Summary
ImmunoglobulinG (IgG) N-glican è caratterizzato utilizzando l'interazione idrofila cromatografica UPLC. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata. Presentato qui è un'introduzione a questo metodo sperimentale in modo che possa essere ampiamente utilizzato nelle impostazioni di ricerca.
Abstract
Il glicomics è una nuova sottospecializzazione nella ricerca sul sistema omico che offre un potenziale significativo nella scoperta di biomarcatori di nuova generazione per la suscettibilità alle malattie, la scoperta di bersagli farmacologici e la medicina di precisione. I iggini alternativi IgG Nsono stati riportati in diverse malattie croniche comuni e hanno suggerito di avere un grande potenziale nelle applicazioni cliniche (ad esempio, biomarcatori per la diagnosi e la previsione delle malattie). IgG N-glicani sono ampiamente caratterizzati utilizzando il metodo di cromatografia di interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione (UPLC). UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e un'elevata precisione quantitativa relativa. Inoltre, la struttura di IgG N-glycan è chiaramente separata, e la composizione glicana e l'abbondanza relativa nel plasma sono caratterizzati.
Introduction
N-glicosilazione delle proteine umane è una modifica post-traduzionale comune ed essenziale1 e può aiutare a prevedere l'insorgenza e lo sviluppo di malattie in modo relativamente accurato. A causa della complessità della sua struttura, si prevede che ci siano più di 5.000 strutture glicane, fornendo un grande potenziale come biomarcatori diagnostici e predittivi per le malattie2. N-glicani attaccati all'immunoglobulina G (IgG) hanno dimostrato di essere essenziali per la funzione di IgG, e IgG N-glycosylation partecipa all'equilibrio tra i sistemi pro e antinfiammatori3. La legatura IgG Ndifferenziale è coinvolta nello sviluppo e nella progressione della malattia, che rappresenta sia una predisposizione che un meccanismo funzionale coinvolto nella patologia della malattia. Il ruolo infiammatorio di IgG N-glycosylation è stato associato con l'invecchiamento, malattie infiammatorie, malattie autoimmuni, e cancro4.
Con lo sviluppo della tecnologia di rilevamento, i seguenti metodi sono più ampiamente utilizzati nei licoli ad alta produttività: cromatografia ad interazione idrofila (HILIC) cromatografia liquida ad altissima prestazione con rilevamento della fluorescenza (UPLC-FLR), elettroforesi gelpillara multiplalesa con fluorino indotto dal laser rilevamento dell'escenza (xCGE-LIF), spettrometria di massa di desorption/ionizzazione del tempo di ionizzazione del tempo di volo (MALDI-TOF-MS) e spettrometria di massa elettrospray a matrice (LC-ESI-MS) . Questi metodi hanno superato le precedenti carenze di basso flusso, risultati instabili e scarsa specificità di sensibilità5,6.
UPLC è ampiamente usato per esplorare l'associazione tra IgG N-glicosilazione e alcune malattie (ad esempio, invecchiamento7, obesità8, dislipidemia9, tipo II diabete10, ipertensione11, ictus ischemico12, e morbo di Parkinson13). Rispetto agli altri tre metodi di cui sopra, UPLC ha i seguenti vantaggi5,14. In primo luogo, fornisce un metodo di analisi quantitativa relativa e l'analisi dei dati che comporta la normalizzazione totale delle aree migliora la comparabilità di ogni campione. In secondo luogo, il costo delle attrezzature e le competenze richieste sono relativamente bassi, il che rende più facile implementare e trasformare i biomarcatori della glicosilazione in applicazioni cliniche. Presentato qui è un'introduzione a UPLC in modo che possa essere più ampiamente utilizzato.
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Protocol
Tutti i soggetti inclusi nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Etico della Capital Medical University, Pechino, Cina12. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni materia all'inizio dello studio.
1. Isolamento IgG
- Preparare le sostanze chimiche, tra cui il buffer di legatura (fosfato buffer saline, PBS): 1x PBS (pH - 7,4), neutralizzazione del buffer: 10x PBS (pH - 6,6-6,8), eluente: 0,1 M di acido formica (pH - 2,5), soluzione neutralizzante per eluente: 1 M di bicarbonato di ammonio, memorizzato nel buffer: 20% etanolo - 20 mM Tris - 0,1 M NaCl (pH - 7,4), soluzione di pulizia per la proteina G: 0,1 M NaOH - 30% propan-2-ol.
NOTA: il livello di pH è fondamentale in questo protocollo. L'eluzione di IgG richiede un pH molto basso, e c'è il rischio di perdita di acidi sialici a causa dell'idrolisi acida. Pertanto, l'eluizione avviene in pochi secondi e il pH viene rapidamente ripristinato alla neutralità, preservando l'integrità di IgG e degli acidi sialici. - Preparare i campioni: scongelare il campione di plasma congelato, quindi centrifugare a 80 x g per 10 min, e lasciare la proteina G piastra monolitica e le sostanze chimiche di cui sopra per 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire un campione di 100 l (che può essere utilizzato per rilevare 2x per prevenire il primo guasto) in una piastra di raccolta da 2 mL (qui, un totale di sei campioni standard, un campione di controllo [acqua ultrapura] e 89 campioni di plasma sono stati progettati per 96 piastre di pozzo e assegnati in modo casuale al piatto).
- Diluire i campioni con 1x PBS di 1:7 (v/v).
- Pulire una piastra filtrante in polipropilene idrofilo (GHP) di 0,45 m con 200 l di acqua ultrapura (ripetere 2x).
- Trasferire i campioni diluiti nella piastra filtrante e filtrarli nella piastra di raccolta utilizzando una pompa a vuoto (pressione del vuoto di controllo a 266.6-399.9 Pa).
- Preparazione delle piastre monolitiche proteiche G
- Eliminare il buffer di archiviazione.
- Pulire le piastre monolitiche con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL di 1x PBS, 1 mL di acido formica di 0,1 M, 2 mL di 10x PBS, 2 mL di 1x PBS (in sequenza) e rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Trasferire i campioni filtrati nella proteina G piastra monolitica per il legame IgG e la pulizia, quindi pulire le piastre monolitiche con 2 mL di 1x PBS (ripetere la pulizia 2x).
- Evitare L'IgG con 1 mL di acido formica da 0,1 M e filtrare i campioni nella piastra di raccolta con la pompa a vuoto, quindi aggiungere 170 l of 1 M di bicarbonato di ammonio nella piastra di raccolta.
- Rilevare la concentrazione di IgG utilizzando uno spettrometro di assorbimento (lunghezza d'onda ottimale - 280 nm).
- Aprire il software e selezionare la modalità proteina-CY3.
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo (ripetere 1x).
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare l'acqua ultra-pura.
- Disegnare 2 l- di campione IgG e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Campione nel software per rilevare il campione.
- Disegnare 2 - L di acqua ultra-pura e caricarlo nello schermo, quindi fare clic su Vuoto nel software per cancellare lo schermo.
- Chiudere il software.
NOTA: La formula per calcolare la concentrazione di IgG è la seguente:
CIgG - coefficiente di assorbimento x estinzione (13,7) x 1.000 g/mL
- Mettete l'IgG estratto ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi e conservate l'IgG estratto (300 gradi-L estratto IgG per 4 h).
- Rimuovere 300 l di IgG estratto se la concentrazione è maggiore di 1.000 g/mL.
- Rimuovere 350 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 500-1.000 g/mL.
- Rimuovere 400 l di IgG estratto se la concentrazione è compresa tra 200-500 g/mL.
- Rimuovere 600 l di IgG estratto se la concentrazione è inferiore a 200 g/mL.
NOTA: La concentrazione di IgG dovrebbe essere preferibilmente >200 g/mL per il rilevamento successivo. La quantità media di IgG dovrebbe essere preferibilmente >1.200 g, che può essere testato 2x nel caso in cui il primo test non riesce.
- Pulizia della proteina G piastra monolitica per il riutilizzo
- Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di 0,1 M NaOH (per rimuovere le proteine precipitate), 4 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare la piastra con 2 mL di acqua ultra-pura, 2 mL del 30% propan-2-ol (per rimuovere le proteine idrofobiche legate), 2 mL di acqua ultra-pura e 4 mL di 1x PBS (in sequenza), quindi rimuovere il liquido che scorre utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare la piastra con 1 mL di tampone (20% etanolo , 20 Mm Tris e 0,1 M NaCl) e aggiungere la piastra di 1 mL di tampone (20% di etanolo , 20 Mm Tris , 0,1 M di NaCl) alla piastra, quindi lasciare la piastra a 4 gradi centigradi.
2. Rilascio di Glycan
- Preparare l'IgG essiccato e conservare le sostanze chimiche tra cui 1.33% SDS, 4% Igepal (negozio lontano dalla luce), e 5x PBS a RT.
- Preparare l'enzima PNGase F diluindo 250 U enzima con 250 l di acqua ultra-pura.
- Denaturazione di IgG
- Aggiungere 30 - L di 1,33% SDS e mescolare vortice, trasferire il campione in un forno a 65 gradi per 10 min, quindi toglierlo dal forno e lasciare riposare per 15 min.
- Aggiungere 10 L del 4% Igepal e posizionarlo sull'incubatrice agitazione per 5 min.
- Rimozione e rilascio di glicani
- Aggiungete 20 l di 5x PBS e 30-35 l l di 0,1 mol/L NaOH per regolare un pH di 8,0 e mescolate mediante vortice. Aggiungere 4 L di Enzima PNGase F e mescolare vortice. Quindi, incubare per 18-20 h in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Mettete i glitrali rilasciati ad asciugare in forno a 60 gradi centigradi per 2,5-3,0 h.
- Salvare i glicani rilasciati a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.
NOTA: questo passaggio è fondamentale. La chiave per il rilascio di glicani è migliorare l'attività dell'enzima PNGase F per massimizzarne l'efficienza.
3. Etichettatura e purificazione del glicano
- Preparare il reagente di etichettatura 2-aminobenzamide (2-AB) con 0,70 mg di 2-AB, 10,50 l di acido acetico, 6 mg di cianoboboidride di sodio (NaBH3CN) e 24,50 - L di dimetilfossido di dimetilluso (DMSO) (volume totale 35 . Quindi, aggiungere acido acetico, 2-AB, e NaBH3CN nel DMSO in ordine.
- Etichettare i glicani utilizzando 35 gradi l di reagente di etichettatura 2-AB, trasferire i glicani etichettati all'oscillatore per 5 min, trasferire al forno per 3 h a 65 gradi centigradi, quindi trasferire a RT per 30 min.
NOTA: l'intero passaggio di etichettatura glican deve essere eseguito mentre è protetto dalla luce. - Pretrattare una piastra filtrante GHP da 0,2 m con 200 gradi l di 70% di etanolo, 200 l di acqua ultrapura e 200 luna del 96% acetonitrile (4 gradi), quindi rimuovere i rifiuti con una pompa a vuoto.
- Purificazione del glicano etichettato 2-AB
- Aggiungere 700 loffi del 100% di acetonitrile al glicano etichettato 2-AB e trasferirlo in un'incubatrice tremante per 5 min.
- Centrifuga a 134 x g per 5 min (4 gradi centigradi).
- Trasferire il campione su una piastra filtrante GHP di 0,2 m per 2 min e rimuovere il filtrato (liquido che scorre) utilizzando una pompa a vuoto.
- Lavare il glicano etichettato 2-AB con 200 -L of 96% acetonitrile (4 ) e rimuovere il filtrante (liquido scorrevole) utilizzando una pompa a vuoto 5x-6x.
- Glicano etichettato 2-AB eluito con 100 litri di acqua ultrapura 3x.
- Trasferire il glicano con etichetta 2-AB in forno ad asciugare a 60 gradi centigradi per 3,5 h.
- Salvare gli N-glicani con l'etichetta a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore misurazione.
4. Cromatografia e analisi dell'interazione idrofila
- Condizionamento degli strumenti UPLC e preparazione delle fasi mobili
- Preparare fasi mobili, tra cui solvente A: 100 mM di formato di ammonio (pH - 4,4), solvente B: acetonitrile 100%, solvente C: 90% acqua ultra-pura (10% metanolo) e solvente D: 50% metanolo (acqua ultra-pura).
- Aprire il software per controllare le fasi mobili.
- Lavare gli strumenti UPLC a una portata di 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) bilanciato per 30 min, quindi ad una velocità di flusso di 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) bilanciamento per 20 min, quindi una velocità di flusso di 0,4 mL/ bilanciamento.
- Sciogliere i n-glicani etichettati con 25 gradi di una miscela di acetonitrile 100% e acqua ultra-pura ad un rapporto 2:1 (v/v). Quindi, centrifugare a 134 g per 5 min (4 gradi centigradi) e caricare 10 -L degli strumenti N-glicani etichettati negli strumenti UPLC.
- Separare i valori etichettati N-glicani alla portata di 0,4 mL/min con una pendenza lineare del 75% al 62% di acetonitrile per 25 min. Quindi, eseguire una corsa analitica da dextran calibrazione colonna / colonna di glicopeptide su un UPLC a 60 gradi centigradi (qui, i campioni sono stati tenuti a 4 gradi centigradi prima dell'iniezione).
- Rileva la fluorescenza N-glican a lunghezze di eccitazione ed emissione di 330 e 420 nm, rispettivamente.
- Integrare i glicani in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione.
- Calcolare il valore relativo di ogni picco di Glycan (GP)/ tutti i picchi di Glycan (GP) (percentuale, %) come segue: GP1: GP1/GP-100, GP2: GP2/GP-100, GP3: GP3/GP-100, ecc.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 1, IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. Le strutture N-glicani sono disponibili attraverso il rilevamento della spettrometria di massa secondo uno studio precedente (Tabella 1)15. Per garantire che i risultati fossero comparabili, è stata applicata la normalizzazione totale dell'area, in cui la quantità di glicani in ogni picco è stata espressa come percentuale dell'area totale integrata.
Per valutare la ripetibilità e la stabilità del metodo, il campione standard è stato testato in parallelo sei volte. Come mostrato nella tabella 2, il coefficiente di variazione (CV) di 24 GP variava dall'1,84%-16,73%, 15 (62,50%) di cui erano al di sotto del 10%. GP con proporzioni relativamente ridotte hanno mostrato elevati errori di misurazione (più del 10% del CV). Inoltre, i profili IgG N-glycan combinati da 76 individui (Figura 2) indicavano che la posizione di GP era stabile, la forma del GP era simile e l'integrazione per i campioni manteneva gli stessi intervalli. I risultati di cui sopra indicano che il metodo è stabile e ripetibile.
Come mostrato nella Tabella 3, sono stati calcolati dai restanti 24 glicani misurati direttamente da galactosilazione, la sialylation, la bisecazione Di GlcNAc e la fucosilazione del nucleo. Ad esempio, G2/G0 (GP12/GP2) riflette il livello di galactosilazione (di-a-) senza fucosilazione di base e bisecazione GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 - GP9]) rifletteva il livello di galactosilazione (di-/mono-) con fucosilation di base e senza bisinserire GlcNAc. Infine, G1/G0 ([GP10 - GP11]/GP6) rifletteva il livello di galactosilation (mono/a-) con la fucosilazione del nucleo e la bisecazione di GlcNAc. Questi calcoli di glicani derivati seguono un principio, per vedere il cambiamento di un solo tratto di glicosilazione.
Figura 1: cromatogramma UPLC di un individuo. IgG N-glicani sono stati analizzati in 24 picchi iniziali di glicani (GP) in base alla posizione di picco e al tempo di ritenzione. GP8 rappresenta la somma di GP 8a e GP 8b. GP16 rappresenta la somma di GP 16a e GP 16b. La struttura dei glicani in ogni picco cromatico e la percentuale media di singole strutture sono indicate nella tabella 1 e nella tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: cromatogramma UPLC di 76 individui. I profili IgG N-glican sono stati combinati da 76 individui per dimostrare la ripetibilità e la stabilità del metodo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Struttura dei 24 glicani IgG iniziali. GP: picco glicano; F: fucose; A: numero di antenne attaccate alla sequenza centrale (esistente di due NAcetylglucosamine (GlcNAc) e tre residui di mannosi); B: bisecting GlcNac; G: galactose; S: acido sighilico. Gli schemi strutturali sono definiti come segue: quadrato blu: GlcNac; cerchio verde: mannose; triangolo rosso: fucose/ antenna fucose sfus; cerchio giallo: galactose; rombo viola: acido siconica.
| Picco glicano | Media (SD) | CV (%) | Picco glicano | Media (SD) | CV (%) |
| GP1 | 0.23 (0.017) | 7.28 | GP13 | 0.50 (0.043) | 8.64 |
| GP2 | 0.24 (0.034) | 13.97 | GP14 | 19.54 (0.36) | 1.84 |
| Criteri di gruppo | 0.96 (0.16) | 16.73 | GP15 | 1.16 (0.14) | 11.63 |
| GP4 | 19.52 (0.58) | 2.98 | GP16 | 2.79 (0.19) | 6.93 |
| GP5 | 0.17 (0.024) | 13.86 | GP17 | 1.29 (0.13) | 9.78 |
| GP6 | 3.19 (0.26) | 8.22 | GP18 | 13.16 (0.51) | 3.85 |
| GP7 | 0.29 (0.033) | 11.51 | GP19 | 2.12 (0.21) | 9.76 |
| GP8 | 16.45 (0.62) | 3.77 | GP20 | 0.12 (0.018) | 14.91 |
| GP9 | 8.97 (0.52) | 5.74 | Gp21 | 1.05 (0.17) | 16.09 |
| GP10 | 2.97 (0.22) | 7.34 | GP22 | 0.18 (0.025) | 14.16 |
| GP11 | 0.30 (0.041) | 13.82 | GP23 | 2.14 (0.14) | 6.45 |
| GP12 | 1.27 (0.026) | 2.08 | Criteri di gruppo | 1.43 (0.13) | 9.12 |
Tabella 2: Precisione del metodo. Il campione standard viene testato in parallelo sei volte per valutare la ripetibilità e la stabilità del metodo. CV: Coefficiente di Variazione; GP: picco di gliani; SD: Deviazione standard.
| Glicani Derivati | Formule | Glicani Derivati | Formule |
| Galactosylation | Fucosylation | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8) /GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8 | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8) /GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10/ GP11)/GP6 | |||
| Sialazione | Bisezio GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10-GP11)/ (GP8 | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
Tabella 3: Calcolo dei glicani derivati. GP: picco glicano; F: fucose; B: bisecting GlcNac; G: galactose; S: acido sighilico.
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Discussion
UPLC funge da metodo di analisi quantitativa relativa5,15. I risultati indicano che UPLC è una tecnologia di rilevamento stabile con una buona riproducibilità e relativa precisione quantitativa. La quantità di glicani in ogni picco è espressa come percentuale dell'area totale integrata utilizzando UPLC, che è il valore relativo. La quantificazione relativa migliora la comparabilità dei campioni di prova. Inoltre, 96 piastre g di proteine sono utilizzate per purificare IgG con 96 campioni contemporaneamente per il rilevamento ad alta produttività. La capacità della proteina G di legare IgG è maggiore di quella della proteina A, come descritto negli studi precedenti15,16.
Inoltre, le strutture di IgG N-glycan sono chiaramente separate. I glicani IgG derivati descrivono il livello di galactosilazione, sialylation, bisecting GlcNAc e fucosylation core, che vengono calcolati dai igg N-glicani iniziali. In uno studio precedente, alcuni glicani derivati (FBn, FBG0n / G0n, FBn / Fntotal, Bn / (Fn - FBn), FBG2n / FG2n, FG2n / (BG 2n - FBG2n), BG2n / (FG2n - FBG2n)) potrebbe riflettere la variazione nei livelli multipli di glicosilazione, ma non rifletteva il livello di glicosilazione specifica15.
Recentemente, uno studio su larga scala ha dimostrato che la galactosilazione IgG (indicata come Gal-ratio) può servire come biomarcatore promettente per lo screening del cancro in più tipi di cancro17. La distribuzione della galactosilazione IgG viene misurata calcolando le intensità relative di agalactosylated (G0) vs monogalactosylated (G1) e digalactosylated (G2) N-glicani secondo la formula (G0/[G1 x G2 x 2]). Il Gal-ratio riflette il livello di galactosilazione con fucosilazione del nucleo e senza bisonzare GlcNAc. Pertanto, più IgG N-glicani iniziali sono stati combinati con un glicano derivato, che rappresenta il livello di uno specifico tratto di glicosilazione. I calcoli dei glicani derivati seguono un principio che esplora i cambiamenti in un solo tratto di glicosilazione fissato su altri tratti di glicosilazione.
Nel protocollo attuale, il pH è importante per mantenere la stabilità delle strutture IgG e glicani, in particolare per stabilizzare la sialazione terminale. Pertanto, il valore di pH della soluzione deve essere rigorosamente controllato e il pH della soluzione esposta a IgG deve essere ripristinato e i glicani mantenuti a un livello di pH neutro. Inoltre, il passaggio di rilascio del glican è fondamentale in questo protocollo. La chiave per il rilascio di glicani è migliorare l'attività dell'enzima PNGase F per massimizzarne l'efficienza. Ad esempio, è stato scoperto che 18-20 h è ottimale per la digestione di PNGaseF. Questo passaggio deve essere completamente reagito.
Ci sono alcune limitazioni di questa tecnica. Il metodo utilizzato non può differenziare i glicani rilasciati dalle porzioni Fab e Fc di IgG. I glicani di Fab e Fc sono noti per essere diversi. Con gli sviluppi della glicoproteomica, le tecniche di rilevamento possono misurare i livelli di IgG combinando N-glicani per esplorare il ruolo dei glocani Ne N-glycoslation nelle malattie. Il costo delle attrezzature è relativamente basso; tuttavia, il costo per campione è piuttosto elevato.
In sintesi, questo protocollo introduce UPLC in modo che possa essere ampiamente utilizzato. Sono necessarie valutazioni e standardizzazione complete dei metodi analitici prima che inserino notevoli quantità di tempo e risorse in studi su larga scala. Man mano che UPLC diventa più ampiamente utilizzato, gli effetti di IgG N-glicani e N-glycoslation su alcune malattie possono essere determinati in modo più accurato e i biomarcatori della glicosilazione possono essere utilizzati per applicazioni cliniche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e dalla australiana-Cina Collaborative Grant (NH & MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M.
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
