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8 + GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10 + GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8+ GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10+ GP11)/GP6
सियालेशन बाइकेटिंग ग्लैक्नेक
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10+GP11)/(GP8 + GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

तालिका 3: व्युत्पन्न ग्लाइकान की गणना। जीपी: ग्लाइकन पीक; एफ: fucose; बी: GlcNac bisecting; जी: गैलेक्टोज; एस: सियालिक एसिड।

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Discussion

यूपीएलसी एक सापेक्ष मात्रात्मक विश्लेषण विधि5,15के रूप में कार्य करता है । परिणामों से संकेत मिलता है कि UPLC अच्छी प्रजनन क्षमता और सापेक्ष मात्रात्मक सटीकता के साथ एक स्थिर पहचान प्रौद्योगिकी है । प्रत्येक चोटी में ग्लाइकान की मात्रा यूपीएलसी का उपयोग करके कुल एकीकृत क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की जाती है, जो सापेक्ष मूल्य है। सापेक्ष मात्रा परीक्षण नमूनों की तुलनीयता में सुधार करता है। इसके अलावा, 96 अच्छी तरह से प्रोटीन जी प्लेटों का उपयोग उच्च थ्रूपुट डिटेक्शन के लिए एक समय में 96 नमूनों के साथ आईजीजी को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। आईजीजी को बांधने के लिए प्रोटीन जी की क्षमता प्रोटीन ए की तुलना में अधिक है, जैसा कि पिछले अध्ययनों में वर्णित है15,16।

इसके अलावा, आईजीजी एन-ग्लिकन की संरचनाएं स्पष्ट रूप से अलग हैं। व्युत्पन्न आईजीजी ग्लाइकान गैलेक्टोसिलेशन, सियालिंग, बाइकॉन्टिंग ग्लनक और कोर फ्यूकोसिलेशन के स्तर का वर्णन करता है, जिसकी गणना प्रारंभिक आईजीजी एन-ग्लाइकान द्वारा की जाती है। पिछले अध्ययन में, कुछ व्युत्पन्न ग्लाइकन (एफबीएन,एफबीजी0एन/जी0 एन,एफबीएन/एफ एनटोटल,बीएन/(एफ एन + एफबीएन),एफबीजी2 एन/एफजी2एन,FG2n/(BG2 n + FBG2n),BG2n/(FG2 n + FBG2n))कई ग्लाइकोसिलेशन स्तरों में परिवर्तन को प्रतिबिंबित कर सकता है लेकिन विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन15के स्तर को प्रतिबिंबित नहीं किया ।

हाल ही में, एक बड़े पैमाने पर अध्ययन से पता चला है कि Ig galactosylation (लड़की अनुपात के रूप में संदर्भित) कई कैंसर प्रकार17में कैंसर स्क्रीनिंग के लिए एक होनहार बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं । आईजीजी गैलेक्टोसिलेशन के वितरण को एगलेक्टोसिटेड (जी0) बनाम मोनोगैलेक्टोसिटेड (जी1) और डिगालैक्टोसिटेड (जी2) एन-ग्लाइकान की सापेक्ष तीव्रता की गणना करके मापा जाता है जो सूत्र (G0/[G1 + G2 x 2]) के अनुसार होता है। गल-अनुपात कोर फ्यूकोसिलेशन के साथ और बिना किसी छेड़छाड़ GlcNAc के गैलेक्टोसिलेशन के स्तर को दर्शाता है। इसलिए, कई प्रारंभिक आईजीजी एन-ग्लाइकान को एक व्युत्पन्न ग्लाइकन के साथ जोड़ा गया था, जो एक विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन विशेषता के स्तर का प्रतिनिधित्व करता था। व्युत्पन्न ग्लाइकान की गणना एक सिद्धांत का पालन करती है जो अन्य ग्लाइकोसिलेशन विशेषता पर निर्धारित केवल एक ग्लाइकोसिलेशन विशेषता में परिवर्तनों की पड़ताल करता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, पीएच आईजीजी और ग्लाइकन संरचनाओं की स्थिरता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से टर्मिनल सियालेशन को स्थिर करने के लिए। इसलिए, समाधान के पीएच मूल्य को कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए, और आईजीजी के संपर्क में आने वाले समाधान के पीएच को बहाल किया जाना चाहिए और साथ ही तटस्थ पीएच स्तर पर रखे गए ग्लाइकान को भी बहाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में ग्लाइक रिलीज स्टेप महत्वपूर्ण है। ग्लिकन रिलीज की कुंजी अपनी दक्षता को अधिकतम करने के लिए पीएनगैस एफ एंजाइम की गतिविधि में सुधार कर रही है। उदाहरण के लिए, यह पाया गया कि 18-20 घंटे पीएनगैसेएफ पाचन के लिए इष्टतम है। इस कदम पर पूरी तरह प्रतिक्रिया देने की जरूरत है।

इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। उपयोग की जाने वाली विधि फैब और आईजीजी के एफसी भागों से जारी ग्लाइकान में अंतर नहीं कर सकती है। फैब और एफसी से ग्लाइकान अलग होने के लिए जाना जाता है । ग्लाइकोप्रोटोमिक्स के विकास के साथ, पता लगाने की तकनीक आईजीजी एन-ग्लाइकान और बीमारियों में एन-ग्लाइकोसिलेशन की भूमिका का पता लगाने के लिए एन-ग्लाइकानके संयोजन के स्तर को माप सकती है। उपकरणों की लागत अपेक्षाकृत कम है; हालांकि, प्रति नमूना लागत अधिक है।

संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल UPLC का परिचय देता है ताकि इसका व्यापक रूप से उपयोग किया जा सके। बड़े पैमाने पर अध्ययन ों में महत्वपूर्ण समय और संसाधनों का निवेश करने से पहले विश्लेषणात्मक तरीकों के व्यापक मूल्यांकन और मानकीकरण की आवश्यकता होती है। चूंकि UPLC अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, कुछ बीमारियों पर आईजीजी एन-ग्लाइकान और एन-ग्लाइकोसिलेशन के प्रभाव ों को अधिक सटीक रूप से निर्धारित किया जा सकता है, और ग्लाइकोसिलेशन बायोमार्कर का उपयोग नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81673247 और 81872682) और ऑस्ट्रेलियाई-चीन सहयोगी अनुदान (एनएच एंड एमआरसी - APP1112767 -NSFC 81561128020) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

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References

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Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

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