Summary
免疫球蛋白G（IgG）N-甘油采用亲水相互作用色谱UPLC的特征是。 此外，IgG N-甘油的结构明显分离。这里介绍这个实验方法，以便它可以在研究环境中广泛使用。
Abstract
Glycomics 是组学系统研究的一个新的子专业，在发现下一代疾病易感性、药物靶点发现和精密医学的生物标志物方面具有巨大潜力。替代IgG N-甘油已报告在几个常见的慢性疾病，并建议在临床应用（即，诊断和预测疾病的生物标志物）有很大的潜力。IgG N-甘油采用亲水相互作用色谱法（HILIC）超高性能液相色谱（UPLC）进行广泛描述。UPLC是一种稳定的检测技术，具有良好的可重复性和较高的相对定量精度。此外，IgG N-甘甘的结构明显分离，血浆中的甘油成分和相对丰度具有特征。
Introduction
人类蛋白质的N-糖基化是一种常见和必要的转化后修饰1，有助于相对准确地预测疾病的发生和发展。由于其结构的复杂性，预计将有超过5000个甘油结构，为疾病2提供诊断和预测生物标志物的巨大潜力。附于免疫球蛋白G（IgG）的N-甘油已被证明对IgG的功能至关重要，IgG N-糖基化参与亲炎和抗炎系统之间的平衡3。差异IgG N-糖基化参与疾病发展和进展，代表疾病病理学中涉及的易感性和功能机制。IgG N-糖基化的炎症作用与衰老、炎症性疾病、自身免疫性疾病和癌症4相关。
随着检测技术的发展， 以下方法在高通量胶质中应用最广泛：亲水相互作用色谱（HILIC）具有荧光检测（UPLC-FLR）的高性能液相色谱，用激光诱导荧光的多路毛细管凝胶电泳 电感检测（xCGE-LIF）、矩阵辅助激光解吸/电光飞行质谱仪（MALDI-TOF-MS）和液相色谱电喷雾质谱（LC-ESI-MS）.这些方法克服了以前低通量、结果不稳定、灵敏度特异性差等缺点。
UPLC被广泛用于探索IgG N-糖基化与某些疾病（即衰老7、肥胖8、血脂异常9、II型糖尿病10、高血压11、缺血性中风12和帕金森病13）之间的联系。与上述其他三种方法相比，UPLC 具有以下优势5、14。首先，它提供了一种相对定量分析方法，涉及总面积规范化的数据分析提高了每个样本的可比性。其次，设备成本和所需的专业知识相对较低，这使得实施和将糖基化生物标志物转化为临床应用变得更加容易。这里介绍UPLC，以便它可以更广泛地使用。
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Protocol
协议中的所有科目均已获首都医科大学道德委员会批准。在研究开始时，每个科目都获得了书面知情同意。
1. IgG隔离
- 制备化学品包括结合缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，PBS）：1x PBS（pH = 7.4），中和缓冲液：10x PBS（pH = 6.6-6.8），脱液：0.1M甲酸（pH = 2.5），中和溶液的增色剂：1M碳酸氢铵，储存缓冲液：20%乙醇 = 20 mM Tris = 0.1 M NaCl （pH = 7.4），蛋白质 G 的清洁溶液：0.1 M NaOH = 30% 丙二醇。
注： pH 水平在此协议中至关重要。IgG 的洗脱需要非常低的 pH，并且存在由于酸水解而损失的黄酸风险。因此，洗脱在几秒钟内发生，pH值迅速恢复到中性，保持IgG和黄酸的完整性。 - 准备样品：将冷冻血浆样品解冻，然后在80 x g下离心10分钟，在室温（RT）下将蛋白G单片和上述化学物质保持30分钟。
- 将100μL样品（可用于检测2倍以防止第一次故障）转移到2mL收集板（这里，共有6个标准样品，1个控制样品[超纯水]，89个等离子样品被设计为96个井板，并随机分配到板）。
- 用 1x PBS 稀释样品 1：7 （v/v）。
- 用 200 μL 的超纯水清洁 0.45 μm 亲水聚丙烯 （GHP） 滤板（重复 2 倍）。
- 将稀释的样品转移到过滤板中，并使用真空泵将样品过滤到收集板中（控制真空压力在 266.6-399.9 Pa 处）。
- 蛋白质G单片的制备
- 丢弃存储缓冲区。
- 用 2 mL 的超纯水、2 mL 的 1x PBS、1 mL 0.1 M 的甲酸、2 mL 的 10x PBS、2 mL 的 1x PBS（顺序）清洁单片，并使用真空泵去除流动液体。
- 将过滤样品转移到蛋白质 G 单片板进行 IgG 结合和清洁，然后用 2 mL 的 1x PBS 清洁单片（重复清洁 2x）。
- 用1mL的0.1M甲酸将样品过滤到收集板中，然后加入170μL的1M碳酸氢铵。
- 使用吸收分光光度计检测 IgG 浓度（最佳波长 = 280 nm）。
- 打开软件并选择蛋白质-CY3模式。
- 绘制 2 μL 的超纯水并将其加载到屏幕中，然后单击软件中的空白以清除屏幕（重复 1 倍）。
- 绘制 2 μL 的超纯水并将其加载到屏幕中，然后单击软件中的"样品"以检测超纯水。
- 绘制 2 μL IgG 样品并将其加载到屏幕中，然后单击软件中的"样品"以检测样品。
- 绘制 2 μL 的超纯水并将其加载到屏幕中，然后单击软件中的空白以清除屏幕。
- 关闭软件。
注：计算IgG浓度的公式如下：
CIgG = 吸收 x 消光系数 （13.7） x 1，000 μg/mL
- 将提取的 IgG 在 60°C 的烤箱中干燥，并将提取的 IgG（300 μL 提取 IgG）保存 4 小时。
- 如果浓度大于1，000μg/mL，则去除300μL提取的IgG。
- 如果浓度在500-1，000μg/mL之间，则去除350 μL提取的IgG。
- 如果浓度在200-500μg/mL之间，则去除提取的IgG400μL。
- 如果浓度小于200μg/mL，则去除600μL提取的IgG。
注：IgG的浓度应优选为>200 μg/mL，以便后续检测。IgG的平均量应优选为>1，200 μg，在第一次测试失败时可测试2倍。
- 清洁蛋白质 G 单片，以便重复使用
- 用 2 mL 的超纯水、1 mL 的 0.1 M NaOH（用于去除沉淀的蛋白质）、4 mL 的超纯水以及 4 mL 的 1x PBS（顺序）清洗板，然后使用真空泵去除流动液体。
- 用2 mL的超纯水、2 mL的30%丙醇（用于去除带界的疏水蛋白）、2 mL的超纯水以及4 mL的1x PBS（顺序）清洗板，然后使用真空泵去除流动液体。
- 用 1 mL 缓冲液（20% 乙醇 + 20 mm Tris = 0.1 M NaCl）清洗板，并在板中加入 1 mL 的缓冲液（20% 乙醇 + 20 Mm Tris = 0.1 M NaCl），然后将板留在 4°C 处。
2. 甘油释放
- 准备干燥的IgG并储存化学品，包括1.33%的SDS、4%的Igepal（远离光线的储存）和5x PBS在RT。
- 用250μL的超纯水稀释250U酶，制备PNGase F酶。
- IgG 的变性
- 加入30 μL的1.33%SDS，通过涡旋混合，将样品转移到65°C烤箱中10分钟，然后从烤箱中取出，休息15分钟。
- 加入10μL的4%Igepal，并将其放在摇动的孵化器上5分钟。
- 甘油的去除和释放
- 加入20 μL的5xPBS和30-35μL的0.1 mol/L NaOH，以调节8.0的pH值，并通过涡旋混合。加入4μL的PNGaseF酶，通过涡旋混合。然后，在37°C的水浴中孵育18-20小时。
- 将释放的甘油在60°C的烤箱中干燥2.5-3.0小时。
- 将释放的甘油保存在-80°C，直到进一步测量。
注： 此步骤至关重要。甘油释放的关键是提高PNGase F酶的活性，以最大限度地提高其效率。
3. 甘油标签和纯化
- 用0.70毫克2-AB、10.50μL的醋酸、6毫克氰氨基氢化钠（NaBH3CN）和24.50μL的二甲基硫酸盐（DMSO）（总体积=35μL）制备2-氨基苯甲酰（2-AB）标记试剂。然后，按顺序将醋酸、2-AB 和 NaBH3CN 加入 DMSO。
- 使用 35 μL 的 2-AB 标记试剂标记甘油，将标记的甘油转移到振荡器 5 分钟，在 65°C 下转移到烤箱 3 小时，然后转移到 RT 30 分钟。
注： 必须在保护光线的同时执行整个甘油标记步骤。 - 用 200 μL 70% 乙醇、200 μL 超纯水和 200 μL 的 96% 醋酸酯 （4 °C） 预处理 0.2 μm GHP 滤板，然后使用真空泵清除废物。
- 2-AB 标记甘油的纯化
- 将700 μL的100%醋酸酯加入2-AB标记的甘油中，并转移到摇动培养箱中5分钟。
- 在 134 x g下离心 5 分钟 （4 °C）。
- 将样品转移到 0.2 μm GHP 滤板 2 分钟，并使用真空泵去除滤液（流动液体）。
- 用 200 μL 的 96% 醋酸酯 （4 °C） 清洗 2-AB 标记的甘油，并使用真空泵 5x-6x 去除滤液（流动液体）。
- Elute 2-AB 标记甘油，含有 100 μL 的超纯水 3 倍。
- 将标有 2-AB 的甘油转移到烤箱中，在 60°C 干燥 3.5 小时。
- 将标记的N-甘油保存在 -80°C，直到进一步测量。
4. 亲水相互作用色谱与甘油分析
- UPLC仪器的调节和移动阶段的准备
- 制备移动相，包括溶剂A：100 mM甲铵（pH = 4.4），溶剂B：100%醋酸酯，溶剂C：90%超纯水（10%甲醇）和溶剂D：50%甲醇（超纯水）。
- 打开软件以控制移动阶段。
- 以 0.2 mL/min（50% 溶剂 B 和 50% 溶剂 C）的流量清洗 UPLC 仪器，保持 30 分钟，然后在 0.2 mL/min（25% 溶剂 A 和 75% 溶剂 B）的流速下保持 20 分钟，然后保持 0.4 mL/min 平衡的流速。
- 以 2：1 的比例 （v/v） 将标记的N-甘油与 25 μL 的 100% 醋酸酯和超纯水混合物溶解。然后，在134 μ g下离心5分钟（4°C），并将10μL的标记N-甘油加载到UPLC仪器中。
- 以0.4 mL/min的流速分离标记的N-甘油，线性梯度为75%至62%醋酸酯，25分钟。然后，在60°C的UPLC上执行由dextran校准梯/糖肽柱进行分析运行（在这里，样品在注射前保持在4°C）。
- 在激励和发射波长度分别为 330 nm 和 420 nm 时检测N-甘油荧光。
- 根据峰值位置和保留时间集成甘油。
- 计算每个甘油峰 （GP）的相对值/ 所有甘油峰 （GP） （百分比， %具体如下：GP1：GP1/GP=100，GP2：GP2/GP=100，GP3：GP3/GP=100，等等。
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Representative Results
如图1所示，IgG N-甘油根据峰值位置和保留时间分析为24初始IgG甘油峰（GP）。根据先前的研究（表1）15，N-甘油结构可通过质谱检测获得。 为了确保结果具有可比性，应用了总面积正常化，其中每个峰值中的甘油量以总综合面积的百分比表示。
为了评估该方法的可重复性和稳定性，对标准样品进行了六次并行测试。如表2所示，24名全科医生的变异系数（CV）在1.84%-16.73%之间，15（62.50%）之间。其中低于10%。比例相对较小的GP（±1.16%）显示高测量误差（超过 CV 的 10%）。此外，76个个体的IgG N-甘油谱（图2）表明GP的位置稳定，GP形状相似，样品的集成保持相同的间隔。上述结果表明，该方法稳定且可重复。
如表3所示，另外36种衍生特征描述了糖化、分生化、二分体和核心富基化的相对丰度，由其余24个直接测量的甘油计算。例如，G2/G0 （GP12/GP2） 反映了无核糖化和二元组化的节化水平（二/a-）。G2/G1（GP14/[GP8 + GP9]）反映了核心富基化和无二分格子的节化（二/单-）水平。最后，G1/G0（[GP10 + GP11]/GP6）反映了具有核心富糖化和二分体GlcNAc的节化（单/a-）水平。这些衍生甘油的计算遵循一个原理，只看到一个糖基化特性的变化。
图1：一个人的UPLC色谱图。IgG N-甘油根据峰值位置和保留时间分析为24初始IgG甘油峰（GP）。GP8 表示 GP 8a 和 GP 8b 的总和。GP16 代表 GP 16a 和 GP 16b 的总和。表1和表2显示了每个色谱峰的甘油结构以及各结构的平均百分比。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：76人的UPLC色谱图。IgG N-甘油型材由76个个体组合而成，以证明该方法的可重复性和稳定性。请点击此处查看此图的较大版本。
表1：24个初始IgG甘油的结构。GP：甘油峰;F： 富科斯;答：连接到核心序列的天线数量（存在两个NAceltlucosamine（GlcNAc）和三个曼诺斯残留物）;B： 将GlcNac一分为二;G： 加乳酸酶;S： 西辛酸。结构方案定义如下：蓝色正方形：GlcNac;绿圈：曼诺塞;红三角形：芯烟/天线熔体;黄圆： 半乳酸;紫色红红：西化酸。
| 甘油峰 | 均值 （SD） | 简历 （%） | 甘油峰 | 均值 （SD） | 简历 （%） |
| GP1 | 0.23 (0.017) | 7.28 | GP13 | 0.50 (0.043) | 8.64 |
| GP2 | 0.24 (0.034) | 13.97 | GP14 | 19.54 (0.36) | 1.84 |
| GP3 | 0.96 (0.16) | 16.73 | GP15 | 1.16 (0.14) | 11.63 |
| GP4 | 19.52 (0.58) | 2.98 | GP16 | 2.79 (0.19) | 6.93 |
| GP5 | 0.17 (0.024) | 13.86 | GP17 | 1.29 (0.13) | 9.78 |
| GP6 | 3.19 (0.26) | 8.22 | GP18 | 13.16 (0.51) | 3.85 |
| GP7 | 0.29 (0.033) | 11.51 | GP19 | 2.12 (0.21) | 9.76 |
| GP8 | 16.45 (0.62) | 3.77 | GP20 | 0.12 (0.018) | 14.91 |
| GP9 | 8.97 (0.52) | 5.74 | GP21 | 1.05 (0.17) | 16.09 |
| GP10 | 2.97 (0.22) | 7.34 | GP22 | 0.18 (0.025) | 14.16 |
| GP11 | 0.30 (0.041) | 13.82 | GP23 | 2.14 (0.14) | 6.45 |
| GP12 | 1.27 (0.026) | 2.08 | GP24 | 1.43 (0.13) | 9.12 |
表 2：方法的精度。标准样品并行测试六次，以评估该方法的可重复性和稳定性。CV：变异系数;GP： 甘油峰;SD：标准偏差。
| 衍生甘油 | 公式 | 衍生甘油 | 公式 |
| 加拉茨西化 | 富基化 | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | （GP8= GP9）/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/（GP8+ GP9） | GP15/GP13 | ||
| GP15/（GP10+ GP11） | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| （GP8= GP9）/GP4 | GP24/GP22 | ||
| （GP10+ GP11）/GP6 | |||
| 西亚利西 | 分割GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | （GP10=GP11）/（GP8=GP9） | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
表3：派生甘油的计算。GP：甘油峰;F： 富科斯;B： 将GlcNac一分为二;G： 加乳酸酶;S： 西辛酸。
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Discussion
UPLC作为相对定量分析方法5，15。结果表明，UPLC是一种稳定的检测技术，具有良好的可重复性和相对定量精度。每个峰值中的甘油量以 UPLC（相对值）的总集成面积的百分比表示。相对定量提高了测试样品的可比性。此外，96孔蛋白G板用于一次用96个样品来纯化IgG，用于高通量检测。蛋白质G结合IgG的能力大于蛋白质A的能力，如先前研究15、16所述。
此外，IgG N-甘油的结构也明显分离。衍生的IgG甘油描述了糖化、分氨酸、二分体GlcNAc和核心富糖化的水平，这些水平由初始IgG N-甘油计算。在以前的研究中，一些衍生的甘油 （FBn， FBG0n / G0n， FBn / Fntotal，Bn / （Fn = FBn）， FBG2n / FG2n， FG2n / （BG2n = FBG2n），BG2n / （FG2n = FBG2n）可以反映多个糖基水平的变化，但没有反映
最近，一项大规模研究表明，IgG节化（称为Gal-比）可以作为多种癌症类型17癌症筛查的有前途的生物标志物。IgG 乳糖化的分布是通过根据公式（G0/[G0= G1 = G2 x 2]）计算单糖酸化 （G1） 和地糖酸化 （G2） N-甘油的相对强度来测量的。Gal-比反映了与核心富基化和无一分为二GlcNAc的乳糖化水平。因此，多个初始IgG N-甘油与衍生的甘油结合，代表特定糖基化特性的水平。衍生甘油的计算遵循一个原理，该原理只探讨一个糖基化特性仅在其他糖基化特性上固定的变化。
在本协议中，pH对于保持IgG和甘油结构的稳定性，特别是对于稳定终端分光非常重要。因此，必须严格控制溶液的pH值，并且必须恢复暴露于IgG的溶液的pH值，并将甘油保持在中性pH水平。此外，甘油释放步骤在此协议中至关重要。甘油释放的关键是提高PNGase F酶的活性，以最大限度地提高其效率。例如，发现18-20小时是PNGaseF消化的最佳选择。这一步骤需要充分作出反应。
此技术有一些限制。使用的方法无法区分从 IgG 的 Fab 和 Fc 部分释放的甘油。众所周知，来自Fab和Fc的甘油不同。随着糖原体学的发展，检测技术可以测量IgG结合N-甘油的水平，探索IgG N-甘油和N-糖基化在疾病中的作用。设备成本相对较低;然而，每个样品的成本相当高。
总之，该协议引入了UPLC，以便可以广泛使用。在投入大量时间和资源进行大规模研究之前，需要对分析方法进行全面评估并实现标准化。随着UPLC的应用越来越广泛，IgG N-甘油和N-糖基化对某些疾病的影响可以更准确地确定，并且糖基化生物标志物可用于临床应用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（81673247和81872682）和澳大利亚-中国合作赠款（NH&MRC - APP1112767-NSFC 8156128020）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
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