Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד

doi: 10.3791/60104 Published: January 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

אימונוגלובולין G (IgG) N-גליקן מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור. המוצג כאן הוא מבוא לשיטה ניסיונית זו, כך שניתן להשתמש בה באופן נרחב בהגדרות מחקר.

Abstract

גלילקומיקס הוא התמחות משנה חדשה ב-omics מחקר מערכת המציעה פוטנציאל משמעותי בגילוי בסמנים הדור הבא עבור הרגישות למחלות, גילוי התרופה היעד, ואת התרופה דיוק. אלטרנטיבי IgG N-גליקנים דווחו במספר מחלות כרוניות נפוצות, הציע פוטנציאל גדול ביישומים קליניים (כלומר, ביוארקרס לאבחון וחיזוי של מחלות). IgG N-גליקנים מאופיינים באופן נרחב באמצעות שיטה של אינטראקציה הידרופיפילית (hilic) כרומטוגרפית נוזלית במיוחד. היחידה היא טכנולוגיית גילוי יציבה עם שגיאות מידע ודיוק כמותי קרוב יחסית. בנוסף, המבנה של IgG N-גליקן מופרד בבירור, וניתן לאפיין את ההלחנה והשפע היחסי בפלזמה.

Introduction

N-הגליקוזילציה של חלבונים אנושיים הוא שינוי שכיח וחיוני לאחר השינוי1 ועשוי לסייע לחזות את התרחשות ופיתוח של מחלות באופן יחסי יחסית. בשל המורכבות של המבנה שלה, הוא צפוי כי יש יותר מ 5,000 מבנים גליקן, מתן פוטנציאל גדול כמו ביואריטים אבחון חזוי עבור מחלות2. N-גליקנים המחוברים למערכת החיסונית (igg) הוכחו כחיוניים לתפקוד igg, ו-Igg N-הגליסילציה משתתפת באיזון בין המערכות הפרו-דלקתיות3. IgG N-גליסיציה דיפרנציאלית מעורבת בפיתוח מחלות והתקדמות, המייצגים הן מנגנון נטייה ופונקציונלי המעורבים בפתולוגיה של מחלות. התפקיד הדלקתי של IgG N-הגליסיציה נקשר עם הזדקנות, מחלות דלקתיות, מחלות אוטואימוניות, סרטן4.

עם פיתוח של טכנולוגיית האיתור, השיטות הבאות נמצאות בשימוש נרחב ביותר גליקומיס תפוקה גבוהה: הידרופיפילית אינטראקציה כרומטוגרפיה (HILIC) כרומטוגרפיה נוזלית מאוד ביצועים עם גילוי של קרינה פלואורסצנטית (הייטק-FLR), אלקטרופורזה במגה-קרן עם ג'ל לייזר לגילוי קרינה בלייזר (xCGE-אבל), מטריקס בסיוע לייזר בעזרת מטריצות של זמן הטיסה המסה ספקטרומטריה (מאלדי-תוף-MS), וכרומטוגרפיה נוזלית ממסת המסה (LC-ESI-MS) . שיטות אלה התגברו על חסרונות קודמים של שטף נמוך, תוצאות לא יציבות, ורגישות ירודה ספציפיות5,6.

האגודה משמשת רבות לחקר הקשר בין igg N-הגליקוציה ומחלות מסוימות (כלומר, הזדקנות7, השמנה8, דיסליפידמיה9, סוכרת type10, יתר לחץ דם11, איסכמי שבץ12, פרקינסון מחלה13). בהשוואה לשלושת השיטות הנ ל, היתרונות הבאים הם5,14. ראשית, הוא מספק שיטת ניתוח כמותי יחסי, וניתוח הנתונים הכרוך בנרמול השטח הכולל משפר את יכולת ההשוואה של כל דוגמה. שנית, עלות הציוד והמומחיות הנדרשת נמוכה יחסית, מה שמקל על היישום וטרנספורמציה של ביוגליציה ליישומים קליניים. המוצג כאן הוא מבוא ל-, כדי שניתן יהיה להשתמש בו באופן נרחב יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנושאים הכלולים בפרוטוקול אושרו על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית קפיטל, בייג, סין12. הסכמה מושכלת בכתב הושגה מכל נושא בתחילת המחקר.

1. בידוד IgG

  1. הכן את הכימיקלים כולל מאגר מחייב (מתמיסת מלח מאוחסן באגירה, PBS): 1x pbs (ph = 7.4), לנטרל מאגר: 10x pbs (ph = 6.6-6.8), הללויה: 0.1 m החומצה פורמית (ph = 2.5), נטרול פתרון להתחמק: 1 M אמוניום ביקרבונט, מאגר מאוחסן: 20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל (pH = 7.4), ניקוי פתרון עבור חלבון G: 0.1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
    הערה: רמת ה-pH היא קריטית בפרוטוקול זה. הנשירה של IgG דורש pH נמוך מאוד, ויש סיכון של אובדן של חומצות סיליות בשל הידרוליזה חומצה. לכן, הימנעות מתרחשת בתוך שניות, ו-pH שוחזר במהירות לנייטרליות, שמירה על שלמות IgG ו חומצות הסילית.
  2. להכין את הדגימות: להפשיר את מדגם פלזמה קפוא ואז צנטריפוגה ב 80 x g עבור 10 דקות, ולהשאיר את הצלחת g מונוליתית חלבון וכימיקלים הנ ל 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. העבר מדגם μL 100 (שניתן להשתמש בו כדי לזהות את 2x כדי למנוע את הכשל הראשון) לתוך צלחת אוסף של 2 מ"ל (כאן, סך של שישה דוגמאות סטנדרטיות, דגימת בקרה אחת [מים אולטרה טהורים], ו 89 דגימות פלזמה תוכננו עבור 96 היטב לוחיות והוקצו באופן אקראי לצלחת).
  4. לדלל את הדגימות עם 1x PBS ידי 1:7 (v/v).
  5. נקה 0.45 יקרומטר הידרופילי פוליפרופילן (ghp) מסנן צלחת עם 200 μl של מים אולטרה טהור (לחזור על 2x).
  6. להעביר את הדגימות מדולל לתוך לוחית הסינון ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האוסף באמצעות משאבת ואקום (בקרת לחץ ואקום ב-266.6-399.9 Pa).
  7. הכנת לוחות מונוליטיים של חלבון G
    1. מחק את מאגר האחסון.
    2. נקו את לוחות מונוליטיים עם 2 מ ל של מים אולטרה טהורים, 2 מ ל של 1x pbs, 1 מ ל של 0.1 M החומצה פורמית, 2 מ ל של 10x pbs, 2 מ ל של 1x pbs (ברציפות), ולהסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
  8. העבר את הדגימות מסוננים כדי חלבון G מונוליטי לוחית עבור כריכת IgG וניקוי, ואז לנקות את לוחות מונוליטיים עם 2 מ ל של 1x PBS (לחזור על ניקוי 2x).
  9. Elute igg עם 1 מ ל של 0.1 החומצה פורמית ולסנן את הדגימות לתוך צלחת האוסף על ידי משאבת ואקום, לאחר מכן להוסיף 170 μl של 1 M אמוניום ביקרבונט לתוך צלחת האוסף.
  10. זיהוי הריכוז IgG באמצעות ספקטרוסקופיה ספיגת (אורך הגל האופטימלי = 280 nm).
    1. פתח את התוכנה ובחר במצב חלבון-CY3.
    2. לצייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על ריק בתוכנה כדי לנקות את המסך (לחזור על 1x).
    3. לצייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על לדוגמה בתוכנה כדי לזהות את המים אולטרה טהורים.
    4. לצייר 2 μL של המדגם IgG ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על לדוגמה בתוכנה כדי לזהות את המדגם.
    5. צייר 2 μL של מים אולטרה טהורים ולטעון אותו לתוך המסך, ולאחר מכן לחץ על ריק בתוכנה כדי לנקות את המסך.
    6. סגור את התוכנה.
      הערה: הנוסחה לחישוב ריכוז IgG היא כדלקמן:

      CIgg = מקדם הכחדה x (13.7) x 1,000 μg/mL
  11. לשים את IgG שחולצו להתייבש בתנור ב 60 ° צ' ולשמר את IgG המחולצים (300 μL שחולצו IgG עבור 4 h).
    1. הסר 300 μL של חילוץ IgG אם הריכוז גדול מ-1,000 μg/mL.
    2. הסר 350 μL של חילוץ IgG אם הריכוז הוא בין 500-1000 μg/mL.
    3. הסר 400 μL של חילוץ IgG אם הריכוז הוא בין 200-500 μg/mL.
    4. הסר 600 μL של חילוץ IgG אם הריכוז קטן מ 200 μg/mL.
      הערה: ריכוז IgG צריך להיות רצוי > 200 μg/mL לאיתור הבאים. הסכום הממוצע של IgG צריך להיות רצוי > 1200 μg, אשר ניתן נבדק 2x במקרה הבדיקה הראשונה נכשלת.
  12. ניקוי לוחית מונוליתית בחלבון G לשימוש חוזר
    1. שטוף את הצלחת עם 2 מ ל של מים אולטרה טהור, 1 מ ל 0.1 M NaOH (להסרת החלבונים של זירז), 4 מ ל של מים אולטרה טהור, ו 4 מ ל של 1x PBS (ברציפות), ואז להסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
    2. לשטוף את הצלחת עם 2 מ ל של מים אולטרה טהור, 2 מ ל 30% propan-2-ol (להסרת חלבונים הידרופובי מאוגד), 2 מ ל של מים אולטרה טהורים, ו 4 מ ל של 1x PBS (ברציפות), ואז להסיר נוזל זורם באמצעות משאבת ואקום.
    3. לשטוף את הצלחת עם 1 מ ל של מאגר (20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל) ולהוסיף 1 מ ל של מאגר (20% אתנול + 20 מ"מ טריס + 0.1 M הנאל) לצלחת, ואז לעזוב את הצלחת ב 4 ° c.

2. גליקן לשחרר

  1. הכן את IgG יבשים ולאחסן את הכימיקלים כולל 1.33% SDS, 4% Igepal (החנות הרחק מן האור), ו 5x PBS ב RT.
  2. הכנת האנזים PNGase F על ידי דילול 250 U אנזים עם 250 μL של מים אולטרה טהורים.
  3. דנטורציה של IgG
    1. הוסף 30 μL של 1.33% SDS ולערבב על ידי vortexing, להעביר את המדגם לתוך 65 תנור ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן להסיר אותו מהתנור ולתת לנוח 15 דקות.
    2. הוסף 10 μL של 4% Igepal ומניחים אותו על האינקובטור רועד עבור 5 דקות.
  4. הסרה ושחרור של גליקנים
    1. הוסף 20 μL של 5x PBS ו 30-35 μL של 0.1 מול/L NaOH כדי לווסת pH של 8.0, ולערבב על ידי vortexing. הוסף 4 μL של האנזים של PNGase F ומערבבים על ידי vortexing. לאחר מכן, מודטה עבור 18-20 h באמבט מים 37 ° c.
    2. מכניסים את הגליקנים המשוחררים לייבוש בתנור ב-60 ° c עבור 2.5-3.0 h.
    3. שמרו את הגליקנים המשוחררים ב-80 ° c עד למדידה נוספת.
      הערה: שלב זה הוא קריטי. המפתח כדי גליקן לשחרר הוא שיפור הפעילות של האנזים PNGase F כדי למקסם את היעילות שלה.

3. גליקן מתייג ומאפשר טיהור

  1. הכן את 2-האמינאמיד (2-AB) תיוג מגיב עם 0.70 מ"ג של 2-AB, 10.50 μL של חומצה אצטית, 6 מ ג של נתרן cyanoboroהידריד (NaBH3CN), ו 24.50 μl של diמתיל סולפוקסיד (dmso) (נפח כולל = 35 μl). לאחר מכן, להוסיף חומצה אצטית, 2-AB, ו NaBH3CN לתוך dmso בסדר.
  2. לתייג את הגליקנים באמצעות 35 μL של 2-AB תיוג מגיב, להעביר את הגליקנים המסומנים ל-מתנד עבור 5 דקות, העברה לתנור עבור 3 h ב 65 ° c, לאחר מכן העברה RT עבור 30 דקות.
    הערה: יש לבצע את השלבים הניתנים לתיוג כולו תוך הגנה מפני אור.
  3. לטיפול pretreat 0.2 יקרומטר מסנן לוחית עם 200 μl של 70% אתנול, 200 μl של מים אולטרה טהורים, ו-200 μl של 96% acetonitrile (4 ° c), ולאחר מכן להסיר פסולת באמצעות משאבת ואקום.
  4. טיהור של 2-AB מתויג גליקן
    1. הוסף 700 μL של 100% aceton, לתוך 2-AB המסומן גליקן והעבר לאינקובטור רועד עבור 5 דקות.
    2. צנטריפוגה ב 134 x g עבור 5 דקות (4 ° c).
    3. העבר את המדגם לצלחת מסנן 0.2 יקרומטר ghp עבור 2 דקות ולהסיר את פילטרט (נוזל זורם) באמצעות משאבת ואקום.
  5. לשטוף 2-AB התווית גליקן עם 200 μl של 96% acetonitrile (4 ° c) ולהסיר את פילטרט (נוזל זורם) באמצעות משאבת ואקום 5x-6x.
  6. לאליוט 2-AB התווית גליקן עם 100 μL של מים אולטרה טהורים 3x.
  7. להעביר את הגליל 2-AB המסומן לתוך תנור להתייבש ב 60 ° c עבור 3.5 h.
  8. שמרו את ה- N-גליפחיות המסומנות ב-80 ° c עד למדידה נוספת.

4. הידרופילי-כרומטוגרפיה וניתוח של גליקנים

  1. מיזוג מכשירי הכנת שלבים ניידים
    1. הכנת שלבים ניידים כולל ממס A: 100 mM אמוניום (pH = 4.4), ממס B: 100% acetonitrile, ממס C: 90% אולטרה טהור מים (10% מתנול), ומס D: 50% מתנול (אולטרה טהור מים).
    2. פתח את התוכנה כדי לשלוט בשלבים הניידים.
    3. לשטוף את הכלים של ה-, הזרמת מכשירים בקצב הזרימה של 0.2 mL/min (50% מממס B ו50%) איזון עבור 30 דקות, ולאחר מכן בקצב זרימה של 0.2 mL/min (25% ממס A ו-75% מומס B) איזון עבור 20 דקות, אז קצב הזרימה של 0.4 mL/min איזון.
  2. מפזר את התווית N-גליקנים עם 25 μl של תערובת של 100% acetonitrile ומים אולטרה טהורים ביחס 2:1 (v/v). לאחר מכן, צנטריפוגה ב 134 × g עבור 5 דקות (4 ° c) וטען 10 μl של N-גליקות מתויג לתוך כלי המכשירים.
  3. הפרד את התוויות N-גליקות בקצב הזרימה של 0.4 mL/min עם מעבר הדרגתי ליניארי של 75% עד 62% acetonitrile עבור 25 דקות. לאחר מכן, בצע ניתוח אנליטי על-ידי סולם כיול תוספי/העמודה גליקואפיד ב-60 ° צ' (כאן, שמרו דגימות ב -4 ° צ' לפני ההזרקה).
  4. לזהות N-גליניתן זריחה ב עירור ו גל פליטה אורכי של 330 ננומטר ו 420 nm, בהתאמה.
  5. שילוב הגליקנים המבוססים על מיקום שיא וזמן שמירה.
  6. לחשב את הערך היחסי של כל גליקן שיא (GP)/כל גליקן פיקס (באחוזים,%) כדלקמן: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, וכו '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שמוצג באיור 1, מנתחים Igg N-גליקנים לתוך 24 הראשונים igg גליקן הפסגות (GPs) מבוסס על מיקום שיא וזמן השמירה. מבני N-גליקן זמינים דרך זיהוי ספקטרומטר המסה לפי מחקר קודם (שולחן 1)15. כדי להבטיח כי התוצאות היו דומות, החלה נורמליזציה בשטח כולל, שבה כמות הגליקנים בכל שיא ביטאו כאחוז מהשטח המשולב הכולל.

כדי להעריך את החזרה והיציבות של השיטה, הדגימה הסטנדרטית נבדקה במקביל שש פעמים. כפי שמוצג בטבלה 2, מקדם הווריאציה (CV) של 24 GPs נע בין 1.84%-16.73%, 15 (62.50%) מהם היו מתחת ל -10%. GPs עם פרופורציות קטנות יחסית (≤ 1.16%) הראה שגיאות מדידה גבוהה (יותר מ -10% מקורות חיים). בנוסף, פרופילי IgG N-גליקן בשילוב מ 76 אנשים (איור 2) ציין כי מיקומו של gp היה יציב, הצורה של gp היה דומה, ואינטגרציה לדגימות שמרו על אותם מרווחי זמן. התוצאות לעיל מעידות על כך שהשיטה יציבה ומקיימת את השחזור.

כפי שמוצג בטבלה 3, 36 נוספים תכונות נגזרות המתארות את הריקודים היחסיים של גלטוסיציה, סיאליציה, ביגובה GlcNAc, ו fucosylation הליבה חושבו על ידי הנותרים 24 מדוד גליקנים. לדוגמה, G2/G0 (GP12/GP2) שיקפו את רמת הגלטוסיציה (di-/a-) ללא הליבה והחצייה של GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) שיקפו את רמת הגלוטוסיציה (די-/חד-מונו-) עם הזרם המרכזי ומבלי לעבור GlcNAc. לבסוף, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) שיקפו את רמת הגלטוסיציה (מונו-/gp6) עם הליבה והחצייה של GlcNAc. חישובים אלה של גליקנים נגזרים מבינים עיקרון, כדי לראות את השינוי של תכונת גליקוציה אחת בלבד.

Figure 1
איור 1: כרומאטוגרמה של האדם היחיד. IgG N-גליקנים נותחו לתוך 24 הראשונים igg גליקן הפסגות (GPs) מבוסס על מיקום שיא זמן השמירה. GP8 מייצג את הסכום של GP 8a ו-GP 8a. GP16 מייצג את הסכום של GP 16a ו-GP 16a. מבנה הגליקנים בכל שיא כרומאטוגרפי והאחוז הממוצע של מבנים בודדים מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כרומאטוגרם של 76 אנשים. פרופילי IgG N-גליקן שולבו מ 76 אנשים כדי להדגים את החזרה והיציבות של השיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Table 1
שולחן 1: מבנה 24 הראשונים האיגליקנים. GP: גליקן שיא; F: fucose; A: מספר האנטנה מוצמד לרצף הליבה (הקיים של שני שאריות של משקעי הדגל); ב: החצייה של GlcNac; ז: גלקטוז; S: חומצה סילית. ערכות מבניות מוגדרות כדלקמן: ריבוע כחול: GlcNac; מעגל ירוק: מנוז; משולש אדום: ליבה fucose/אנטנה מרכזית; מעגל צהוב: גלקטוז; סגול מעוב: חומצה סילית.

פסגת גליקן ממוצע (SD) קורות חיים (%) פסגת גליקן ממוצע (SD) קורות חיים (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
GP2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
GP4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

טבלה 2: דיוק של השיטה. המדגם הסטנדרטי נבדק במקביל שש פעמים כדי להעריך את החזרה והיציבות של השיטה. CV: מקדם הווריאציה; GP: שיא גליקן; SD: סטיית תקן.

גליקנים נגזרים נוסחאות גליקנים נגזרים נוסחאות
גלטוסילציה פוקוזילציה
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8 + GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8 + GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10 + GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8 + GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10 + GP11)/GP6
סיאליציה ביסבי GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

שולחן 3: חישוב הגליקנים הנגזרים. GP: גליקן שיא; F: fucose; ב: החצייה של GlcNac; ז: גלקטוז; S: חומצה סילית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הוא משמש כשיטה לניתוח יחסי כמותי5,15. התוצאות מצביעות על כך שהוא טכנולוגיית גילוי יציבה עם השגות ודיוק כמותי יחסית. כמות הגליקנים בכל שיא מתבטאת כאחוז של השטח המשולב הכולל באמצעות ה-, המהווה את הערך היחסי. הקוונפיקציה היחסית משפרת את יכולת ההשוואה של דגימות הבדיקה. בנוסף, 96 באיכות חלבון G לוחיות משמשות כדי לטהר IgG עם 96 דגימות בבת אחת עבור זיהוי תפוקה גבוהה. היכולת של חלבון G לאגד igg היא גדולה מזו של חלבון A, כפי שמתואר במחקרים קודמים15,16.

בנוסף, המבנים של IgG N-גליקן מופרדים בבירור. הigg גליקנים הנגזרים מתארים את רמת הגלוטוסיציה, הסיאליציה, החצייה של GlcNAc, והליבה המרכזית, המחושבת על-ידי ה-IgG N-גליקנים הראשוניים. במחקר הקודם, כמה גליקנים נגזר (FBn, FBG0n /G0n, פנסיון מלאn /F ntotal, Bn /(Fn +FB), FBG2n /FG2n, FG2n /(BG2n + FBG2n), BG2n /(FG2n + FBG2n)) יכול לשקף את השינוי ברמות גליקוציה מרובות, אך לא ישקף את רמת הגליסיציה הספציפית15.

לאחרונה, מחקר בקנה מידה גדול הראה כי IgG גלטוסילציה (המכונה "גל יחס") יכול לשמש כסמן מבטיח להקרנה סרטן במספר סוגי סרטן17. התפלגות הגפסיציה של IgG באמצעות חישוב העוצמות היחסיות של agalactosylated (G0) נגד מונוגלטוסיזון (G1) ו-Digalactosylated (G2) N-גליקנים בהתאם לנוסחה (G0/[G1 + G2 x 2]). היחס-גל משקף את רמת הגלטוסיציה עם הליבה ומבלי לעבור את GlcNAc. לכן, מספר רב של מיכלים של IgG N-גליקנים בשילוב עם גליקן נגזר, המייצג את הרמה של תכונת גליקוציה ספציפית. חישובי הגליקנים הנגזרים מולכים לפי עיקרון שחוקר את השינויים בתכונת גליקוציה אחת בלבד שתוקנה על תכונת גליקוציה אחרת.

בפרוטוקול הנוכחי, pH חשוב לשמירה על היציבות של מבנים IgG ו גליקן, במיוחד לייצוב המסוף. לכן, ערך ה-pH של הפתרון חייב להיות נשלט בקפדנות, ואת ה-pH של הפתרון נחשף IgG חייב להיות שוחזר, כמו גם גליקנים נשמר ברמת pH נייטרלי. בנוסף, השלב הניתן לשחרור הוא קריטי בפרוטוקול זה. המפתח כדי גליקן לשחרר הוא שיפור הפעילות של האנזים PNGase F כדי למקסם את היעילות שלה. לדוגמה, הוא נמצא כי 18-20 h הוא אופטימלי עבור העיכול PNGaseF. . הצעד הזה צריך להגיב במלואו

. יש כמה מגבלות על הטכניקה הזו השיטה המשמשת לא יכולה להבדיל בין גליקנים שפורסמו בחלקים הFab והFc של IgG. גליקנים מFab ו-Fc ידועים כאחרים. עם ההתפתחויות גליקורופאומיקס, טכניקות זיהוי יכול למדוד את הרמות של IgG שילוב n-גליקנים כדי לחקור את התפקיד של igg n-גליטלציה ו- n-הגליסיציה במחלות. עלות הציוד נמוכה יחסית; עם זאת, העלות לכל מדגם גבוהה למדי.

לסיכום, פרוטוקול זה מציג את ה-, כדי שניתן יהיה להשתמש בו באופן נרחב. הערכה מקיפה וסטנדרטיזציה של השיטות האנליטיות נדרשות לפני כמויות משמעותיות של זמן ומשאבים מושקעים במחקרים בקנה מידה גדול. כפי שנעשה בו שימוש נרחב יותר, ההשפעות של IgG N-גליקנים ו- N-גליצלציה על מחלות מסוימות יכולות להיות מוגדרות באופן מדויק יותר, וניתן להשתמש בסמנים ביוגליציה ליישומים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81673247 & 81872682) ו אוסטרליה-סין מענק שיתופי (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21, (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
אימונוגלובולין G N-גליקן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית במיוחד
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).More

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter