Summary
Immunglobulin G (IgG) N-Glycan kännetecknas med hjälp av hydrofila interaktionskromatografi UPLC. Dessutom är strukturen av IgG N-glykan tydligt åtskilda. Presenteras här är en introduktion till denna experimentella metod så att den kan användas i stor utsträckning i forskningsmiljöer.
Abstract
Glycomics är ett nytt subspecialty i omics Systemforskning som erbjuder betydande potential för att upptäcka nästa generations biomarkörer för sjukdoms känslighet, läkemedelsmål Discovery, och precisionsmedicin. Alternativa IgG N-glykaner har rapporterats i flera vanliga kroniska sjukdomar och föreslog att ha stor potential i kliniska tillämpningar (dvs., biomarkörer för diagnos och Prediktion av sjukdomar). IgG N-glykaner kännetecknas allmänt med hjälp av metoden för hydrofila interaktionskromatografi (hilic) Ultra-prestationsvätskekromatografi (UPLC). UPLC är en stabil detektionsteknik med god reproducerbarhet och hög relativ kvantitativ noggrannhet. Dessutom är strukturen av IgG N-glykan tydligt åtskilda, och glykananalys sammansättning och relativa överflöd i plasma kännetecknas.
Introduction
N-glykosylering av humana proteiner är en vanlig och essentiell post-translationell modifiering1 och kan hjälpa till att förutsäga uppkomst och utveckling av sjukdomar relativt noggrant. På grund av komplexiteten i dess struktur, det förväntas att det finns mer än 5 000 glykananalys strukturer, vilket ger stor potential som diagnostiska och Prediktiva biomarkörer för sjukdomar2. N-glykaner kopplade till immunglobulin G (IgG) har visat sig vara väsentliga för IgG funktion, och IgG N-glykosylering deltar i balansen mellan Pro-och antiinflammatoriska system3. Differential IgG N-glykosylering är involverad i sjukdomsutveckling och progression, som representerar både en predisposition och funktionell mekanism som deltar i sjukdoms patologi. Den inflammatoriska rollen av IgG N-glykosylering har förknippats med åldrande, inflammatoriska sjukdomar, autoimmuna sjukdomar, och cancer4.
Med utvecklingen av detektionsteknik, följande metoder används mest i hög genomströmning glycomics: hydrofila interaktionskromatografi (HILIC) Ultra-Performance vätskekromatografi med fluorescensdetektion (UPLC-FLR), multiplex kapillär gel elektrofores med laserinducerad fluorescensdetektion (xCGE-LIF), Matrix-Assisted laserdesorption/joniseringstid-of-Flight masspektrometri (MALDI-TOF-MS), och vätskekromatografi elektrospray masspektrometri (LC-ESI-MS) . Dessa metoder har övervinna tidigare brister i låga Flux, instabila resultat, och dålig känslighet specificitet5,6.
UPLC används ofta för att utforska sambandet mellan IgG N-glykosylering och vissa sjukdomar (i.e., åldrande7, fetma8, dyslipidemi9, typ II diabetes10, hypertoni11, ischemisk stroke12, och Parkinsons sjukdom13). Jämfört med de andra tre ovannämnda metoderna har UPLC följande fördelar5,14. Först, det ger en relativ kvantitativ analysmetod, och dataanalys som innebär total areal normalisering förbättrar jämförbarheten av varje prov. För det andra är kostnaden för utrustning och erforderlig expertis relativt låg, vilket gör det lättare att implementera och omvandla glykosyleringsbiomarkers till kliniska tillämpningar. Presenteras här är en introduktion till UPLC så det kan vara mer allmänt används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla ämnen som ingår i protokollet har godkänts av etikkommittén för Capital Medical University, Peking, Kina12. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne i början av studien.
1. IgG-isolering
- Förbered kemikalierna inklusive bindningsbuffert (fosfatbuffrad saltlösning, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutraliserande buffert: 10X PBS (pH = 6,6-6,8), Eluent: 0,1 M myrsyra (pH = 2,5), neutraliserande lösning för Eluent: 1 M ammoniumbikarbonat, lagrad buffert: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), rengöringslösning för protein G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
Anmärkning: pH-nivån är kritisk i detta protokoll. Elueringen av IgG kräver ett mycket lågt pH, och det finns en risk för förlust av sialic syror på grund av syra hydrolys. Eluering sker därför inom några sekunder, och pH-värdet återställs snabbt till neutralitet, vilket bevarar integriteten hos IgG och sialic-syrorna. - Förbered proverna: Tina det frusna plasma provet Centrifugera vid 80 x g i 10 minuter och lämna protein g monolitisk plåt och ovannämnda kemikalier i 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Överför ett 100 μL-prov (som kan användas för att detektera 2x för att förhindra det första felet) till en 2 mL samlingsplatta (här, sammanlagt sex standardprover, ett kontrollprov [Ultra-Pure Water] och 89 plasmaprover utformades för 96-plattor och slumpmässigt tilldelade till plattan).
- Späd proverna med 1x PBS med 1:7 (v/v).
- Rengör en 0,45 μm hydrofila polypropylen (GHP) filter platta med 200 μL ultrarent vatten (upprepa 2x).
- Överför de utspädda proverna till filter plattan och filtrera proverna i samlingsplattan med en vakuumpump (kontrollera vakuum trycket vid 266.6-399.9 PA).
- Beredning av protein G monolitiska plattor
- Kassera lagringsbufferten.
- Rengör de monolitiska plattorna med 2 mL ultrarent vatten, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M myrsyra, 2 mL 10X PBS, 2 mL 1x PBS (sekventiellt) och avlägsna flytande vätska med hjälp av en vakuumpump.
- Överför de filtrerade proverna till protein G monolitisk plåt för IgG-bindning och rengöring, rengör sedan de monolitiska plattorna med 2 mL 1x PBS (upprepa rengöring 2x).
- Elute IgG med 1 mL 0,1 M myrsyra och filtrera proverna i uppsamlings plattan med vakuumpump, tillsätt sedan 170 μL av 1 M ammoniumbikarbonat i samlingsplattan.
- Detektera IgG-koncentration med hjälp av en absorptionsspektrofotometer (optimal våglängd = 280 nm).
- Öppna programvaran och välj protein-CY3-läget.
- Dra 2 μL ultra-rent vatten och fyll på den i skärmen och klicka sedan på Tom i programvaran för att rensa skärmen (upprepa 1x).
- Dra 2 μL ultrarent vatten och fyll på det i skärmen och klicka sedan på Sample i programvaran för att detektera det ultrarent vattnet.
- Dra 2 μL IgG-prov och fyll på det i skärmen och klicka sedan på Sample i programvaran för att identifiera provet.
- Dra 2 μL ultra-rent vatten och fyll på den i skärmen och klicka sedan på Tom i programvaran för att rensa skärmen.
- Stäng programvaran.
Anmärkning: formeln för beräkning av IgG-koncentration är följande:
CIgG = absorbans x utdöningskoefficient (13,7) x 1 000 μg/ml
- Sätt den extraherade IgG att torka i en ugn vid 60 ° c och bevara den extraherade IgG (300 μL extraherade IgG för 4 h).
- Ta bort 300 μL av extraherat IgG om koncentrationen är större än 1 000 μg/mL.
- Ta bort 350 μL extraherat IgG om koncentrationen är mellan 500-1000 μg/mL.
- Ta bort 400 μL av extraherat IgG om koncentrationen är mellan 200-500 μg/mL.
- Ta bort 600 μL av extraherat IgG om koncentrationen är mindre än 200 μg/mL.
Anmärkning: koncentrationen av IgG bör helst > 200 μg/mL för efterföljande detektion. Den genomsnittliga mängden IgG bör helst > 1200 μg, som kan testas 2x om det första testet misslyckas.
- Rengöring av protein G monolitisk plåt för återanvändning
- Tvätta plattan med 2 mL ultra-rent vatten, 1 mL 0,1 M NaOH (för avlägsnande av utfällda proteiner), 4 mL ultra-rent vatten och 4 mL 1x PBS (sekventiellt), ta sedan bort flytande vätska med hjälp av en vakuumpump.
- Tvätta plattan med 2 mL ultrarent vatten, 2 mL 30% propan-2-ol (för avlägsnande av bundet hydrofoba proteiner), 2 mL ultrarent vatten och 4 mL 1x PBS (sekventiellt), ta sedan bort flytande vätska med hjälp av en vakuumpump.
- Tvätta plattan med 1 mL buffert (20% etanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) och tillsätt 1 mL buffert (20% etanol + 20 mm Tris + 0,1 M NaCl) till plattan och lämna sedan plattan vid 4 ° c.
2. Glycan release
- Förbered den torkade IgG och förvara kemikalier inklusive 1,33% SDS, 4% Igepal (lagra bort från ljus), och 5x PBS vid RT.
- Bered PNGase F-enzymet genom att späda 250 U-enzymet med 250 μL ultrarent vatten.
- Denaturering av IgG
- Tillsätt 30 μL 1,33% SDS och blanda genom vortexing, överför provet till en 65 ° c ugn i 10 min, ta sedan bort den från ugnen och låt vila i 15 min.
- Tillsätt 10 μL 4% Igepal och placera det på skakande inkubator i 5 min.
- Avlägsnande och frisättning av glykaner
- Tillsätt 20 μL 5x PBS och 30-35 μL av 0,1 mol/L NaOH för att reglera ett pH på 8,0, och blanda genom vortexing. Tillsätt 4 μL PNGase F-enzym och blanda genom vortexing. Sedan Inkubera för 18-20 h i en 37 ° c vattenbad.
- Sätt de släppta innehåll att torka i en ugn vid 60 ° c för 2.5-3.0 h.
- Spara de frigivna glykanerna vid-80 ° c tills ytterligare mätning.
Obs: det här steget är kritiskt. Nyckeln till glykananalys release är att förbättra aktiviteten av PNGASE F enzym för att maximera dess effektivitet.
3. Glycan märkning och rening
- Förbered 2-aminobenzamid (2-AB) märkning reagens med 0,70 mg 2-AB, 10,50 μL av ättiksyra, 6 mg natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN), och 24,50 μl av dimetylsulfoxid (DMSO) (total volym = 35 μl). Tillsätt sedan ättiksyra, 2-AB, och NaBH3cn i DMSO i ordning.
- Märk glykanerna med 35 μL av 2-AB etiketteringsreagens, överför de märkta glykanerna till oscillatorn i 5 min, överför till ugnen i 3 h vid 65 ° c och överför sedan till RT i 30 minuter.
Anmärkning: hela glykananalys märkning steg måste utföras medan skyddas från ljus. - Pretreat en 0,2 μm GHP filter plåt med 200 μL av 70% etanol, 200 μL av ultra-rent vatten, och 200 μL av 96% acetonitril (4 ° c), sedan bort avfall med hjälp av en vakuumpump.
- Rening av 2-AB märkt glykananalys
- Tillsätt 700 μl av 100% acetonitril till 2-AB märkta glykananalys och överför till en skakning inkubator för 5 min.
- Centrifugera vid 134 x g i 5 min (4 ° c).
- Överför provet till en 0,2 μm GHP-filterplatta i 2 minuter och ta bort filtratet (flytande vätska) med hjälp av en vakuumpump.
- Tvätta 2-AB märkt glykananalys med 200 μl av 96% acetonitril (4 ° c) och ta bort filtratet (flytande vätska) med hjälp av en vakuumpump 5x-6x.
- Elute 2-AB märkt glykananalys med 100 μl Ultra-Pure Water 3x.
- Överför 2-AB märkta glykananalys i en ugn för att torka vid 60 ° c för 3,5 h.
- Spara den märkta N-glycans vid-80 ° c tills ytterligare mätning.
4. hydrofila interaktionskromatografi och analys av glykaner
- Konditionering av UPLC-instrument och förberedelse av rörliga faser
- Förbered mobila faser, inklusive lösningsmedel A: 100 mM ammoniumformat (pH = 4,4), spädningsvätska B: 100% acetonitril, lösningsmedel C: 90% Ultra-Pure Water (10% metanol) och spädningsvätska D: 50% metanol (Ultra-Pure Water).
- Öppna programvaran för att styra mobila faser.
- Tvätta UPLC-instrument vid flödeshastighet på 0,2 mL/min (50% spädningsvätska B och 50% lösningsmedel C) balansering för 30 min, sedan vid en flödeshastighet av 0,2 mL/min (25% lösningsmedel A och 75% lösningsmedel B) balansering för 20 min, sedan en flödeshastighet på 0,4 mL/min balansering.
- Lös upp de märkta N-glykanerna med 25 μl av en blandning av 100% acetonitril och ultrarent vatten vid ett 2:1-förhållande (v/v). Centrifugera sedan vid 134 × g i 5 min (4 ° c) och fyll på 10 μl av de märkta N-GLYKANERNA i UPLC-instrumenten.
- Separera den märkta N-glycans vid flödeshastighet på 0,4 ml/min med en linjär gradient på 75% till 62% acetonitril för 25 min. Utför sedan en analytisk körning med dextran kalibrerings stege/glycopeptide kolumn på en UPLC vid 60 ° c (här, prover hölls vid 4 ° c före injektion).
- Detektera N-Glycan fluorescens vid excitation och emissions våglängder på 330 nm respektive 420 nm.
- Integrera glykaner baserat på Peak position och retentionstid.
- Beräkna det relativa värdet för varje Glycan Peak (GP)/alla Glycan Peaks (GPs) (procent,%) enligt följande: GP1: GP1/GPs * 100, GP2: GP2/GPs * 100, GP3: GP3/GPs * 100, etc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som visas i figur 1, IgG N-glykaner analyserades i 24 initiala IgG glykananalys toppar (GPS) baserat på topp position och retentionstid. N-Glycan-strukturerna är tillgängliga genom masspektrometridetektering enligt en tidigare studie (tabell 1)15. För att säkerställa att resultaten var jämförbara tillämpades den totala normaliseringen av arealen, där mängden glykaner i varje topp uttrycks som en procentandel av det totala integrerade området.
För att bedöma metodens repeterbarhet och stabilitet testades standard provet parallellt sex gånger. Som framgår av tabell 2varierade variationskoefficienten (CV) för 24 GPS från 1,84%-16,73%, 15 (62,50%) som var lägre än 10%. GPs med relativt små proportioner (≤ 1,16%) uppvisade höga mätfel (mer än 10% av CV). Dessutom visade IgG N-Glycan profiler kombinerade från 76 individer (figur 2) att positionen för GP var stabil, form av GP var likartad, och integration för proverna behöll samma intervaller. Ovanstående resultat indikerar att metoden är stabil och repeterbar.
Som framgår av tabell 3beräknades ytterligare 36 härledda drag som beskriver den relativa förekomsten av galaktosylering, sialylering, bisekterande GlcNAc och kärnfukosylering av de återstående 24 direkt uppmätta glykanerna. Till exempel, G2/G0 (GP12/GP2) reflekterade nivån av galaktosylation (di-/a-) utan kärnfukosylering och bisekterande GlcNAc. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) reflekterade nivån av galaktosylering (di-/mono-) med kärnfukosylering och utan bisekterande GlcNAc. Slutligen, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) reflekterade nivån av galaktosylation (mono-/a-) med Core fucosylation och bisektera GlcNAc. Dessa beräkningar av härledda glykaner följer en princip, för att se förändringen av endast en glykosylering drag.
Figur 1: UPLC-kromatogram för en individ. IgG N-glykaner analyserades i 24 initiala IgG glykananalys Peaks (GPS) baserat på Peak position och retentionstid. GP8 representerar summan av GP 8a och GP 8b. GP16 representerar summan av GP 16a och GP 16b. Strukturen på glykaner i varje kromatografisk topp och den genomsnittliga andelen enskilda strukturer visas i tabell 1 och tabell 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: UPLC-kromatogram för 76 individer. IgG N-Glycan profiler kombinerades från 76 individer att demonstrera repeterbarhet och stabilitet av metoden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: uppbyggnad av de 24 initiala IgG-glykanerna. GP: glykananalys Peak; F: fucose; A: antal antenner som är knutna till kärnsekvensen (existerande av två Nacetylglukosamin (GlcNAc) och tre mannosrester); B: bisekterande GlcNac; G: galaktos; S: sialic syra. Struktur scheman definieras enligt följande: blå kvadrat: GlcNac; grön cirkel: mannos; röd triangel: kärna ur fucose/antennary fucose; gul cirkel: galaktos; lila Rhomb: sialic Acid.
| Glycan Peak | Medelvärde (SD) | CV (%) | Glycan Peak | Medelvärde (SD) | CV (%) |
| GP1 | 0,23 (0,017) | 7,28 | GP13 | 0,50 (0,043) | 8,64 |
| GP2 | 0,24 (0,034) | 13,97 | GP14 | 19,54 (0,36) | 1,84 |
| GP3 | 0,96 (0,16) | 16,73 | GP15 | 1,16 (0,14) | 11,63 |
| GP4 | 19,52 (0,58) | 2,98 | GP16 | 2,79 (0,19) | 6,93 |
| GP5 | 0,17 (0,024) | 13,86 | GP17 | 1,29 (0,13) | 9,78 |
| GP6 | 3,19 (0,26) | 8,22 | GP18 | 13,16 (0,51) | 3,85 |
| GP7 | 0,29 (0,033) | 11,51 | GP19 | 2,12 (0,21) | 9,76 |
| GP8 | 16,45 (0,62) | 3,77 | GP20 | 0,12 (0,018) | 14,91 |
| GP9 | 8,97 (0,52) | 5,74 | GP21 | 1,05 (0,17) | 16,09 |
| GP10 | 2,97 (0,22) | 7,34 | GP22 | 0,18 (0,025) | 14,16 |
| GP11 | 0,30 (0,041) | 13,82 | GP23 | 2,14 (0,14) | 6,45 |
| GP12 | 1,27 (0,026) | 2,08 | GP24 | 1,43 (0,13) | 9,12 |
Tabell 2: metodens precision. Standard provet testas parallellt sex gånger för att bedöma metodens repeterbarhet och stabilitet. CV: variationskoefficient; GP: Glycan Peak; SD: standard avvikelse.
| Härledda glykaner | Formler | Härledda glykaner | Formler |
| Galaktosylation | Fucosylation | ||
| G2/G0 | GP12/GP2 | F1/F0 | GP4/GP2 |
| GP14/GP4 | GP6/GP3 | ||
| GP15/GP6 | (GP8 + GP9)/GP7 | ||
| G2/G1 | GP12/GP7 | GP14/FGP12 | |
| GP14/(GP8 + GP9) | GP15/GP13 | ||
| GP15/(GP10 + GP11) | GP18/GP17 | ||
| G1/G0 | GP7/GP2 | GP23/GP21 | |
| (GP8 + GP9)/GP4 | GP24/GP22 | ||
| (GP10 + GP11)/GP6 | |||
| Sialylering | Bisektera GlcNAc | ||
| S2/S0 | GP21/GP12 | B1/B0 | GP3/GP2 |
| GP22/GP13 | GP6/GP4 | ||
| GP23/GP14 | (GP10 + GP11)/(GP8 + GP9) | ||
| GP24/GP15 | GP13/GP12 | ||
| S2/S1 | GP21/GP17 | GP15/GP14 | |
| GP23/GP18 | GP19/GP18 | ||
| GP24/GP19 | GP22/GP21 | ||
| S1/S0 | GP17/GP12 | GP24/GP23 | |
| GP18/GP13 | |||
| GP16/GP14 | |||
| GP19/GP15 | |||
Tabell 3: beräkning av de härledda glykanerna. GP: glykananalys Peak; F: fucose; B: bisekterande GlcNac; G: galaktos; S: sialic syra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UPLC fungerar som en relativ kvantitativ analysmetod5,15. Resultaten indikerar att UPLC är en stabil detektionsteknik med god reproducerbarhet och relativ kvantitativ noggrannhet. Mängden glykaner i varje topp uttrycks som en procentandel av det totala integrerade området med hjälp av UPLC, vilket är det relativa värdet. Den relativa kvantifieringen förbättrar jämförbarheten av testprover. Dessutom, 96 well protein G plattor används för att rena IgG med 96 prover på en gång för hög genomströmning upptäckt. Protein G-proteiners förmåga att binda IgG är större än proteinet A, vilket beskrivs i tidigare studier15,16.
Dessutom är strukturerna för IgG N-glykan tydligt åtskilda. De härledda IgG-glykanerna beskriver nivån av galaktosylering, sialylering, bisekterande GlcNAc och kärnfukosylering, som beräknas av de initiala IgG N-glykaner. I en tidigare studie var vissa härledda glykaner (FBn, FBG0n /G0n, FBn /FnSammanlagd, Bn /(Fn + FBn), FBG2n /FG2n, FG2n /(BG2n + FBG2n), BG2n /(FG2n + FBG2n)) kunde återspegla förändringen i flera glykosyleringsnivåer men återspeglar inte nivån av specifik glykosylering15.
Nyligen, en storskalig studie visade att IgG galaktosylation (kallad gal-ratio) kan fungera som en lovande biomarkör för cancerscreening i flera cancertyper17. Fördelningen av IgG galaktosylation mäts genom att beräkna de relativa intensiteterna av agalactosylated (G0) vs. monogalactosylated (G1) och Digalactosylated (G2) N-glycans enligt formeln (G0/[G1 + G2 x 2]). Den gal-förhållandet återspeglar nivån av galaktosylation med kärna fucosylation och utan att bisektera GlcNAc. Därför, flera initiala IgG N-glykaner kombinerades med en härledd glykan, som representerar nivån av en specifik glykosylering drag. Beräkningarna av härledda glykaner följer en princip som utforskar förändringarna i endast en glykosylering drag fast över andra glykosylering drag.
I detta protokoll är pH viktigt för att bibehålla stabiliteten i IgG och glykananalys strukturer, särskilt för att stabilisera Terminal sialylation. Därför måste lösningens pH-värde kontrolleras strängt och pH-värdet hos den lösning som exponeras för IgG måste återställas, liksom glykaner som hålls på en neutral pH-nivå. Dessutom är glykananalys release steg kritisk i detta protokoll. Nyckeln till glykananalys release är att förbättra aktiviteten av PNGASE F enzym för att maximera dess effektivitet. Det konstaterades till exempel att 18-20 h är optimalt för PNGaseF-nedbrytning. Detta steg måste reagera fullt ut.
Det finns vissa begränsningar av denna teknik. Den metod som används kan inte differentiera glykaner som frigörs från fab och FC-delarna av IgG. Glycans från fab och FC är kända för att vara olika. Med utvecklingen i glykoproteomik, detektionstekniker kan mäta nivåerna av IgG kombinera n-glykaner att utforska rollen av IgG n-glykaner och N-glykosylering i sjukdomar. Kostnaden för utrustning är relativt låg; kostnaden per prov är dock ganska hög.
Sammanfattnings, detta protokoll introducerar UPLC så att den kan användas i stor utsträckning. Omfattande värdering och standardisering av analysmetoderna behövs innan betydande mängder tid och resurser investeras i storskaliga studier. Som UPLC blir mer allmänt används, effekterna av IgG n-glykaner och n-glykosylering på vissa sjukdomar kan vara mer exakt bestäms, och glykosylering biomarkörer kan användas för kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (81673247 & 81872682) och australiska-Kina Collaborative Grant (NH & MRC-APP1112767-NSFC 81561128020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminobenzamide, 2-AB | Sigma, China | ||
| 96-well collection plate | AXYGEN | ||
| 96-well filter plate | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-well monolithic plate | BIA Separations | ||
| 96-well plate rotor | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Acetic acid | Sigma, China | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Ammonium formate | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Constant shaking incubator/rocker | Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column | Watts technology Co., Ltd, China | BEH column | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma, China | ||
| Disodium phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Electric ovens | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Formic acid | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Labeling kit | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| High-speed centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Low temperature centrifuge | Eppendorf Co., Ltd, Germany | ||
| Low temperature refrigerator | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96-well plate | Watts technology Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Methanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Milli-Q pure water meter | Millipore Co., Ltd, America | Advantage A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| PH tester | Sartorius Co., Ltd, Germany | PB-10 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipette | Eppendorf Co., Ltd, Germany | 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl | |
| PNGase F enzyme | Sigma, China | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Sodium chloride | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Spectrophotometer | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Transfer liquid gun | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, America | ||
| Ultra-low temperature refrigerator | Thermo Co., Ltd, America | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Ultra-performance liquid chromatography | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Vacuum Pump | Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Volatilizing machine/Dryer | Eppendorf Co., Ltd, Germany | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Water-bath | Tester instruments Co., Ltd | DK-98-IIA | |
| Weighing balance | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
References
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
- Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
- Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
- Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
- Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
- Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
- Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
- Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
- Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
- Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
- Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
- Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
- Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
- Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
