JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

مؤشرات سينابس واحدة من الإفراج عن الغلوتامات والابوجدافي في شرائح الدماغ الحادة من الفئران العادية وهنتنغتون

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

نقدم بروتوكولا لتقييم التوازن بين الإفراج عن الغلوتامات وإزالة في المشابك الجلوتامات القشرية واحدة في شرائح حادة من الفئران البالغة. يستخدم هذا البروتوكول مستشعر الفلورسنت iGluu للكشف عن الغلوتامات ، وكاميرا sCMOS للحصول على الإشارة وجهاز لإضاءة الليزر البؤري.

Abstract

نقاط الاشتباك العصبي هي وحدات وظيفية مجزأة للغاية تعمل بشكل مستقل على بعضها البعض. في مرض هنتنغتون (HD) وغيرها من الاضطرابات العصبية التنكسية، قد يتعرض هذا الاستقلال للخطر بسبب عدم كفاية إزالة الغلوتامات وما ينتج عن ذلك من آثار الانسكاب والتسرب. وقد تورطت التغطية الفلكية المتغيرة للمحطات الطرفية presynaptic و / أو العمود الفقري التشجرات ، فضلا عن انخفاض حجم مجموعات نقل الغلوتامات في مواقع الإفراج الغلوتامات في الإمراض من الأمراض مما أدى إلى أعراض dys -/hyperkinesia. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تؤدي إلى خلل في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتامات في HD ليست مفهومة جيدا. تحسين وتطبيق التصوير المشبك حصلنا على بيانات تسليط ضوء جديد على الآليات التي تعوق بدء الحركات. هنا، ونحن نصف العناصر الرئيسية لنهج غير مكلفة نسبيا لتحقيق قرار واحد المشبك باستخدام جديدة مشفرة وراثيا ultrafast الغلوتامات الاستشعار iGluش،البصريات واسعة المجال، وCMOS العلمية (sCMOS) الكاميرا، ليزر 473 نانومتر ونظام تحديد المواقع بالليزر لتقييم حالة المشابك القشرية في شرائح حادة من العمر مناسبة الفئران صحية أو المريضة. تم بناء العابرين الغلوتامات من بكسل واحد أو متعددة للحصول على تقديرات ط) الإفراج الغلوتامات على أساس الارتفاع الأقصى لتركيز الغلوتامات [غلو] بجانب المنطقة النشطة وii) الغلوتامات المنعكسة في الوقت الثابت من الاضمحلال (TauD) من perisynaptic [Glu]. الاختلافات في حجم النوبة يستريح وأنماط متناقضة من اللدونة على المدى القصير بمثابة معايير لتحديد المحطات القشرية على أنها تنتمي إلى داخل telencephalic (IT) أو مسار المسار الهرمي (PT). باستخدام هذه الأساليب، اكتشفنا أن في الفئران HD أعراض ~ 40٪ من نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكوستريا من نوع PT أظهرت إزالة الغلوتامات غير كافية، مما يشير إلى أن هذه نقاط الاشتباك العصبي قد تكون في خطر للضرر excitotoxic. النتائج تؤكد فائدة TauD كعلامة بيولوجية من نقاط الاشتباك العصبي المختلة في الفئران هنتنغتون مع النمط الظاهري نقص الحركة.

Introduction

عادة ما يتم تقييم التأثير النسبي لكل محطة متشابكة تنتمي إلى “اتصال وحدوي” (أي الاتصال بين الخلايا العصبية 2) من خلال تأثيرها على الجزء الأولي من الخلايا العصبية postynaptic1،2. التسجيلات الجسدية و / أو التشجرتيك من الخلايا العصبية postynaptic تمثل الأكثر شيوعا، وحتى الآن، أيضا الوسائل الأكثر إنتاجية لتوضيح معالجة المعلومات تحت منظور من أعلى إلى أسفل أو عمودي3،4،5. ومع ذلك ، فإن وجود الخلايا الفلكية مع مناطقها المنفصلة و (في القوارض) غير المتداخلة قد تساهم في منظور أفقي يستند إلى الآليات المحلية لتبادل الإشارات والتكامل والتزامن في المواقع المتشابكة6،7،8،9،10.

لأنه من المعروف أن astroglia تلعب، بشكل عام، دورا رئيسيا في الإمراض من الأمراض العصبية التنكسية11،12 ، وعلى وجه الخصوص ، دورا في صيانة واللدونة من الغلوتامات العصبية13،14،15،16، فمن المتصور أن التعديلات في أداء متشابك تتطور وفقا لحالة الخلايا الفلكية في المنطقة المستهدفة المشتركة من الألياف المتنوعة مع الأصل ولمواصلة استكشاف الآليات التنظيمية المحلية المستمدة من الأهداف/الأستروغليا في مجال الصحة والمرض، من الضروري تقييم نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وقد تم وضع هذا النهج لتقدير نطاق الإفراج الوظيفي الغلوتامات ومؤشرات إزالة وتحديد المعايير التي يمكن استخدامها لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المختلة (أو المستردة) في مناطق الدماغ الأكثر ارتباطا ببدء الحركة (أي، أولا وقبل كل شيء في قشرة المحرك والمسح الظهري).

وstriatum يفتقر الخلايا العصبية غلواماترارجي الجوهرية. ولذلك، فمن السهل نسبيا لتحديد afferents الجلوتامات من أصل extrastriatal. هذا الأخير تنشأ في الغالب في المهاد الهيلي وفي قشرة الدماغ (انظر17،18،19،20 لأكثر). تتشكل نقاط الاشتباك العصبي القشرية من محاور عصبية هرمية مترجمة في طبقات القشرية 2/3 و 5. تشكل المحاور ذات الصلة اتصالات ثنائية داخل telencephalic (IT) أو اتصالات ipsilateral عبر نظام الألياف الذي يشكل أكثر caudally الجهاز الهرمي (PT). وقد اقترح كذلك أن تكنولوجيا المعلومات وPT-نوع المحطات الطرفية تختلف في خصائص الإفراج عنها وحجم21،,22. في ضوء هذه البيانات، يمكن للمرء أيضا أن نتوقع بعض الاختلافات في التعامل مع الغلوتامات.

وstriatum هو منطقة الدماغ الأكثر تضررا في مرض هنتنغتون (HD)5. HD الإنسان هو اضطراب التنكس العصبي ة الوراثية الشديدة. نموذج الماوس Q175 يوفر فرصة للتحقيق في الأساس الخلوي للشكل البُدَلي للحرارة من HD، وهي حالة لديها الكثير من القواسم المشتركة مع الشلل الرعاش. ابتداء من سن حوالي 1 سنة، homozygote Q175 الفئران (HOM) تظهر علامات نقص الكينيزيا، كما كشفت عن قياس الوقت الذي يقضيه دون حركة في حقل مفتوح23. أكدت التجارب الحالية مع فئران Heterozygote Q175 (HET) العجز الحركي السابق الذي لوحظ في HOM ، بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت أن العجز الحركي الملحوظ كان مصحوبًا بمستوى مخفض من ناقل الأحماض الأمينية الارتسية الارتسية 2 البروتين (EAAT2) في المنطقة المجاورة مباشرة للمحطات المتشابكة القشرية24. ولذلك فقد افترض أن العجز في الغلوتامات الفلكية يمكن أن يؤدي إلى خلل وظيفي أو حتى فقدان نقاط الاشتباك العصبي على حدة25،26.

هنا، ونحن وصف نهج جديد يسمح للمرء أن تقييم إزالة الغلوتامات المشبك واحد بالنسبة لكمية الناقل العصبي صدر. تم التعبير عن مستشعر الغلوتامات الجديد iGluu في الخلايا العصبية الهرمية القشرية. تم تطويره من قبل كاتالين Török27 ويمثل تعديلا للإدخال سابقا عالية تقارب ولكن بطيئة الغلوتامات استشعار iGluSnFR28. كلا المجسات هي مشتقات بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP). للاطلاع على الخصائص الطيفية والحركية، انظر Helassa et al.27. لفترة وجيزة، iGluu هو جهاز استشعار منخفضة التقارب مع الحركية التنشيط السريع، وبالتالي مناسبة بشكل خاص لدراسة إزالة الغلوتامات في المحطات متشابك الغلوتامات الإفراج. تم تحديد ثابت وقت التفكك من iGluu في جهاز توقف التدفق ، مما جعل Tauقبالة قيمة 2.1 مللي ثانية عند 20 درجة مئوية ، ولكن 0.68 مللي ثانية عند استقراء درجة حرارة 34 درجة مئوية27. المحطات الجانبية Schaffer واحد بحث في 34 درجة مئوية مع ليزر ليزر حلزوني في منطقة CA1 من ثقافات فرس النهر organotypic تحت المجهر 2-فوتون أظهرت متوسط الوقت ثابت من الاضمحلال من 2.7 مللي ثانية.

Protocol

وقد نُفذت جميع الأعمال وفقاً لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU للتجارب على الحيوانات، وتم تسجيلها في مكتب برلين لحماية الصحة والسلامة التقنية (G0233/14 وG0218/17). ملاحظة: يمكن إجراء تسجيلات من Q175 من النوع البري (WT) والهيتيراجوت (HETs) في أي عمر وجنس. هنا درسنا الذكور والإناث في سن 51 إ…

Representative Results

تحديد نوعين من الدوالي الجلوتاميتراتي القشريةتنشأ تكنولوجيا المعلومات وPT afferents في الطبقة 2/3 و 5 ، على التوالي ، وتظهر تشعبات تفاضلية وأنماط إنهاء في مخطط ipsilateral وcontralateral (محطات تكنولوجيا المعلومات فقط). لا يزال لا يعرف سوى القليل عن خصائص الإفراج عن الغلوتامات وإزالة في ظل ظروف ا…

Discussion

تتعلق التجارب بمسألة ذات أهمية عامة — عدم الاستقلالية المشبكية وفقدانها المحتمل في سياق التنكس العصبي، ونحن نصف نهجًا جديدًا لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المصابة في شرائح الدماغ الحادة من الفئران المسنة (>1 سنة). الاستفادة من الخصائص الحركية المحسنة للاستشعار الغلوتامات أدخلت مؤخرا iGlu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل CHDI (A-12467) ، ومؤسسة البحوث الألمانية (Exc 257/1 و DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) وصناديق الأبحاث داخل الجدارة التابعة للمؤسسة الخيرية. نشكر ك. توروك، سانت جورج، جامعة لندن، ون هيلاسا، جامعة ليفربول، على iGluu plasmid والعديد من المناقشات المفيدة. وقدم د. بيتانس وأ. شونهير مساعدة تقنية ممتازة.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Single SynapseGlutamate ReleaseGlutamate UptakeAcute Brain SlicesHuntington MiceOne-photon MicroscopeAutofluorescence CorrectionDorsal StriatumStimulation PipetteAction Potential Dependent ReleaseIon Channel BlockersMembrane ReceptorsTetrototoxin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image