Summary
Immunglobulin G (IgG) N-glycan er karakteriseret ved anvendelse af hydrofile interaktions KROMATOGRAFI uplc. Desuden er strukturen af IgG N-glycan klart adskilt. Præsenteret her er en introduktion til denne eksperimentelle metode, så det kan være meget udbredt i forskning indstillinger.
Abstract
Glycomics er en ny subspecialitet i omik system Research, der giver betydelige muligheder for at opdage næste generations biomarkører for sygdoms følsomhed, Drug Target Discovery, og Precision Medicine. Alternative IgG N-glycaner er blevet rapporteret i flere almindeligt forekommende kroniske sygdomme og foreslog at have et stort potentiale i kliniske anvendelser (dvs. biomarkører til diagnosticering og forudsigelse af sygdomme). IgG N-glycans er bredt karakteriseret ved hjælp af metoden til hydrofile interaktion kromatografi (hilic) ultra-performance væskekromatografi (uplc). UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og høj relativ kvantitativ nøjagtighed. Desuden er strukturen af IgG N-Les klart adskilt, og Les sammensætning og relativ overflod i plasma er karakteriseret.
Introduction
N-glykosylering af humane proteiner er en fælles og vigtig post-translationel modifikation1 og kan hjælpe med at forudsige forekomsten og udviklingen af sygdomme relativt nøjagtigt. På grund af kompleksiteten af sin struktur, forventes det, at der er mere end 5.000 Les strukturer, giver stort potentiale som diagnostiske og forudsigende biomarkører for sygdomme2. N-glycans knyttet til immunglobulin G (IgG) har vist sig at være afgørende for igg's funktion, og IgG N-glykosylation deltager i balancen mellem Pro-og anti-inflammatoriske systemer3. Differential IgG N-glykosylering er involveret i sygdomsudvikling og progression, der repræsenterer både en disposition og funktionelle mekanisme involveret i sygdoms patologi. Den inflammatoriske rolle IgG N-glykosylation har været forbundet med aldring, inflammatoriske sygdomme, autoimmune sygdomme, og kræft4.
Med udviklingen af detekterings teknologi, er følgende metoder mest udbredte i høj gennemløb Glycomics: hydrofile Interaction kromatografi (HILIC) ultra-performance væskekromatografi med fluorescens detektion (UPLC-FLR), multiplex kapillar gel elektroforese med Laser induceret fluorescens detektion (xCGE-LIF), matrix-assisteret Laser Desorption/ionisering tid-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS), og væskekromatografi elektro spray massespektrometri (LC-ESI-MS) . Disse metoder har overvundet tidligere mangler af lav flux, ustabile resultater, og dårlig følsomhed specificitet5,6.
Uplc er almindeligt anvendt til at udforske sammenslutningen mellem IgG N-glykosylering og visse sygdomme (dvs. aldrende7, fedme8, dyslipidæmi9, type II diabetes10, hypertension11, iskæmisk slagtilfælde12, og Parkinsons sygdom13). Sammenlignet med de andre tre ovennævnte metoder har uplc følgende fordele:5,14. For det første giver det en relativ kvantitativ analysemetode, og den dataanalyse, der involverer total område normalisering forbedrer sammenligneligheden af hver prøve. For det andet er udgifterne til udstyr og nødvendig ekspertise relativt lave, hvilket gør det lettere at implementere og omdanne glykosylations biomarkører til kliniske anvendelser. Præsenteret her er en introduktion til UPLC, så det kan være mere almindeligt anvendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de emner, der indgår i protokollen er blevet godkendt af den etiske komité af Capital Medical University, Beijing, Kina12. Et skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra hvert emne i undersøgelsens begyndelse.
1. IgG isolation
- Klargør kemikalierne, herunder bindings buffer (fosfat bufferet saltvand, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserende buffer: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), eluent: 0,1 M myresyre (pH = 2,5), neutraliserende opløsning til eluent: 1 M ammoniumbicarbonat, lagret buffer: 20% ethanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), rense opløsning til protein G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-OL.
Bemærk: pH-niveauet er kritisk i denne protokol. Opløsningen af IgG kræver en meget lav pH-værdi, og der er risiko for tab af sialsyrer på grund af syrehydrolyse. Derfor opstår eluering inden for få sekunder, og pH-værdien genoprettes hurtigt til neutralitet, hvilket bevarer Igg's og sialsyrens integritet. - Prøverne fremstilles: tø den frosne plasmaprøve centrifugeres derefter ved 80 x g i 10 minutter og efterlades protein g monolitisk plade og ovennævnte kemikalier i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Overfør en 100 μL prøve (som kan bruges til at detektere 2x for at forhindre den første fejl) i en 2 mL opsamlings plade (her er i alt seks standard prøver, en kontrolprøve [ultra-rent vand], og 89 plasmaprøver blev designet til 96 brønd plader og tilfældigt tildelte til pladen).
- Prøverne fortyndes med 1x PBS med 1:7 (v/v).
- Rengør en 0,45 μm hydrofile polypropylen (GHP) filter plade med 200 μL ultra-rent vand (Gentag 2x).
- De fortyndede prøver overføres til filterpladen, og prøverne filtreres ind i opsamlings pladen ved hjælp af en vakuumpumpe (kontrol vakuum tryk ved 266.6-399.9 PA).
- Fremstilling af proteinet G monolitiske plader
- Kassér lager bufferen.
- De monolitiske plader rengøres med 2 mL ultra-rent vand, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M myresyre, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (sekventielt), og fjern flydende væske ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Overfør de filtrerede prøver til proteinet G monolitisk plade til IgG binding og rengøring, og rengør derefter de monolitiske plader med 2 mL 1x PBS (Gentag rengøringen 2x).
- Elute IgG med 1 mL 0,1 M myresyre og Filtrer prøverne ind i opsamlings pladen ved hjælp af vakuumpumpe, og tilsæt derefter 170 μL 1 M ammoniumbicarbonat til opsamlings pladen.
- Påvisning af IgG-koncentration ved hjælp af et absorptions Spektrofotometer (optimal bølgelængde = 280 nm).
- Åbn softwaren, og Vælg tilstanden protein-CY3.
- Tegn 2 μL ultra-rent vand og læg det ind i skærmen, og klik derefter på blank i softwaren for at rydde skærmen (Gentag 1x).
- Tegn 2 μL ultra-rent vand og læg det ind på skærmen, og klik derefter på Sample i softwaren for at detektere det ultra-rene vand.
- Tegn 2 μL IgG-prøve, og læg den i skærmen, og klik derefter på eksempel i softwaren for at registrere eksemplet.
- Tegn 2 μL ultra-rent vand og læg det ind i skærmen, og klik derefter på blank i softwaren for at rydde skærmen.
- Luk softwaren.
Bemærk: formlen til beregning af IgG-koncentrationen er som følger:
CIgG = absorbans x ekstinktionskoefficient (13,7) x 1.000 μg/ml
- Den ekstraherede IgG tørres i en ovn ved 60 °C, og den ekstraherede IgG bevares (300 μL ekstraheret IgG i 4 timer).
- Fjern 300 μL ekstraheret IgG, hvis koncentrationen er større end 1.000 μg/mL.
- Fjern 350 μL ekstraheret IgG, hvis koncentrationen er mellem 500-1000 μg/mL.
- Fjern 400 μL ekstraheret IgG, hvis koncentrationen er mellem 200-500 μg/mL.
- Fjern 600 μL ekstraheret IgG, hvis koncentrationen er mindre end 200 μg/mL.
Bemærk: koncentrationen af IgG bør fortrinsvis > 200 μg/mL til efterfølgende påvisning. Den gennemsnitlige mængde IgG bør fortrinsvis > 1200 μg, som kan testes 2x, hvis den første test mislykkes.
- Rensning af protein G monolitisk plade til genbrug
- Pladen vaskes med 2 mL ultra-rent vand, 1 mL 0,1 M NaOH (til fjernelse af udfældede proteiner), 4 mL ultra-rent vand og 4 mL 1x PBS (sekventielt), og derefter fjernes strømmende væske ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Pladen vaskes med 2 mL ultra-rent vand, 2 mL 30% propan-2-OL (til fjernelse af bundne hydrofobe proteiner), 2 mL ultra-rent vand og 4 mL 1x PBS (sekventielt), og derefter fjernes strømmende væske ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Pladen vaskes med 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) og tilsættes 1 mL buffer (20% ethanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) til pladen, hvorefter pladen efterlades ved 4 °C.
2. frigivelse af glycan
- Forbered den tørrede IgG og opbevar kemikalierne, herunder 1,33% SDS, 4% Igepal (opbevares væk fra lys) og 5x PBS ved RT.
- Forbered PNGase F enzym ved fortynding af 250 U enzym med 250 μL ultra-rent vand.
- Denaturering af IgG
- Tilsæt 30 μL 1,33% SDS og bland ved vortexing, overføre prøven til en 65 °C ovn i 10 min, derefter fjerne det fra ovnen og lad hvile i 15 min.
- Der tilsættes 10 μL 4% Igepal og placeres på ryste inkubator i 5 min.
- Fjernelse og frigivelse af glykaner
- Tilsæt 20 μL 5x PBS og 30-35 μL 0,1 mol/L NaOH for at regulere en pH-værdi på 8,0, og bland med vortexing. Tilsæt 4 μL PNGase F-enzym, og bland med vortexing. Derefter inkubere for 18-20 h i et 37 °C vandbad.
- Sæt de frigivne glycaner til at tørre i en ovn ved 60 °C for 2.5-3,0 h.
- Gem de frigivne glycaner ved-80 °C indtil yderligere måling.
Bemærk: dette trin er kritisk. Nøglen til Les frigivelse er at forbedre aktiviteten af pngase F enzym for at maksimere sin effektivitet.
3. glycan mærkning og rensning
- 2-aminobenzamid (2-AB)-mærknings reagens forberedes med 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL eddikesyre, 6 mg natriumcyanoborohydrid (NaBH3cn) og 24,50 μl dimethylsulfoxid (DMSO) (total volumen = 35 μl). Derefter tilsættes eddikesyre, 2-AB og NaBH3cn i DMSO i rækkefølge.
- Mærk glycanerne ved hjælp af 35 μL 2-AB mærknings reagens, Overfør de mærkede glycaner til oscillatoren i 5 minutter, Overfør til ovnen i 3 timer ved 65 °C, og overfør derefter til RT i 30 minutter.
Bemærk: hele Les-mærknings trinnet skal udføres, mens det beskyttes mod lys. - Forbehandl en 0,2 μm GHP-filter plade med 200 μL 70% ethanol, 200 μL ultra-rent vand og 200 μL 96% acetonitril (4 °C), og fjern derefter affaldet ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Rensning af 2-AB mærket Les
- Tilsæt 700 μl 100% acetonitril til 2-AB mærket Les og Overfør til en ryste inkubator i 5 min.
- Centrifugeres ved 134 x g i 5 min (4 °c).
- Prøven overføres til en 0,2 μm GHP-filter plade i 2 min., og filtratet (flydende væske) fjernes ved hjælp af en vakuumpumpe.
- Vask 2-AB mærket Les med 200 μl 96% acetonitril (4 °c), og fjern filtratet (flydende væske) ved hjælp af en vakuumpumpe 5x-6x.
- Elute 2-AB mærket Les med 100 μl ultra-Pure vand 3x.
- Overfør 2-AB-mærket Les til en ovn for at tørre ved 60 °c i 3,5 h.
- Gem de mærkede N-glycans ved-80 °c indtil yderligere måling.
4. hydrophilic interaktions kromatografi og analyse af glycaner
- Konditionering af UPLC-instrumenter og forberedelse af mobile faser
- Forbered mobile faser, herunder opløsningsmiddel A: 100 mM ammonium format (pH = 4,4), solvens B: 100% acetonitril, solvens C: 90% ultra-rent vand (10% methanol) og solvent D: 50% methanol (ultra-rent vand).
- Åbn softwaren for at styre de mobile faser.
- Vask UPLC instrumenter ved strømningshastighed på 0,2 mL/min (50% solvens B og 50% solvens C) afbalancering i 30 min, derefter med en strømningshastighed på 0,2 mL/min (25% solvens A og 75% solvens B) afbalancering i 20 min, derefter en strømningshastighed på 0,4 mL/min afbalancering.
- De mærkede N-glycaner opløses med 25 μl af en blanding af 100% acetonitril og ultra-rent vand ved en 2:1 ratio (v/v). Derefter centrifugeres ved 134 × g i 5 min (4 °c) og indlà ¦ ses 10 μl af de mærkede N-glycaner i uplc-instrumenterne.
- Adskil de mærkede N-glycaner ved strømningshastigheden på 0,4 ml/min med en lineær gradient på 75% til 62% acetonitril i 25 min. Udfør derefter en analytisk kørsel af dextran kalibrerings stigen/glycopeptidsøjlen på en UPLC ved 60 °C (her blev prøverne opbevaret ved 4 °C før injektionen).
- Detekterer N-glycan fluorescens ved excitation og emissions bølgelængder på henholdsvis 330 nm og 420 nm.
- Integrer glycanerne baseret på Peak position og retentionstiden.
- Beregn den relative værdi af hver glycan Peak (GP)/alle glycan toppe (GPs) (procent,%) som følger: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1blev IgG N-glycans analyseret i 24 indledende IgG Les toppe (GPS) baseret på Peak position og retentionstiden. N-glycan-strukturerne er tilgængelige gennem massespektrometri-detektion i henhold til en tidligere undersøgelse (tabel 1)15. For at sikre, at resultaterne var sammenlignelige, blev det samlede areal normalisering anvendt, hvor mængden af glycaner i hver spids blev udtrykt som en procentdel af det samlede integrerede areal.
For at vurdere metodens repeterbarhed og stabilitet blev standardprøven testet parallelt seks gange. Som vist i tabel 2varierede variationskoefficienten (CV) på 24 GPS fra 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) var under 10%. GPs med relativt små proportioner (≤ 1,16%) viste høje målefejl (mere end 10% af CV'ET). Desuden indikerede IgG N-glycan-profilerne fra 76 individer (figur 2), at GP-positionen var stabil, at form af GP var ens, og at integrationen af prøverne opretholdt de samme intervaller. Ovenstående resultater indikerer, at metoden er stabil og kan gentages.
Som vist i tabel 3blev yderligere 36 afledte træk, der beskriver de relative mængder af galactosylation, sialylering, Bisficerende GlcNAc og kerne fucosylation, beregnet af de resterende 24 direkte målte glycaner. For eksempel afspejlede G2/G0 (GP12/GP2) niveauet af galactosylation (di-/a-) uden kerne fucosylation og bisficerende GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) afspejlede niveauet af galactosylation (di-/mono-) med kerne fucosylation og uden at bistere GlcNAc. Endelig afspejlede G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) niveauet af galactosylation (mono-/a-) med kerne fucosylation og bisficerende GlcNAc. Disse beregninger af afledte glycaner følger et princip, for at se ændringen af kun én glykosylering træk.
Figur 1: UPLC-kromatogram af en enkelt person. IgG N-glycans blev analyseret i 24 indledende IgG Les toppe (GPS) baseret på Peak position og retentionstiden. GP8 repræsenterer summen af GP 8a og GP 8b. GP16 repræsenterer summen af GP 16a og GP 16b. Glykæernes struktur i hver kromatografisk spids og den gennemsnitlige procentdel af de enkelte strukturer er vist i tabel 1 og tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: UPLC-kromatogram af 76 individer. IgG N-glycan-profilerne blev kombineret fra 76 personer for at påvise metodens repeterbarhed og stabilitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: strukturen af de 24 oprindelige IgG glycaner. GP: Les Peak; F: fucose; A: antallet af antenne er fastgjort til kernen sekvens (bestående af to Nacetylglucosamin (GlcNAc) og tre mannose rester); B: bistering af GlcNac; G: galactose; S: sialsyre. Strukturforanstaltninger defineres således: blå firkant: GlcNac; grøn cirkel: mannose; rød trekant: Core fucose/antennary fucose; gul cirkel: galactose; lilla rhomb: sialsyre.
| Glycan Peak | Gennemsnit (SD) | CV (%) | Glycan Peak | Gennemsnit (SD) | CV (%) |
| GP1 | 0,23 (0,017) | 7,28 | GP13 | 0,50 (0,043) | 8,64 |
| GP2 | 0,24 (0,034) | 13,97 | GP14 | 19,54 (0,36) | 1,84 |
| GP3 | 0,96 (0,16) | 16,73 | GP15 | 1,16 (0,14) | 11,63 |
| GP4 | 19,52 (0,58) | 2,98 | GP16 | 2,79 (0,19) | 6,93 |
| GP5 | 0,17 (0,024) | 13,86 | GP17 | 1,29 (0,13) | 9,78 |
| GP6 | 3,19 (0,26) | 8,22 | GP18 | 13,16 (0,51) | 3,85 |
| GP7 | 0,29 (0,033) | 11,51 | GP19 | 2,12 (0,21) | 9,76 |
| GP8 | 16,45 (0,62) | 3,77 | GP20 | 0,12 (0,018) | 14,91 |
| GP9 | 8,97 (0,52) | 5,74 | GP21 | 1,05 (0,17) | 16,09 |
| GP10 | 2,97 (0,22) | 7,34 | GP22 | 0,18 (0,025) | 14,16 |
| GP11 | 0,30 (0,041) | 13,82 | GP23 | 2,14 (0,14) | 6,45 |
| GP12 | 1,27 (0,026) | 2,08 | GP24 | 1,43 (0,13) | 9,12 |
Tabel 2: Metodens præcision. Standardprøven testes parallelt seks gange for at vurdere metodens repeterbarhed og stabilitet. CV: variationskoefficient; GP: glycan Peak; SD: standard afvigelse.
| Afledte glycaner | Formler | Afledte glycaner | Formler |
| Galactosylation | Fucosylation | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8 + GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8 + GP9) | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10 + GP11) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8 + GP9)/GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10 + GP11)/GP6 | |||
| Sialylering | Bisficerende GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9) | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
Tabel 3: beregning af de afledte glycaner. GP: Les Peak; F: fucose; B: bistering af GlcNac; G: galactose; S: sialsyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uplc fungerer som en relativ kvantitativ analysemetode5,15. Resultaterne indikerer, at UPLC er en stabil detekterings teknologi med god reproducerbarhed og relativ kvantitativ nøjagtighed. Mængden af glycaner i hver spids udtrykkes som en procentdel af det samlede integrerede område ved hjælp af UPLC, som er den relative værdi. Den relative kvantificering forbedrer sammenligneligheden af testprøverne. Derudover bruges 96 brønd protein G plader til at rense IgG med 96 prøver på én gang for høj gennemløbs detektering. Protein g's evne til at binde IgG er større end protein A, som beskrevet i tidligere undersøgelser15,16.
Desuden er strukturerne i IgG N-glycan tydeligt adskilte. De afledte IgG glycaner beskrive niveauet af galactosylation, sialylering, bisficerende GlcNAc, og kerne fucosylation, som beregnes af de oprindelige IgG N-glykaner. I en tidligere undersøgelse, nogle afledte glykaner (FBn, FBG0n /G0n, FBn /Fbånd, Bn /(Fn + FBn), FBG2n /FG2n, FG2 n/( BG2n + FBG2n),BG2n /(FG2n + FBG2n)) kunne afspejle ændringen i flere glykosylations niveauer, men afspejlede ikke niveauet af specifik glykosylation15.
For nylig, en storstilet undersøgelse viste, at IgG galactosylation (benævnt gal-ratio) kan tjene som en lovende biomarkør for kræftscreening i flere kræfttyper17. Fordelingen af IgG galactosylation måles ved at beregne de relative intensiteter af agalactosyleret (G0) vs. monogalactosylated (G1) og Digalactosylated (G2) N-glycans i henhold til formlen (G0/[G1 + G2 x 2]). Gal-forholdet afspejler niveauet af galactosylation med kerne fucosylation og uden at bisficerende GlcNAc. Derfor blev flere initiale IgG-glykæer kombineret med en afledt glycan, der repræsenterede niveauet af et specifikt glykosylations træk. Beregningerne af afledte glycaner følger et princip, der udforsker ændringerne i kun én glykosylation træk fast over andre glykosylering træk.
I denne protokol er pH vigtig for at opretholde stabiliteten af IgG-og Les-strukturer, især til stabilisering af terminalens sialylering. Derfor skal pH-værdien af opløsningen være strengt kontrolleret, og ph af opløsningen eksponeret for IgG skal genoprettes samt glykaner holdes på et neutralt pH-niveau. Desuden er Les-udgivelses trinnet kritisk i denne protokol. Nøglen til Les frigivelse er at forbedre aktiviteten af pngase F enzym for at maksimere sin effektivitet. For eksempel blev det konstateret, at 18-20 h er optimal for PNGaseF fordøjelse. Dette skridt skal omsættes fuldt ud.
Der er nogle begrænsninger af denne teknik. Den anvendte metode kan ikke differentiere glycaner frigivet fra fab og FC dele af IgG. Glycans fra fab og FC er kendt for at være anderledes. Med udviklingen i glykoproteomics, kan detekterings teknikker måle niveauerne af IgG kombinere N-glycans at undersøge rollen af IgG N-glycans og N-glykosylering i sygdomme. Omkostningerne til udstyr er relativt lav; prisen pr. prøve er dog temmelig høj.
Sammenfattende introducerer denne protokol UPLC, så den kan anvendes i vid udstrækning. Det er nødvendigt med en omfattende vurdering og standardisering af analysemetoderne, før der investeres betydelige mængder tid og ressourcer i omfattende undersøgelser. Som uplc bliver mere udbredt, virkningerne af IgG n-glycans og N-glykosylering på visse sygdomme kan være mere præcist bestemmes, og glycosylering biomarkører kan anvendes til kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) og australsk-Kina Collaborative tilskud (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
