Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Иммуноглобулин G N-Гликан Анализ ультра-производительность жидкой хроматографии

doi: 10.3791/60104 Published: January 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Иммуноглобулин G (IgG) N-гликанхарактеризуется с помощью гидрофильной взаимодействия хроматографии UPLC. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена. Представлено здесь введение в этот экспериментальный метод, так что он может быть широко использован в научно-исследовательских условиях.

Abstract

Glycomics является новой подспециализацией в исследованиях системы омики, которая предлагает значительный потенциал в открытии биомаркеров следующего поколения для восприимчивости к болезням, открытия целевых лекарственных средств и точной медицины. Альтернативные IgG N-гликаны были зарегистрированы в нескольких распространенных хронических заболеваний и предложил иметь большой потенциал в клинических приложениях (т.е., биомаркеры для диагностики и прогнозирования заболеваний). IgG N-гликанов широко характеризуется с помощью метода гидрофильной взаимодействия хроматографии (HILIC) ультра-производительности жидкой хроматографии (UPLC). UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и высокой относительной количественной точностью. Кроме того, структура IgG N-гликанчетко разделена, а гликановский состав и относительное изобилие в плазме характеризуются.

Introduction

N-гликозилирование человеческих белков является общей и важной посттрансляционной модификацией1 и может помочь предсказать возникновение и развитие заболеваний относительно точно. В связи со сложностью его структуры, ожидается, что Есть более чем 5000 гликановых структур, обеспечивая большой потенциал в качестве диагностических и прогностических биомаркеров для заболеваний2. N-гликанов, прикрепленных к иммуноглобулину G (IgG), как было показано, имеют важное значение для функции IgG, и IgG N-гликозилирование участвует в балансе между про- и противовоспалительными системами3. Дифференциальная IgG N-гликозилирование участвует в развитии и прогрессировании заболеваний, представляющих как предрасположенность, так и функциональный механизм, участвующий в патологии заболевания. Воспалительная роль IgG N-гликозилирования была связана со старением, воспалительными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и раком4.

С развитием технологии обнаружения, наиболее широко используются следующие методы в гликомиксах высокой пропускной способности: гидрофильные взаимодействия хроматографии (HILIC) ультрапроизводительной жидкой хроматографии с обнаружением флуоресценции (UPLC-FLR), мультиплексного капиллярного геля электрофорекса с лазерным индуцированным Обнаружение флуоресценции (xCGE-LIF), матричной лазерной дезорпации/ионизации времени полета масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) и жидкой хроматографии электроспрейной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS) . Эти методы преодолели предыдущие недостатки низкого потока, нестабильные результаты, и низкая чувствительность специфичность5,6.

UPLC широко используется для изучения связи между IgG N-гликозилирование и некоторые заболевания (т.е. старение7, ожирение8, дислипидемия9, диабет II типа10, гипертония11, ишемический инсульт12, и болезнь Паркинсона13). По сравнению с другими тремя вышеупомянутыми методами, UPLC имеет следующие преимущества5,14. Во-первых, он обеспечивает относительный метод количественного анализа, а анализ данных, который включает в себя полное нормализацию площади, улучшает сопоставимость каждой выборки. Во-вторых, стоимость оборудования и требуемых знаний относительно невелики, что облегчает внедрение и преобразование биомаркеров гликозилирования в клинические приложения. Представлено здесь введение в UPLC, чтобы он мог быть более широко используется.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все предметы, включенные в протокол, были одобрены Комитетом по этике Столичного медицинского университета, Пекин, Китай12. Письменное информированное согласие было получено от каждого предмета в начале исследования.

1. Изоляция IgG

  1. Подготовка химических веществ, включая связывающий буфер (фосфат буферный солен, PBS): 1x PBS (pH 7.4), нейтрализующий буфер: 10x PBS (pH 6.6-6.8), eluent: 0.1 M formic кислота (pH q 2.5), нейтрализуя разрешение для eluent: 1 M ammonium bicarbonat, буфер: 20% этанол 20 мм Трис 0,1 М NaCl (pH 7.4), очищающий раствор для белка G: 0,1 М НаОХ и 30% пропан-2-ol.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень рН имеет решающее значение в этом протоколе. Elution IgG требует очень низкого рН, и есть риск потери сиаливных кислот из-за кислотного гидролизов. Таким образом, elution происходит в течение нескольких секунд, и рН быстро восстанавливается в нейтральном статусе, сохраняя целостность IgG и сиаливных кислот.
  2. Подготовьте образцы: разморозьте замороженный образец плазмы, затем центрифугу на уровне 80 х г в течение 10 мин, и оставьте белок G монолитной пластины и вышеупомянутые химические вещества в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
  3. Передача 100 л образца (который может быть использован для обнаружения 2x для предотвращения первого отказа) в 2 мл коллекции пластины (здесь, в общей сложности шесть стандартных образцов, один контрольный образец »ультра-чистая вода» и 89 образцов плазмы были разработаны для 96 хорошо пластин и случайным образом назначены к тарелке).
  4. Разбавить образцы 1x PBS на 1:7 (v/v).
  5. Очистите фильтровальную пластину 0,45 мкм гидрофильной полипропилена (GHP) с 200 л ультра-чистой воды (повторите 2x).
  6. Перенесите разбавленные образцы в фильтровальную пластину и процедите образцы в коллекционную пластину с помощью вакуумного насоса (контроль вакуумного давления на уровне 266,6-399,9 па).
  7. Приготовление белка G монолитных пластин
    1. Откажитесь от буфера хранения.
    2. Очистите монолитные пластины с 2 мл ультра-чистой воды, 2 мл 1x PBS, 1 мл 0,1 М formic кислоты, 2 мл 10x PBS, 2 мл 1x PBS (последовательно), и удалить текущую жидкость с помощью вакуумного насоса.
  8. Перенесите отфильтрованные образцы в монолитную пластину белка G для связывания и очистки IgG, затем очистите монолитные пластины 2 мл 1x PBS (повторите очистку 2x).
  9. Elute IgG с 1 мл 0,1 М фомиевой кислоты и фильтровать образцы в пластину сбора с помощью вакуумного насоса, а затем добавить 170 л 1 М бикарбонат аммония в коллекции пластины.
  10. Обнаружение концентрации IgG с помощью спектрофотометра поглощения (оптимальная длина волны - 280 нм).
    1. Откройте программное обеспечение и выберите режим белка-CY3.
    2. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран (повторить 1x).
    3. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите ее в экран, затем нажмите Образец в программном обеспечении для обнаружения ультра-чистой воды.
    4. Нарисуйте 2 ЗЛ образца IgG и загрузите его в экран, а затем нажмите Образец в программном обеспечении, чтобы обнаружить образец.
    5. Нарисуйте 2 злители ультра-чистой воды и загрузите его в экран, затем нажмите Бланк в программном обеспечении, чтобы очистить экран.
    6. Закройте программное обеспечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула для расчета концентрации IgG заключается в следующем:

      Коэффициент поглощения CIgG и вымирания (13,7) x 1000 мкг/мл
  11. Положите извлеченный IgG высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию и сохранить извлеченные IgG (300 л извлеченных IgG в течение 4 ч).
    1. Удалите 300 л извлеченных IgG, если концентрация превышает 1000 мкг/мл.
    2. Удалите 350 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 500 до 1000 мкг/мл.
    3. Удалите 400 л извлеченных IgG, если концентрация составляет от 200-500 мкг/мл.
    4. Удалите 600 л извлеченных IgG, если концентрация меньше 200 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация IgG должна быть предпочтительно йgt;200 мкг/мл для последующего обнаружения. Среднее количество IgG должно быть предпочтительно йgt;1,200 мкг, которые могут быть проверены 2x в случае первого теста не удается.
  12. Очистка белка G монолитной пластины для повторного использования
    1. Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 1 мл 0,1 МН НаОХ (для удаления осажденных белков), 4 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
    2. Вымойте тарелку 2 мл ультрачистой воды, 2 мл 30% пропан-2-ol (для удаления связанных гидрофобных белков), 2 мл сверхчистой воды и 4 мл 1x PBS (последовательно), затем удалить протекающую жидкость с помощью вакуумного насоса.
    3. Вымойте тарелку с 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) и добавить 1 мл буфера (20% этанола 20 Мм Трис 0,1 М NaCl) к пластине, а затем оставить пластину при 4 градусах по Цельсию.

2. Гликан релиз

  1. Подготовка сушеных IgG и хранить химические вещества, включая 1,33% SDS, 4% Igepal (хранить вдали от света), и 5x PBS на RT.
  2. Приготовьте фермент PNGase F, разбавив фермент 250 U с 250 л ультра-чистой воды.
  3. Денатурация IgG
    1. Добавьте 30 кл. 1,33% SDS и перемешайте путем вихря, перенесите образец в духовку 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем выньте его из духовки и дайте отдохнуть в течение 15 мин.
    2. Добавьте 10 qL 4% Igepal и поместите его на встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
  4. Удаление и высвобождение гликанов
    1. Добавьте 20 кЛ 5x PBS и 30-35 Л 0,1 моль/L NaOH, чтобы регулировать рН 8,0, и смешивать путем вихря. Добавьте 4 qL фермента PNGase F и смешайте путем вихря. Затем, инкубировать 18-20 ч в водяной бане 37 градусов.
    2. Положите выпущенные гликаны высохнуть в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию на 2,5-3,0 ч.
    3. Сохранить освобожденных гликанов при -80 градусов до дальнейшего измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Ключом к высвобождению гликанов является повышение активности фермента PNGase F для максимизации его эффективности.

3. Гликанная маркировка и очистка

  1. Приготовьте 2-аминобензамид (2-АБ) с маркировкой реагента 0,70 мг 2-AB, 10,50 л уксусной кислоты, 6 мг цианоборогидрида натрия (NaBH3CN) и 24,50 л диметилового сульфоксида (DMSO) (общий объем 35 мл). Затем добавьте уксусную кислоту, 2-AB, и NaBH3CN в DMSO в порядке.
  2. Пометьте гликанов с помощью 35 злител 2-AB маркировки реагента, передать помеченные гликаны на осциллятор в течение 5 минут, передача в духовку в течение 3 ч при 65 градусов по Цельсию, затем передать на RT в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Весь шаг маркировки гликанов должен быть выполнен в то время как защищены от света.
  3. Предварительно пролечить фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP с 200 йл 70% этанола, 200 л ультра-чистой воды и 200 л 96% ацетонитрила (4 кВ), затем удалить отходы с помощью вакуумного насоса.
  4. Очистка 2-AB помечены гликан
    1. Добавьте 700 л 100% ацетонитрила в 2-AB помечены гликан и передачи в встряхивая инкубатор в течение 5 минут.
    2. Центрифуга при 134 х г в течение 5 мин (4 кВ).
    3. Перенесите образец на фильтровальную пластину 0,2 мкм GHP в течение 2 мин и удалите фильтр (текущую жидкость) с помощью вакуумного насоса.
  5. Вымойте 2-AB помечены гликан с 200 зл 96% ацетонитрила (4 кВ) и удалить фильтрата (текущая жидкость) с помощью вакуумного насоса 5x-6x.
  6. Elute 2-AB помечены гликан с 100 зл и глот ультра-чистой воды 3x.
  7. Перенесите 2-AB помечены гликан в духовку, чтобы высохнуть при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 3,5 ч.
  8. Сохраните помеченные N-гликаны при -80 градусах По Цельсию до дальнейшего измерения.

4. Гидрофильные взаимодействия хроматографии и анализа гликанов

  1. Кондиционирование приборов UPLC и подготовка мобильных фаз
    1. Подготовка мобильных фаз, включая растворитель A: 100 мМ аммония formate (рН No 4,4), растворитель B: 100% ацетонитрил, растворитель C: 90% ультра-чистой воды (10% метанола), и растворитель D: 50% метанола (ультра-чистая вода).
    2. Откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами.
    3. Вымойте приборы UPLC при скорости потока 0,2 мл/мин (50% растворителя В и 50% растворителя С), балансируя 30 мин, затем при скорости потока 0,2 мл/мин (25% растворителя А и 75% растворителя В) балансируя 20 мин, затем скорость потока 0,4 мл/мин балансировки.
  2. Растворите помеченные N-гликаны с 25 зл смеси 100% ацетонитрила и ультра-чистой воды в соотношении 2:1 (v/v). Затем центрифугу на 134 г в течение 5 мин (4 кВ) и загрузите 10 qL помеченных N-гликанов в инструменты UPLC.
  3. Отделите помеченные N-гликаны со скоростью потока 0,4 мл/мин с линейным градиентом от 75% до 62% ацетонитрила в течение 25 мин. Затем выполните аналитическую выползует dextran калибровочной лестницей/гликопептидной колонкой на UPLC при 60 градусах Цельсия (здесь образцы хранились при 4 градусах Цельсия до инъекции).
  4. Обнаружить N-гликанфлуоресценции при возбуждении и длины волны выбросов 330 нм и 420 нм, соответственно.
  5. Интегрируйте гликаны на основе пикового положения и времени удержания.
  6. Рассчитайте относительную стоимость каждого гликанского пика (GP)/ все гликанские пики (GPs) (в процентах, %) следующим образом: GP1: GP1/GPs-100, GP2: GP2/GPs-100, GP3: GP3/GPs-100 и т.д.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как показано на рисунке 1, IgG N-гликанов были проанализированы в 24 первоначальных Пиков IgG гликанов (GPs) на основе пикового положения и времени удержания. N-гликан структуры доступны через обнаружение масс-спектрометрии в соответствии с предыдущим исследованием (Таблица 1)15. Для обеспечения сопоставимых результатов применялась общая нормализация площади, в которой количество гликанов в каждом пике выражалось в процентах от общей интегрированной площади.

Для оценки повторяемости и стабильности метода стандартная выборка тестировалась параллельно шесть раз. Как показано в таблице 2, коэффициент вариации (CV) 24 GPs колебался от 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) из которых были ниже 10%. ГП с относительно небольшими пропорциями (1,16%) показали высокие ошибки измерения (более 10% резюме). Кроме того, профили IgG N-гликанов, объединенные с 76 особями(рисунок 2),показали, что положение ГП является стабильным, форма ГП аналогична, а интеграция для образцов поддерживается с теми же интервалами. Вышеприведенные результаты показывают, что метод является стабильным и повторяемым.

Как показано в таблице 3, дополнительные 36 производных черт, описывающих относительное изобилие галактозилирования, сиалиляции, раздвоение GlcNAc, и ядра фукозилирования были рассчитаны на оставшиеся 24 непосредственно измеренных гликанов. Например, G2/G0 (GP12/GP2) отражает уровень галактозилирования (ди-/а-) без фукозилирования ядра и двухсекционного GlcNAc. G2/G1 (GP14/GP8 - GP9) отражает уровень галактозилирования (ди-/моно-) с основной фукозилацией и без раздевания GlcNAc. Наконец, G1/G0 (GP10 - GP11/GP6) отражал уровень галактозилирования (моно-/а-) с ядрой фукозилирования и двухсекционным GlcNAc. Эти расчеты производных гликанов следуют принципу, чтобы увидеть изменение только одной черты гликозилации.

Figure 1
Рисунок 1: Хроматограмма UpLC одного человека. IgG N-гликанов были проанализированы в 24 первоначальных Пикig гликанпиков (GPs) на основе пикового положения и времени удержания. GP8 представляет собой сумму GP 8a и GP 8b. GP16 представляет собой сумму GP 16a и GP 16b. Структура гликанов в каждом хроматографическом пике и средний процент отдельных структур показаны в таблице 1 и таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Хроматограмма UPLC 76 особей. Профили IgG N-glycan были объединены с 76 особями, чтобы продемонстрировать повторяемость и стабильность метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Table 1
Таблица 1: Структура 24 первоначальных гликанов IgG. GP: гликановый пик; F: фукос; О: количество антенны, прикрепленной к основной последовательности (существующие два нацетилглукосамина (GlcNAc) и три остатка маннозы); B: рассекающий GlcNac; G: галактоза; S: сиаливая кислота. Структурные схемы определяются следующим образом: синий квадрат: GlcNac; зеленый круг: манноза; красный треугольник: ядро фукозы / антенны фукозы; желтый круг: галактоза; фиолетовый ромб: сиаливая кислота.

Гликанский пик Средний (SD) Cv (%) Гликанский пик Средний (SD) Cv (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
GP2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
GP4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

Таблица 2: Точность метода. Стандартная проба проверяется параллельно шесть раз для оценки повторяемости и стабильности метода. CV: Коэффициент вариации; ГП: Гликанский пик; SD: Стандартное отклонение.

Полученные гликаны Формулы Полученные гликаны Формулы
Галактосилация Фукосилис
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8' GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8' GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10" GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8' GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10" GP11)/GP6
Сиалилация Разборки GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10-GP11)/ (GP8) GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

Таблица 3: Расчет производных гликанов. GP: гликановый пик; F: фукос; B: рассекающий GlcNac; G: галактоза; S: сиаливая кислота.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

UPLC служит в качестве метода относительного количественного анализа5,15. Полученные результаты свидетельствуют о том, что UPLC является стабильной технологией обнаружения с хорошей воспроизводимостью и относительной количественной точностью. Количество гликанов в каждом пике выражается в процентах от общей интегрированной площади с использованием UPLC, которая является относительным значением. Относительная количественная оценка повышает сопоставимость тестовых образцов. Кроме того, 96 хорошо белка G пластины используются для очистки IgG с 96 образцов в одно время для высокой пропускной всей ягоды. Способность белка G связывать IgG больше, чем у белка А, как описано в предыдущих исследованиях15,16.

Кроме того, структуры IgG N-гликанчетко разделены. Полученные гликаны IgG описывают уровень галактозилирования, сиалиляции, раздвоение GlcNAc и ядра фукозилирования, которые рассчитываются первоначальными IgG N-гликанами. В предыдущем исследовании некоторые полученные гликаны (FBn, FBG0n / G0n, FBn / Fntotal, Bn / (Fn n fbn,FBG2n / FG2n,FG2n / (BG2n q FBG2n), BG2n / (FG2n q FBG2n))может отражать изменения в нескольких гликозилах, но

Недавно крупномасштабное исследование показало, что IgG galactosylation (именуемый Gal-коэффициент) может служить перспективным биомаркером для скрининга рака у нескольких типов рака17. Распределение галактосилации IgG измеряется путем расчета относительной интенсивности агалактозилированных (G0) против моногалактозиледных (G1) и дигалаклактозирует (G2) N-гликанов в соответствии с формулой (G0/G1 - G2 х 2). Гал-коэффициент отражает уровень галактосиляции с фукозилированием ядра и без раздевания GlcNAc. Таким образом, несколько начальных IgG N-гликанов были объединены с производным гликаном, представляющим уровень специфической черты гликозилации. Расчеты производных гликанов следуют принципу, который исследует изменения только в одной гликозилации черта фиксированной по сравнению с другими чертами гликозилации.

В настоящем протоколе рН важен для поддержания стабильности структур IgG и гликанов, особенно для стабилизации сиилиляции терминала. Таким образом, значение pH раствора должно быть строго контролируется, и рН раствора, подвергаемого IgG, должен быть восстановлен, а гликаны должны храниться на нейтральном уровне рН. Кроме того, в этом протоколе критически важен шаг выпуска гликана. Ключом к высвобождению гликанов является повышение активности фермента PNGase F для максимизации его эффективности. Например, было установлено, что 18-20 ч является оптимальным для пищеварения PNGaseF. На этот шаг необходимо полностью отреагировать.

Есть некоторые ограничения этой техники. Используемый метод не может дифференцировать гликанов, выпущенных из Fab и Fc части IgG. Гликаны из Fab и Fc, как известно, разные. С развитием гликопротеомики, методы обнаружения могут измерять уровни IgG объединения N-гликанов для изучения роли IgG N-гликанови N-гликозилирования при заболеваниях. Стоимость оборудования относительно низка; однако стоимость одного образца довольно высока.

Таким образом, этот протокол вводит UPLC, так что он может быть широко использован. Необходима комплексная оценка и стандартизация аналитических методов, прежде чем вкладывать значительные объемы времени и ресурсов в крупномасштабные исследования. По мере того как UPLC становится все более широко используемым, эффекты IgG N-гликанов и N-гликозилирования на некоторые заболевания могут быть более точно определены, и биомаркеры гликозилации могут быть использованы для клинических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81673247 и 81872682) и Австралийско-китайский совместный грант (NH и MRC - APP11112767 -NSFC 81561128020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21, (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
Иммуноглобулин G N-Гликан Анализ ультра-производительность жидкой хроматографии
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).More

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter