Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

doi: 10.3791/60104 Published: January 18, 2020
* These authors contributed equally

Summary

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Abstract

Glycomics hastalık yatkınlığı, ilaç hedef keşif ve hassas tıp için yeni nesil biyobelirteçler keşfetmek önemli bir potansiyel sunan omics sistem araştırmayeni bir alt uzmanlık olduğunu. Alternatif IgG N-glikanlar çeşitli yaygın kronik hastalıklarda bildirilmiştir ve klinik uygulamalarda büyük potansiyele sahip olduğu ileri sürülmüştür (yani, hastalıkların tanı ve tahmini için biyobelirteçler). IgG N-glikanlar hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) ultra-performanslı sıvı kromatografisi (UPLC) yöntemi kullanılarak yaygın olarak karakterize edilir. UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek göreli kantitatif doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisidir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır, ve glikan bileşimi ve plazmada göreceli bolluk karakterizedir.

Introduction

N-insan proteinlerinin glikozilasyon yaygın ve temel post-translational modifikasyon1 ve nispeten doğru hastalıkların oluşumu ve gelişimini tahmin yardımcı olabilir. Yapısının karmaşıklığı nedeniyle, 5.000'den fazla glikan yapısı olması beklenmektedir, hastalıklar için tanısal ve tahmine dayalı biyobelirteçler olarak büyük bir potansiyel sağlayan2. N -glikanlar immünglobulin G bağlı (IgG) IgG fonksiyonu için gerekli olduğu gösterilmiştir, ve IgG N-glikozilasyon pro- ve anti-inflamatuar sistemler arasındaki dengeye katılır3. Diferansiyel IgG N-glikozilasyon hastalık gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar ve hastalık patolojisinde yer alan yatkınlık ve fonksiyonel mekanizmayı temsil emdir. IgG N-glikozilasyon inflamatuar rolü yaşlanma ile ilişkili olmuştur, inflamatuar hastalıklar, otoimmün hastalıklar, ve kanser4.

Algılama teknolojisinin geliştirilmesi ile, aşağıdaki yöntemler en yaygın olarak yüksek iş yapma glycomics kullanılır: hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) floresan saptama ile ultra-performans sıvı kromatografisi (UPLC-FLR), lazer indüklenen flor ile multipleks kapiller jel elektroforezi eskuss algılama (xCGE-LIF), matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon zaman-of-flight kütle spektrometresi (MALDI-TOF-MS) ve sıvı kromatografi elektrosprey kütle spektrometresi (LC-ESI-MS) . Bu yöntemler düşük akı önceki eksiklikleri aşmak var, kararsız sonuçlar, ve kötü duyarlılık özgüllüğü5,6.

UPLC yaygın IgG N-glikozilasyon ve bazı hastalıklar arasındaki ilişkiyi keşfetmek için kullanılır (yani, yaşlanma7, obezite8, dislipidemi9, tip II diyabet10, hipertansiyon11, iskemik inme12, ve Parkinson hastalığı13). Yukarıda belirtilen diğer üç yöntemle karşılaştırıldığında, UPLC aşağıdakiavantajlarasahiptir 5,14. İlk olarak, göreceli bir nicel analiz yöntemi sağlar ve toplam alan normalleştirme içeren veri analizi her örnek karşılaştırılabilirliğini artırır. İkinci olarak, ekipman maliyeti ve gerekli uzmanlık nispeten düşüktür, bu da glikozilasyon biyobelirteçlerinin klinik uygulamalara uygulanmasını ve dönüştürülmesini kolaylaştırır. Daha yaygın olarak kullanılabilir böylece Burada Sunulan UPLC bir giriştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokolde yer alan tüm konular Sermaye Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır, Pekin, Çin12. Çalışmanın başında her konudan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

1. IgG izolasyon

  1. Bağlayıcı tampon (fosfat tamponlu salin, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), nötralize tampon: 10x PBS (pH = 6.6-6.8), elüent: 0.1 M formik asit (pH = 2.5), elüent için çözelti nötralize: 1 ammonium bikarbonat, depolanan% 20: etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), protein G için temizleme çözeltisi: 0.1 M NaOH + %30 propan-2-ol.
    NOT: Bu protokolde pH düzeyi çok önemlidir. IgG elution çok düşük pH gerektirir, ve asit hidroliz nedeniyle siyalik asit kaybı riski vardır. Bu nedenle, elüsasyon saniye içinde gerçekleşir ve pH hızla nötrlüğe geri, IgG ve siyalik asitlerin bütünlüğünü koruyarak.
  2. Örnekleri hazırlayın: Dondurulmuş plazma örneğini eritin ve 80 x g'de 10 dakika santrifüj edin ve Protein G monolitik plakayı ve yukarıda bahsedilen kimyasalları oda sıcaklığında 30 dakika (RT) bırakın.
  3. 100 μL'lik bir numuneyi (ilk arızayı önlemek için 2x'i tespit etmek için kullanılabilir) 2 mL'lik bir toplama plakasına (burada toplam altı standart numune, bir kontrol numunesi [ultra saf su] ve 89 plazma numunesi 96 kuyu plakası için tasarlanmış ve rasgele atanmış plakaya).
  4. Numuneleri 1x PBS ile 1:7 (v/v) seyreltin.
  5. 0,45 μm hidrofilik polipropilen (GHP) filtre plakası 200 μL ultra saf su ile temizleyin (tekrar 2x).
  6. Seyreltilmiş numuneleri filtre plakasına aktarın ve numuneleri vakum pompası (266.6-399.9 Pa kontrol vakum basıncı) kullanarak toplama plakasına süzün.
  7. Protein G monolitik plakaların hazırlanması
    1. Depolama arabelleği atın.
    2. Monolitik plakaları 2 mL ultra saf su, 2 mL 1x PBS, 1 mL 0,1 M formik asit, 2 mL 10x PBS, 2 mL 1x PBS (sıralı) ile temizleyin ve vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.
  8. Filtrelenmiş numuneleri IgG bağlama ve temizleme için G monolitik proteinine aktarın, ardından monolitik plakaları 2 mL 1x PBS ile temizleyin (temizleme 2x'i tekrarlayın).
  9. 1 mL 0,1 M formik asit içeren Elute IgG ve vakum pompası ile numuneleri toplama plakasına süzün, ardından toplama plakasına 170 μL amonyum bikarbonat ekleyin.
  10. Bir soğurma spektrofotometre (optimal dalga boyu = 280 nm) kullanarak IgG konsantrasyonu algıla.
    1. Yazılımı açın ve protein-CY3 modunu seçin.
    2. 2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ekranı temizlemek için yazılımdaki Boş'a tıklayın (tekrarlayın 1x).
    3. 2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ultra saf suyu algılamak için yazılımdaki Örnek'e tıklayın.
    4. 2 μL IgG numunesi çizin ve ekrana yükleyin, ardından örneği algılamak için yazılımdaki Örnek'e tıklayın.
    5. 2 μL ultra saf su çekin ve ekrana yükleyin, ardından ekranı temizlemek için yazılımdaki Boş'a tıklayın.
    6. Yazılımı kapatın.
      NOT: IgG konsantrasyonunu hesaplamaformülü aşağıdaki gibidir:

      CIgG = absorbans x yok olma katsayısı (13.7) x 1.000 μg/mL
  11. Çıkarılan IgG'yi 60 °C'de bir fırında kurumaya koyun ve çıkarılan IgG'yi (300 μL çıkarılmış IgG'yi 4 saat boyunca) koruyun.
    1. Konsantrasyon 1.000 μg/mL'den büyükse 300 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.
    2. Konsantrasyon 500-1.000 μg/mL arasında ysa 350 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.
    3. Konsantrasyon 200-500 μg/mL arasındaysa 400 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.
    4. Konsantrasyon 200 μg/mL'den küçükse 600 μL çıkarılan IgG'yi çıkarın.
      NOT: İG konsantrasyonu tercihen >200 μg/mL olmalıdır. İlk testin başarısız olması durumunda 2 kat test edilebilen ortalama IgG miktarı tercihen >1200 μg olmalıdır.
  12. Yeniden kullanım için G monolitik plaka proteininin temizlenmesi
    1. Plakayı 2 mL ultra saf su, 1 mL 0,1 M NaOH (çökelmiş proteinleri çıkarmak için), 4 mL ultra saf su ve 4 mL 1x PBS (sırayla) ile yıkayın, ardından vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.
    2. Plakayı 2 mL ultra saf su, 2 mL %30 propan-2-ol (bağlı hidrofobik proteinlerin alınması için), 2 mL ultra saf su ve 4 mL 1x PBS (sıralı) ile yıkayın, ardından vakum pompası kullanarak akan sıvıyı çıkarın.
    3. Plakayı 1 mL tamponla yıkayın (%20 etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) ve 1 mL tampon (%20 etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) ekleyin ve plakayı 4 °C'de bırakın.

2. Glikan salınımı

  1. Kurutulmuş IgG'yi hazırlayın ve %1,33 SDS, %4 Igepal (ışıktan uzak saklayın) ve RT'de 5x PBS gibi kimyasalları saklayın.
  2. 250 U enzimini 250 μL ultra saf su ile seyrelterek PNGase F enzimini hazırlayın.
  3. IgG'nin denatürasyonu
    1. %1,33 SDS'nin 30 μL'sini ekleyin ve girdap yaparak karıştırın, numuneyi 10 dk boyunca 65 °C'lik bir fırına aktarın, sonra fırından çıkarın ve 15 dk dinlendirin.
    2. % 4 Igepal 10 μL ekleyin ve 5 dakika boyunca sallayarak kuvöz üzerine yerleştirin.
  4. Glikanların çıkarılması ve serbest bırakılması
    1. 8.0 pH'ı düzenlemek için 20 μL 5x PBS ve 30-35 μL 0.1 mol/L NaOH ekleyin ve girdap ile karıştırın. 4 μL PNGase F enzimi ekleyin ve girdap ile karıştırın. Daha sonra, 37 °C su banyosunda 18-20 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Serbest bırakılan glikanları 60 °C'de 2,5-3,0 saat kurumaya koyun.
    3. Serbest bırakılan glikanları daha fazla ölçümede kadar -80 °C'de saklayAbilirsiniz.
      NOT: Bu adım önemlidir. Glikan salınımının anahtarı, etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için PNGase F enziminin aktivitesini artırmaktır.

3. Glikan etiketleme ve arınma

  1. 2-aminobenzamid (2-AB) etiketleme reaktifini 0,70 mg 2-AB, 10,50°L asetik asit, 6 mg sodyum siyanoborohidrit (NaBH3CN) ve 24,50 μL dimetil sülfoksit (DMSO) (toplam hacim = 35 μL) hazırlayın. Sonra, sırayla DMSO içine asetik asit, 2-AB ve NaBH3CN ekleyin.
  2. Glikanları 35 μL 2-AB etiketleme reaktifi kullanarak etiketlayın, etiketli glikanları 5 dakika boyunca osilatöre aktarın, 65 °C'de 3 saat fırına aktarın, ardından 30 dakika RT'ye aktarın.
    NOT: Glikan etiketleme adımının tamamı ışıktan korunurken yapılmalıdır.
  3. %70 etanol 200 μL, ultra saf su 200 μL ve %96 asetonitril (4 °C) 200 μL'lik 0,2 μm GHP filtre plakası koyun ve vakum pompası kullanarak atıkları çıkarın.
  4. 2-AB etiketli glikan arınması
    1. 2-AB etiketli glisan'a 700°L %100 asetonitil ekleyin ve 5 dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine aktarın.
    2. Santrifüj 134 x g 5 dk (4 °C) için.
    3. Numuneyi 2 dk boyunca 0,2 m GHP filtre plakasına aktarın ve vakum pompası kullanarak filtrasyon (akan sıvı) çıkarın.
  5. 2-AB etiketli glian %96 asetonitril (4 °C) ile yıkayın ve 5x-6x vakum pompası kullanarak filtrat (akan sıvı) çıkarın.
  6. 100 μL ultra saf su 3x ile Elute 2-AB etiketli glikan.
  7. 2-AB etiketli glian'ı fırına aktarArak 60 °C'de 3,5 saat kurulayın.
  8. Etiketli N-glikanları -80 °C'de daha fazla ölçüme kadar saklayAbilirsiniz.

4. Hidrofilik etkileşim kromatografisi ve glikan analizi

  1. UPLC cihazlarının kondisyon ve mobil aşamaların hazırlanması
    1. Solvent A: 100 mM amonyum formatı (pH = 4.4), çözücü B: %100 asetonitril, çözücü C: %90 ultra saf su (%10 metanol) ve çözücü D: %50 metanol (ultra saf su) dahil olmak üzere mobil fazlar hazırlayın.
    2. Mobil aşamaları kontrol etmek için yazılımı açın.
    3. UPLC aletleri 0,2 mL/dk akış hızında yıkayın (%50 solvent B ve %50 solvent C) 30 dakika, ardından 0,2 mL/dk akış hızında (%25 solvent A ve %75 solvent B) 20 dk, ardından 0,4 mL/dk dengeleme akış hızı.
  2. Etiketli N-glikanları %100 asetonitril ve ultra saf su karışımının 25 μL'si ile 2:1 oranında (v/v) çözün. Daha sonra, 5 dakika (4 °C) için 134 × g santrifüj ve UPLC aletleri içine etiketli N-glikanlar 10 μL yükleyin.
  3. Etiketli N-glikanları 0,4 mL/dk akış hızıyla %75 ila %62 asetonitril ile 25 dakika boyunca ayırın. Daha sonra, 60 °C'de bir UPLC üzerinde dekstran kalibrasyon merdiveni/glikopeptid kolonu ile analitik bir çalışma gerçekleştirin (burada, numuneler enjeksiyondan önce 4 °C'de tutuldu).
  4. Sırasıyla 330 nm ve 420 nm uyarma ve emisyon dalga uzunluklarında N-glikan floresanını saptamak.
  5. Glikanları en yüksek pozisyona ve bekletme süresine göre entegre edin.
  6. Her Glikan Zirvesinin (GP)/ tüm Glikan Zirvelerinin (GP) göreli değerini hesaplama (yüzde, %) aşağıdaki gibidir: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, vb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1'degösterildiği gibi, IgG N-glikanlar pik pozisyon ve tutma süresine göre 24 ilk IgG glikan piki (GPs) olarak analiz edildi. N-glikan yapıları bir önceki çalışmaya göre kütle spektrometresi tespiti ile kullanılabilir (Tablo 1)15. Sonuçların karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için, her tepedeki glikan miktarının toplam entegre alanın yüzdesi olarak ifade edildiği toplam alan normalizasyonu uygulandı.

Yöntemin tekrarlanabilirliğini ve kararlılığını değerlendirmek için standart örnek altı kez paralel olarak test edildi. Tablo 2'degösterildiği gibi, 24 GPs'nin varyasyon katsayısı (CV) %1,84-%16,73, 15 (%62,50) arasında değişmektedir. bunların %10'unun altındaydı. Nispeten küçük oranlarda pratisyen hekimler (≤1.16%) yüksek ölçüm hataları (CV'nin %10'undan fazlası) gösterdi. Buna ek olarak, 76 bireyden(Şekil 2)alınan IgG N-glikan profilleri GP'nin konumunun stabil olduğunu, GP'nin şeklinin benzer olduğunu ve numuneler için entegrasyonun aynı aralıklarla devam ettiğini göstermiştir. Yukarıdaki sonuçlar yöntemin kararlı ve yinelenebilir olduğunu göstermektedir.

Tablo 3'tegösterildiği gibi, galaktosilasyon, sialiletion, bisecting GlcNAc ve çekirdek fukozilasının göreli bolluklarını açıklayan ek 36 türemiş özellik, kalan 24 doğrudan ölçülen glikan lar tarafından hesaplanmıştır. Örneğin, G2/G0 (GP12/GP2) çekirdek fukozilasyon ve glcNAc bisecting olmadan galaktosilasyon (di-/a-) düzeyini yansıtıyordu. G2/G1 (GP14/[GP8 + GP9]) çekirdek fukozi ile ve glcNAc ikiye ayırmadan galaktosilasyon (di-/mono-) düzeyini yansıtıyordu. Son olarak, G1/G0 ([GP10 + GP11]/GP6) çekirdek fukozilasi ve iki bölen GlcNAc ile galaktosilasyon (mono-/a-) düzeyini yansıtıyordu. Türetilmiş glikanların bu hesaplamaları, sadece bir glikozilasyon özelliğinin değişimini görmek için bir ilke izler.

Figure 1
Şekil 1: Bir bireyin UPLC kromatogramı. IgG N-glikanlar pik pozisyon ve tutma süresine göre 24 ilk IgG glikan pik (GP) içine analiz edildi. GP8 GP 8a ve GP 8b toplamını temsil eder. GP16 GP 16a ve GP 16b toplamı temsil eder. Her kromatografik tepedeki glikanların yapısı ve tek tek yapıların ortalama yüzdesi Tablo 1 ve Tablo 2'degösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 76 kişilik UPLC kromatogramı. IgG N-glikan profilleri 76 kişiden birleşerek yöntemin tekrarlanabilirliğini ve stabilitesini gösterdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Table 1
Tablo 1: 24 ilk IgG glikan yapısı. GP: glikan tepe; F: fucose; C: çekirdek dizilimine bağlı anten sayısı (iki NAcetylglucosamine (GlcNAc) ve üç mannose kalıntısı mevcut); B: glcNac ikiye bölen; G: galaktoz; S: siyalik asit. Yapısal şemalar aşağıdaki gibi tanımlanır: mavi kare: GlcNac; yeşil daire: mannose; kırmızı üçgen: core fucose / anten fucose; sarı daire: galaktoz; mor rhomb: siyalik asit.

Glikan tepe Ortalama (SD) CV (%) Glikan tepe Ortalama (SD) CV (%)
GP1 0.23 (0.017) 7.28 GP13 0.50 (0.043) 8.64
GP2 0.24 (0.034) 13.97 GP14 19.54 (0.36) 1.84
GP3 0.96 (0.16) 16.73 GP15 1.16 (0.14) 11.63
GP4 19.52 (0.58) 2.98 GP16 2.79 (0.19) 6.93
GP5 0.17 (0.024) 13.86 GP17 1.29 (0.13) 9.78
GP6 3.19 (0.26) 8.22 GP18 13.16 (0.51) 3.85
GP7 0.29 (0.033) 11.51 GP19 2.12 (0.21) 9.76
GP8 16.45 (0.62) 3.77 GP20 0.12 (0.018) 14.91
GP9 8.97 (0.52) 5.74 GP21 1.05 (0.17) 16.09
GP10 2.97 (0.22) 7.34 GP22 0.18 (0.025) 14.16
GP11 0.30 (0.041) 13.82 GP23 2.14 (0.14) 6.45
GP12 1.27 (0.026) 2.08 GP24 1.43 (0.13) 9.12

Tablo 2: Yöntemin hassasiyeti. Standart örnek, yöntemin tekrarlanabilirliğini ve kararlılığını değerlendirmek için altı kez paralel olarak test edilir. CV: Değişim Katsayısı; GP: Glikan tepe; SD: Standart sapma.

Türetilmiş glikanlar Formül Türetilmiş glikanlar Formül
Galaktosilasyon Fukozillasyon
G2/G0 GP12/GP2 F1/F0 GP4/GP2
GP14/GP4 GP6/GP3
GP15/GP6 (GP8+ GP9)/GP7
G2/G1 GP12/GP7 GP14/FGP12
GP14/(GP8+ GP9) GP15/GP13
GP15/(GP10+ GP11) GP18/GP17
G1/G0 GP7/GP2 GP23/GP21
(GP8+ GP9)/GP4 GP24/GP22
(GP10+ GP11)/GP6
Sialylation İkie bölen GlcNAc
S2/S0 GP21/GP12 B1/B0 GP3/GP2
GP22/GP13 GP6/GP4
GP23/GP14 (GP10+GP11)/ (GP8+ GP9)
GP24/GP15 GP13/GP12
S2/S1 GP21/GP17 GP15/GP14
GP23/GP18 GP19/GP18
GP24/GP19 GP22/GP21
S1/S0 GP17/GP12 GP24/GP23
GP18/GP13
GP16/GP14
GP19/GP15

Tablo 3: Türetilmiş glikanların hesaplanması. GP: glikan tepe; F: fucose; B: glcNac ikiye bölen; G: galaktoz; S: siyalik asit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

UPLC göreceli nicel analizyöntemi5,15olarak hizmet vermektedir. Sonuçlar UPLC iyi tekrarlanabilirlik ve göreceli nicel doğruluk ile istikrarlı bir algılama teknolojisi olduğunu göstermektedir. Her tepedeki glikan miktarı, göreli değer olan UPLC kullanılarak toplam tümleşik alanın yüzdesi olarak ifade edilir. Göreli nicelik, test örneklerinin karşılaştırılabilirliğini artırır. Buna ek olarak, 96 iyi protein G plakaları yüksek iş lenme tespiti için bir seferde 96 örnek ile IgG arındırmak için kullanılır. Protein G'nin IgG'yi bağlama yeteneği, önceki çalışmalarda açıklandığı gibi A proteininden daha büyüktür15,16.

Buna ek olarak, IgG N-glikan yapıları açıkça ayrılır. Türetilmiş IgG glikanlar galaktosilasyon düzeyini tanımlar, sialylation, glcNAc ikiye bölen, ve çekirdek fukozilas, ilk IgG N-glikanlar tarafından hesaplanır. Bir önceki çalışmada, bazı türetilmiş glikanlar (FBn, FBG0n / G0n, FBn / Fntotal, Bn / (Fn + FBn), FBG2n / FG2n, FG2n / (BG2n + FBG2n), BG2n / (FG2n + FBG2n)) birden fazla glikozilasyon düzeylerindeki değişimi yansıtabildi ama glisilasyon seviyesini yansıtmadı15.

Son zamanlarda, büyük ölçekli bir çalışma igG galaktosilasyon gösterdi (Gal-oranı olarak anılacaktır) birden fazla kanser türleri kanser taraması için umut verici bir biyomarker olarak hizmet verebilir17. IgG galaktosilasyondağılımı, agalaktosileted (G0) ile monogalaktosileted (G1) ve digalaktosileted (G2) N-glikanların formüle göre göreceli yoğunlukları (G0/[G1 + G2 x 2]) hesaplanarak ölçülür. Gal oranı, glcNAc'ı ikiye ayırmadan çekirdek fukozilası ile galaktosilasyon seviyesini yansıtır. Bu nedenle, birden fazla ilk IgG N-glikan türetilmiş glikan ile kombine edildi, belirli bir glikozilasyon özelliği düzeyini temsil eden. Türetilmiş glikanların hesaplamaları, diğer glikozilasyon özelliğine göre sabitlenmiş tek bir glikozilasyon özelliğindeki değişiklikleri inceleyen bir ilkeyi izler.

Mevcut protokolde, pH, özellikle terminal siallasyonunun stabilizasyonu için IgG ve glikan yapıların stabilitesini korumak için önemlidir. Bu nedenle çözeltinin pH değeri sıkı bir şekilde kontrol edilmeli ve IgG'ye maruz kalan çözeltinin pH değeri geri yüklenmeli ve glikanlar nötr pH seviyesinde tutulmalıdır. Buna ek olarak, glikan salınım adımı bu protokolde önemlidir. Glikan salınımının anahtarı, etkinliğini en üst düzeye çıkarmak için PNGase F enziminin aktivitesini artırmaktır. Örneğin, 18-20 saat PNGaseF sindirim için en uygun olduğu bulunmuştur. Bu adımın tam olarak tepki verilmesi gerekiyor.

Bu tekniğin bazı sınırlamaları vardır. Kullanılan yöntem, Fab ve IgG'nin Fc kısımlarından salınan glikanları ayırt edemez. Fab ve Fc'den glikanların farklı olduğu bilinmektedir. Glikoproteomikgelişmeler ile, algılama teknikleri igG N-glikanlar ve N-glikozilasyon hastalıklarındaki rolünü keşfetmek için N-glikanlar birleştirerek IgG düzeylerini ölçebilirsiniz. Ekipman maliyeti nispeten düşüktür; ancak, örnek başına maliyet oldukça yüksektir.

Özetle, bu protokol yaygın olarak kullanılabilen UPLC'yi tanıtır. Büyük ölçekli çalışmalara önemli miktarda zaman ve kaynak yatırımı yapIlmeden önce analitik yöntemlerin kapsamlı değerlemeve standardizasyonuna ihtiyaç vardır. UPLC daha yaygın olarak kullanılmaya başladıkça, IgG N-glikanve N-glikozilasyonun bazı hastalıklar üzerindeki etkileri daha doğru bir şekilde belirlenebilir ve klinik uygulamalarda glikozilasyon biyobelirteçleri kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81673247 & 81872682) ve Avustralya-Çin İşbirlikçi Hibe (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-aminobenzamide, 2-AB Sigma, China
96-well collection plate AXYGEN
96-well filter plate Pol 0.45 um GHP
96-well monolithic plate BIA Separations
96-well plate rotor Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Acetic acid Sigma, China
Acetonitrile Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Ammonium bicarbonate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Ammonium formate Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Constant shaking incubator/rocker Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, China ZWY-10313
Dextran Calibration Ladder/Glycopeptide column Watts technology Co., Ltd, China BEH column
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma, China
Disodium phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Electric ovens Tester instruments Co., Ltd 202-2AB
Empower 3.0 Waters technology Co., Ltd, America
Ethanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Formic acid Sigma, China
GlycoProfile 2-AB Labeling kit Sigma, China
HCl Junrui Biotechnology Co., Ltd, China
High-speed centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany 5430
Igepal Sigma, China
Low temperature centrifuge Eppendorf Co., Ltd, Germany
Low temperature refrigerator Qingdao Haier Co., Ltd
Manifold 96-well plate Watts technology Co., Ltd, China 186001831
Methanol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
Milli-Q pure water meter Millipore Co., Ltd, America Advantage A10
NaOH Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
PH tester Sartorius Co., Ltd, Germany PB-10
Phosphate buffered saline, PBS Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Pipette Eppendorf Co., Ltd, Germany 4672100, 0.5-10μl & 10-100μl & 20-200μl & 1000μl
PNGase F enzyme Sigma, China
Potassium dihydrogen phosphate Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Propan-2-ol Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China
SDS Sigma, China
Sodium chloride Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma, China
Spectrophotometer Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd B-500
Transfer liquid gun Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China 4672100
Tris Amresco, America
Ultra-low temperature refrigerator Thermo Co., Ltd, America MLT-1386-3-V; MDF-382E
Ultra-performance liquid chromatography Watts technology Co., Ltd, China Acquity MLtraPerformance LC
Vacuum Pump Watts technology Co., Ltd, China 725000604
Volatilizing machine/Dryer Eppendorf Co., Ltd, Germany T_1087461900
Vortex Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China NP-30S
Water-bath Tester instruments Co., Ltd DK-98-IIA
Weighing balance Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. MP200B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214 (2012).
  2. Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21, (1), (2014).
  3. Shade, K. T. C., Anthony, R. M. Antibody Glycosylation and Inflammation. Antibodies. 2, 392 (2013).
  4. Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases. Cellular Immunology. 333, 65 (2018).
  5. Huffman, J. E., et al. Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research. Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598 (2014).
  6. Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform. Analytical Chemistry. 85, 8841 (2013).
  7. Kristic, J., et al. Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779 (2014).
  8. Nikolac, P. M., et al. The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index. Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20 (2014).
  9. Liu, D., et al. The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia. Journal of Translational Medicine. 16, 235 (2018).
  10. Lemmers, R., et al. IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations. Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240 (2017).
  11. Wang, Y., et al. The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study. Medicine (Baltimore). 95, e3379 (2016).
  12. Liu, D., et al. Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G. Journal of Neuroinflammation. 15, 123 (2018).
  13. Russell, A. C., et al. The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease. GLYCOBIOLOGY. 27, 501 (2017).
  14. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Analytical Chemistry. 82, 10208 (2010).
  15. Pucic, M., et al. High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations. Molecular Cellular Proteomics. 10, M111 (2011).
  16. Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95 (2000).
  17. Ren, S., et al. Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types. Cell Research. 26, 963 (2016).
Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).More

Liu, D., Xu, X., Li, Y., Zhang, J., Zhang, X., Li, Q., Hou, H., Li, D., Wang, W., Wang, Y. Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60104, doi:10.3791/60104 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter