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Neuroscience

ग्लूटामेट रिलीज के एकल सिनैप्स संकेतक और सामान्य और हंटिंगटन चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में तेज

doi: 10.3791/60113 Published: March 11, 2020

Summary

हम वयस्क चूहों से तीव्र स्लाइस में एकल कोर्टिकोस्टल ग्लूटामिटल ग्लूटाएग्नेस सिनेप्स में ग्लूटामेट रिलीज और निकासी के बीच संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेट डिटेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सेंसर iGluयू, सिग्नल अधिग्रहण के लिए एक एससीएमओएस कैमरा और फोकल लेजर रोशनी के लिए एक डिवाइस का उपयोग करता है।

Abstract

सिनेप्स अत्यधिक विभाजित कार्यात्मक इकाइयां हैं जो एक दूसरे पर स्वतंत्र रूप से काम करती हैं। हंटिंगटन रोग (एचडी) और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में, अपर्याप्त ग्लूटामेट निकासी और परिणामस्वरूप फैल-इन और फैल-आउट प्रभावों के कारण इस स्वतंत्रता से समझौता किया जा सकता है। प्रेग्नेंसी टर्मिनलों और/या डेंड्रिटिक कताई के साथ-साथ ग्लूटामेट रिलीज साइटों पर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर समूहों के कम आकार के परिवर्तित एस्ट्रोसाइटिक कवरेज को डायस/हाइपरकिनेशिया के लक्षणों के परिणामस्वरूप बीमारियों के रोगजनन में फंसाया गया है । हालांकि, एचडी में ग्लूटाम्जिक सिनेप्स की शिथिलता के लिए अग्रणी तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। सुधार और synapse इमेजिंग लागू हम आंदोलनों की दीक्षा में बाधा तंत्र पर नई रोशनी बहा डेटा प्राप्त किया है । यहां, हम नए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अल्ट्राफास्ट ग्लूटामेट सेंसर iGluयू,वाइड-फील्ड ऑप्टिक्स, एक वैज्ञानिक सीएमओएस (sCMOS) कैमरा, एक 473 एनएम लेजर और एक लेजर पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग करके एक अनिवार्य रूप से सस्ती दृष्टिकोण के सिद्धांत तत्वों का वर्णन करते हैं ताकि उम्र उपयुक्त स्वस्थ या रोग से तीव्र स्लाइस में कोर्टिकोस्टल सिनेप्स की स्थिति का मूल्यांकन किया जा सके। ग्लूटामेट क्षणिकों का निर्माण एकल या कई पिक्सल से किया गया था, जो मैं का अनुमान प्राप्त करने के लिए) सक्रिय क्षेत्र के बगल में ग्लूटामेट एकाग्रता [ग्लू] की अधिकतम ऊंचाई के आधार पर ग्लूटामेट रिलीज और 2) ग्लूटामेट तेज के रूप में पेरिसिनैप्टिक [ग्लू] के क्षय (TauD) के निरंतर समय में परिलक्षित होता है। आराम के बावन आकार और अल्पकालिक प्लास्टिसिटी के विषम पैटर्न में अंतर इंट्राटेलेएंसेफेलिक (आईटी) या पिरामिड ट्रैक्ट (पीटी) मार्ग से संबंधित कॉर्टिकोस्टरिटल टर्मिनलों की पहचान के लिए मानदंड के रूप में कार्य करता है। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि रोगसूचक एचडी चूहों में ~ 40% पीटी-प्रकार कॉर्टिकोस्टरीटल सिनेप्स ने अपर्याप्त ग्लूटामेट क्लीयरेंस का प्रदर्शन किया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि इन सिनेप्स को एक्सिटोटॉक्सिक क्षति का खतरा हो सकता है। परिणाम एक हाइपोकाइनेटिक फेनोटाइप के साथ हंटिंगटन चूहों में बेकार सिनेप्स के बायोमार्कर के रूप में TauD की उपयोगिता को रेखांकित करते हैं।

Introduction

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"एकात्मक कनेक्शन" (यानी, 2 तंत्रिका कोशिकाओं के बीच संबंध) से संबंधित प्रत्येक सिनैप्टिक टर्मिनल का सापेक्ष प्रभाव आमतौर पर पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन1,,2के प्रारंभिक खंड पर इसके प्रभाव से मूल्यांकन किया जाता है। पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन्स से दैहिक और/या डेंड्रिटिक रिकॉर्डिंग सबसे आम का प्रतिनिधित्व करती है और अब तक, टॉप-डाउन या वर्टिकल पर्सनैलिटी3,4,4,5के तहत सूचना प्रसंस्करण को स्पष्ट करने का सबसे उत्पादक साधन भी है । हालांकि, उनके असतत और (कृंतक में) गैर-ओवरलैपिंग क्षेत्रों के साथ एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति एक क्षैतिज परिप्रेक्ष्य में योगदान दे सकती है जो सिनैप्टिक साइटों6,,7,,8,,9,,10पर सिग्नल एक्सचेंज, एकीकरण और सिंक्रोनाइजेशन के स्थानीय तंत्र पर आधारित है।

क्योंकि यह ज्ञात है कि खगोलग्लिया सामान्य रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग11,,12 के रोगजनकों में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं और विशेष रूप से, ग्लूटाजेक्शियल सिनेप्स13,14,,,15,,16के रखरखाव और प्लास्टिसिटी में एक भूमिका, यह बोधगम्य है कि सिनैप्टिक प्रदर्शन में परिवर्तन एस्ट्रोसाइट्स की स्थिति के अनुसार विकसित होता है। स्वास्थ्य और रोग में लक्ष्य/एस्ट्रोग्लिया-व्युत्पन्न स्थानीय नियामक तंत्रों का और पता लगाने के लिए, व्यक्तिगत सिनेप्स का मूल्यांकन करना आवश्यक है । वर्तमान दृष्टिकोण कार्यात्मक ग्लूटामेट रिलीज और निकासी संकेतकों की सीमा का अनुमान लगाने और मानदंडों को परिभाषित करने के लिए तैयार किया गया था जिसका उपयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में बेकार (या बरामद) सिनेप्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो आंदोलन दीक्षा से निकटता से संबंधित है (यानी, मोटर कॉर्टेक्स और डोर्सल स्ट्रेटम में सबसे पहले)।

स्ट्रेटम में आंतरिक ग्लूटामर्गिक न्यूरॉन्स का अभाव है। इसलिए, एक्स्ट्राट्राइटल मूल के ग्लूटामर्गिक एफ्रेरेंट की पहचान करना अपेक्षाकृत आसान है। उत्तरार्द्ध ज्यादातर मध्यस्थ थैलेसीमिया में और सेरेब्रल कॉर्टेक्स में उत्पन्न होता है (अधिक के लिए17,,18,,19,,20 देखें)। कोर्टिकोस्टल सिनेप्स कॉर्टिकल परतों 2/3 और 5 में स्थानीयकृत पिरामिड न्यूरॉन्स के अक्षों द्वारा बनाए जाते हैं। संबंधित एक्सोन एक फाइबर सिस्टम के माध्यम से द्विपक्षीय इंट्रा-टेलेएन्सेफेलिक (आईटी) कनेक्शन या ipsilateral कनेक्शन बनाते हैं जो अधिक कारण पिरामिड पथ (पीटी) का गठन करता है। यह भी सुझाव दिया गया है कि आईटी और पीटी-प्रकार के टर्मिनल उनकी रिहाई विशेषताओं और आकार21,22में भिन्न होते हैं । इन आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, कोई भी ग्लूटामेट की हैंडलिंग में कुछ मतभेदों की उम्मीद कर सकता है।

स्ट्रेटम हंटिंगटन की बीमारी (एचडी)5में सबसे अधिक प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र है । मानव एचडी एक गंभीर आनुवंशिक रूप से विरासत में मिला न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। Q175 माउस मॉडल एचडी के हाइपोकाइनेटिक-कठोर रूप के सेलुलर आधार की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, एक ऐसा राज्य जो पार्किंसंस के साथ बहुत आम है। लगभग 1 वर्ष की उम्र से शुरू, होमोज़िगोट Q175 चूहों (HOM) हाइपोकिनेसिया के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि खुले मैदान23में आंदोलन के बिना बिताए गए समय को मापने से पता चला है। हेट्रोजिगोट Q175 चूहों (एचएटी) के साथ वर्तमान प्रयोगों ने HOM में देखे गए पिछले मोटर घाटे की पुष्टि की और इसके अलावा, यह पता चला कि देखी गई मोटर घाटे के साथ कॉर्टिकोस्टल सिनैप्टिकटर्मिनल2 केतत्काल आसपास एस्ट्रोसाइटिक एक्सेक्टेटरी अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर 2 प्रोटीन (EAAT2) का स्तर कम था। इसलिए यह परिकल्पना की गई है कि एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट तेज होने से25,26से संबंधित सिनेप्स की शिथिलता या हानि भी हो सकती है .

यहां, हम एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो जारी न्यूरोट्रांसमीटर की मात्रा के सापेक्ष एकल सिनेप्स ग्लूटामेट निकासी का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। नए ग्लूटामेट सेंसर iGluयू कोर्टिकोस्टरिटल पिरामिड न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था । इसे काटालिन टोरोक27 द्वारा विकसित किया गया था और पहले से पेश किए गए उच्च आत्मीयता लेकिन धीमी ग्लूटामेट सेंसर iGluSnFR28के संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों सेंसर बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के डेरिवेटिव हैं। स्पेक्ट्रल और गतिज विशेषताओं के लिए, हेलसा एट अल27देखें । संक्षेप में, iGluu तेजी से डी-एक्टिवेशन काइनेटिक्स के साथ एक कम आत्मीयता सेंसर है और इसलिए विशेष रूप से ग्लूटामेट-रिलीजिंग सिनैप्टिक टर्मिनलों पर ग्लूटामेट क्लीयरेंस का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। iGluu के विच्छेदन समय स्थिर एक बंद प्रवाह डिवाइस में निर्धारित किया गया था, जो 20 डिग्री सेल्सियस पर 2.1 एमएस के मूल्यसे एक ताऊ प्रदान की है, लेकिन 0.68 एमएस जब 34 डिग्री सेल्सियस27के तापमान के लिए बहिष्कृत. एकल Schaffer संपाश्र्वक टर्मिनलों एक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत organotypic हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के CA1 क्षेत्र में सर्पिल लेजर स्कैनिंग के साथ ३४ डिग्री सेल्सियस पर जांच २.७ एमएस के क्षय के एक मतलब समय निरंतर प्रदर्शित ।

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Protocol

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सभी काम यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/यूरोपीय संघ के अनुसार पशु प्रयोगों के लिए किया गया है और स्वास्थ्य संरक्षण और तकनीकी सुरक्षा के बर्लिन कार्यालय में पंजीकृत किया गया था (G0233/14 और G0218/17) ।

नोट: Q175 वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) और हेट्रोजिगोट्स (एचटीएस) से रिकॉर्डिंग किसी भी उम्र और सेक्स पर की जा सकती है। यहां हमने 51 से 76 सप्ताह की उम्र में पुरुषों और महिलाओं का अध्ययन किया।

1. कोर्टिकोस्टरीटल एक्सन्स में अभिव्यक्ति के लिए ग्लूटामेट सेंसर iGluयू का इंजेक्शन

  1. वायरस के इंजेक्शन के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट तैयार करने के लिए पिपेट पुलर (वन स्टेप मोड) का उपयोग करें। खींचने के बाद, 30-50 माइक्रोन का टिप व्यास प्राप्त करने के लिए पिपेट को मैन्युअल रूप से तोड़ दें। खोपड़ी खोलने के लिए ड्रिल सहित पिपेट और सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें।
  2. वायरस AAV9-CaMKIIa.iGluयूस्टोर करें । WPRE-hGH (7.5 x 1013जीसी/mL) पर -80 डिग्री सेल्सियस में 10 μL aliquots में । यदि वायरस उत्पादन के तुरंत बाद (6 महीने के भीतर) इंजेक्शन किए जाते हैं, तो 5 डिग्री सेल्सियस पर रखें। सर्जरी से पहले शीशी निकाल कर कमरे के तापमान पर बनाए रखें।
  3. कांच के पिपेट को भरें और किसी भी बुलबुले को हटा दें।
  4. एनेस्थेटाइज एक समाधान के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ जानवर को 87.5 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 12.5 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन से युक्त करें। अतिरिक्त दर्द से राहत के लिए 0.25% bupivacain (8 मिलीग्राम/kg) इंजेक्ट करें। मांसपेशियों की टोन की निगरानी और दर्द से प्रेरित सजगता की अनुपस्थिति को देख कर संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें।
  5. सिर पर त्वचा शेव करें और 70% अल्कोहल के साथ इसे स्टरलाइज करें। माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में फिट करलें।
  6. मोटर कॉर्टेक्स के ऊपर हड्डी में 1.2 मिमी छेद बनाने के लिए त्वचा और उच्च गति (38,000 आरपीएम) ड्रिल को हटाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।
  7. एक सटीक जोड़तोड़ के धारक में संलग्न इंजेक्शन पिपेट के साथ सिरिंज माउंट। 4 अलग-अलग साइटों पर कॉर्टेक्स में खड़ी उन्मुख पिपेट डालें। इंजेक्शन निर्देशांक, ब्रेग्मा (मिमी में) के संबंध में हैं: पूर्वकाल 1.5, पार्श्व 1.56, 1.8, 2.04, 2.28। ड्यूरा मेटर के संबंध में गहराई (मिमी में): 1.5-1.7 है।
  8. इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग करके, 0.05 माइक्रोन/मिन के वेग के साथ बिना पतला वायरस समाधान की प्रति साइट 0.3 माइक्रोन इंजेक्ट करें। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, इसे धीरे-धीरे (1 मिमी/मिन) वापस लेने से पहले 1 मिन के लिए जगह में पिपेट छोड़ दें।
  9. एक नायलॉन सीवन के साथ सर्जिकल घाव को बंद करके समाप्त करें।
  10. माउस को अपने मूल पिंजरे में लौटने से पहले एक साफ पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर 0.5 से 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
  11. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी से पहले 6 से 8 सप्ताह के लिए 12 घंटे दिन रात चक्र पर माउस बनाए रखें।
    नोट: कोशिका क्षति और सिनेप्स हानि के परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए, प्राथमिक इंजेक्शन के बाद एक साथ या 2-3 घंटे के भीतर कई वायरल निर्माण ों का इंजेक्शन किया जाना चाहिए। iGluयू इंजेक्शन के लिए निर्देशांक पैक्सिनोस और फ्रैंकलिन29 मस्तिष्क एटलस के अनुसार चुना गया । वे एम1 मोटर कॉर्टेक्स के अनुरूप हैं। इंजेक्शन दिमाग के इम्यूनोदागिंग ने आईपीएसआई में कई लेकिन ज्यादातर अच्छी तरह से अलग-थलग एक्सोन और एक्सोन वैरिकेज- और कॉन्ट्रालेटरल स्ट्रेटम और कॉन्ट्रालेटरल एम 1 और एस 1 कॉर्टिस में कल्पना की।

2. ग्लूटामेट सेंसर iGlu यू व्यक्त ग्लूटामेट टर्मिनलों के लिए खोजेंu

  1. अंशांकन मोड
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एससीएमओएस कैमरा और कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर तैयार करें। Readout पृष्ठ सेट पिक्सेल readout दरपर: ५६० मेगाहर्ट्ज (= सबसे तेजी से readout), संवेदनशीलता/गतिशील रेंज:बिट, नकली शोर फिल्टर:हां, ओवरलैप Readout:हां । बिनिंग/आरओआई पेज पर फुल स्क्रीन का चयन करें ।
    2. एक कवर स्लिप के नीचे 5 मिलीग्राम/mL लूसिफ़ेर येलो (LY) की एक बूंद युक्त ग्लास स्लाइड तैयार करें।
    3. 63x उद्देश्य के तहत LY स्लाइड रखें, लेजर शटर खोलें और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके एक धारावाहिक अधिग्रहण करें: पिक्सेल बिनिंग:1x1, ट्रिगर मोड:आंतरिक, एक्सपोजर समय:न्यूनतम (निर्धारित होने के लिए)।
    4. व्यास में 4 माइक्रोन के फ्लोरेसेंस स्पॉट का उत्पादन करने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें (छवि में संतृप्त पिक्सेल नहीं होना चाहिए)।
    5. लेजर पोजिशनिंग सिस्टम का अंशांकन करने के लिए, लेजर पोजिशनिंग सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित सेटिंग्स का चयन करें: स्पॉट-साइज व्यास:10, स्कैनिंग वेग:43.200 किलोवाट। सही पैनल पर स्टार्ट इमेज एक्विजिशन बटन पर क्लिक करें। सेट रन:0, रन देरी:0, और अनुक्रम पृष्ठ पर टीटीएल विकल्प पर रन का चयन करें । अंशांकन पृष्ठ पर कैलिब्रेट बटन पर क्लिक करें और अधिग्रहण स्क्रीन के शीर्ष-बाएं कोने में दिखाए गए निर्देशों के अनुसार लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट करें।
    6. यदि सेटअप कैमरा और लेजर नियंत्रण के लिए स्वतंत्र सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है, कैमरा अधिग्रहण खिड़की से स्क्रीनशॉट प्राप्त करने और XY निर्देशांक की एक फिर से गणना के लिए लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर को भेजने के लिए । यदि सॉफ्टवेयर विभिन्न कंप्यूटरों पर स्थापित किया गया है, तो लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में छवि आयात करने के लिए एक वीडियो हथियाने का उपयोग करें। लेजर कंट्रोल सॉफ्टवेयर को XY स्केलिंग कारकों और ऑफसेट के बारे में जानकारी की आवश्यकता होगी। इस उद्देश्य के लिए, लेजर नियंत्रण कार्यक्रम की अधिग्रहण खिड़की के भीतर छवि के ऊपर-बाएं, नीचे-बाएं और नीचे-दाएं कोनों के निर्देशांक निर्धारित करें। निम्नलिखित समीकरणों के अनुसार स्केलिंग कारकों की गणना करें: एक्स फैक्टर = (एक्स बॉटम-राइट - एक्स बॉटम-लेफ्ट) /2048, एक्स ऑफसेट = एक्स बॉटम-लेफ्ट, वाई फैक्टर = (वाई टॉप-लेफ्ट - वाई बॉटम-लेफ्ट) /2048, वाई ऑफसेट = वाई बॉटम-लेफ्ट।
    7. अंशांकन प्रक्रिया के अंत में, 267x460 पिक्सल का आयताकार ब्याज क्षेत्र (आरओआई) बनाएं, इसे स्क्रीन के केंद्र में ले जाएं और स्टार्ट सीक्वेंस बटन पर क्लिक करें।
    8. निम्नलिखित कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर सेटिंग्स पर लौटें: बिनिंग:2x2, ट्रिगर मोड:बाहरी एक्सपोजर, एक्सपोजर समय:न्यूनतम (निर्धारित होने के लिए)।
  2. ऑटोफ्लोरेसेंस करेक्शन मोड
    नोट: सक्रिय सिनैप्टिक टर्मिनलों के वातावरण में [ग्लू] का विश्राम स्तर आमतौर पर 100 एनएम14,30,,31,32,33,,34से नीचे होता है ।34 तदनुसार, ग्लूटामेट का कोई भी सेंसर, विशेष रूप से iGluयू की तरह एक कम आत्मीयता सेंसर सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिलीज के अभाव में मंद हो जाएगा। फिर भी, कुछ iGluu फ्लोरेसेंस का पता भी आराम से लगाया जा सकता है, लेकिन ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस से प्रतिष्ठित किया जाना चाहिए। 473 एनएम रोशनी दोनों iGluu फ्लोरेसेंस और ऑटोफ्लोरेसेंस(चित्रा 1ए-सी)प्रकाश में लाना। उत्तरार्द्ध तरंगदैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला में रहता है, जबकि iGluu फ्लोरेसेंस 480-580 एनएम (अधिकतम 510 एनएम के साथ) तक सीमित है। ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए सुधार विभिन्न उच्च-पास फिल्टर के साथ दो छवियों के अधिग्रहण पर आधारित है।
    1. मस्तिष्क स्लाइस को पहले से तैयार करें जैसा कि कहीं औरवर्णित है । चोकर स्लाइस तैयार रखें।
    2. स्लाइस को रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित करें, उन्हें 125 एमएम एनसीएल युक्त ऑक्सीजनयुक्त कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनलफ्लूइड (एसीएसएफ) में डूबें, 3 एमएम केसीएल, 1.25 एमएम एनएएच2पीओ4,25 एमएम नाहको3,2 एमएम सीएसीएल2,1 एमएम एमजीसीएल2,10 एमएम ग्लूकोज (पीएच 7.3, 303 एमओएसएम/एल), 0.5 मीटर सोडियम पायरुवेट, 2.8 एम सोडियम अस्कॉर्बेट और 0.005 मीटर एम ग्लूथाथिओन के साथ पूरक। 1-2 mL/min के प्रवाह दर का उपयोग करें। 28-30 डिग्री सेल्सियस पर स्नान का तापमान रखें।
    3. 20x जल विसर्जन उद्देश्य के तहत पृष्ठीय स्ट्रेटम का पता लगाएं। ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए एक प्लेटिनम वीणा पर एक नायलॉन ग्रिड के साथ स्लाइस ठीक करें। 63x/एनए 1.0 जल विसर्जन उद्देश्य पर स्विच करें। 473 एनएम (डिक्रोइक मिरर) पर प्रकाश को दर्शाती फ़िल्टर का चयन करें और तरंगदैर्ध्य के साथ प्रकाश पास कररहा है >510 एनएम (उत्सर्जन फ़िल्टर)।
    4. संबंधित नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ एक विज्ञापन/डीए बोर्ड का उपयोग कर रोशनी, उत्तेजना और छवि अधिग्रहण सिंक्रोनाइज करें । 180 एमएस के लेजर एक्सपोजर समय और 160 सुश्री के एक छवि अधिग्रहण समय के साथ अधिग्रहण को नियंत्रित करने के लिए ट्रिगर प्रोग्राम सेट करें। लेजर बीम को पूर्व निर्धारित संख्या में अंक पर भेजने और वेग और स्पॉट आकार स्कैनिंग के लिए सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए लेजर पोजिशनिंग डिवाइस का उपयोग करें।
    5. 510 एनएम ("पीली छवि") पर उच्च पास फिल्टर का उपयोग करके ऑटोफ्लोरेसेंस और आईग्लूयू-पॉजिटिवसंरचनाओं दोनों की छवि प्राप्त करें।
    6. 600 एनएम ("लाल छवि") पर उच्च पास फिल्टर का उपयोग करके अकेले ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ एक छवि प्राप्त करें।
    7. सीमा को परिभाषित करने के लिए 10 प्रतिभाशाली और 10 सबसे अंधेरे पिक्सल की औसत तीव्रता का उपयोग करके लाल और पीले रंग की छवियों को स्केल करें। घटाव "पीला ऋण लाल छवि" करें और ब्याज के बाउटन(चित्रा 1डी)के सुविधाजनक दृश्य के लिए एक मानक 8-बिट टिफ फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए घटाया छवि को फिर से स्केल करें। इसमें iGluu-positiveसंरचनाओं से उज्ज्वल पिक्सल, पृष्ठभूमि से ग्रे पिक्सल और ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ संरचनाओं से अंधेरे पिक्सल शामिल हैं ।
      नोट: दिए गए उपकरणों के साथ फ्लोरेसेंस (एफ) आराम करने का मतलब 700 एयू से नीचे होगा
  3. बाटन सर्च मोड
    नोट: iGluu-positiveपिक्सल अक्षत के पेड़ के कार्यात्मक रूप से विभिन्न तत्वों से संबंधित हो सकते हैं, जैसे कि विभिन्न क्रम की एक्सोन शाखाएं, विभाजन की साइटें, वेसिकल की कमी के बाद वैरिकेबलया या पूरी तरह से सक्रिय वैरिकोसिस। हालांकि, सिर्फ दृश्य निरीक्षण द्वारा कार्यात्मक सिनैप्टिक टर्मिनलों की पहचान करना लगभग असंभव है। इसलिए, प्रत्येक ग्लूटामर्गिक सिनैप्टिक टर्मिनल को विद्युत ध्रुवीकरण के प्रति अपनी जवाबदेही द्वारा पहचान की आवश्यकता होती है। उत्तेजना का जवाब नहीं देने वाली साइटों को त्यागना होगा। शारीरिक का मतलब है कि कोर्टिकोस्टरिट एक्सॉन से ग्लूटामेट रिलीज को प्रेरित करना एक कार्रवाई क्षमता प्राप्त करना है। यह या तो उपयुक्त स्पेक्ट्रल विशेषताओं के चैनल रोडोप्सिन का उपयोग करके या iGluयू द्वारा कल्पना किए गए एक्सॉन की विद्युत उत्तेजना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। आकस्मिक ऑप्सिन सक्रियण से बचने के लिए, हमने बाद के एप्रोस्ट को पसंद किया
    1. बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से उत्तेजना पाइपेट का उत्पादन करने के लिए माइक्रोपाइपेट पुलर (चार चरण मोड में) का उपयोग करें। आंतरिक टिप व्यास लगभग 1 माइक्रोन होना चाहिए। एसीएसएफ से भरे जाने पर इलेक्ट्रोड रेजिस्टेंस करीब 10 एमΩ होना चाहिए।
    2. एक ही एक्सॉन से जुड़े सिनैप्टिक boutons के एक सेट से ग्लूटामेट की कार्रवाई संभावित निर्भर रिलीज को प्रेरित करने के लिए, 63x आवर्धन, ५१० एनएम उत्सर्जन फिल्टर और घटाया छवि का उपयोग करने के लिए एक फ्लोरोसेंट वैरिकायशन के बगल में एक गिलास उत्तेजना इलेक्ट्रोड जगह . अतिरिक्त अक्षों की निकटता से बचें।
    3. उत्तेजना पिपेट को डिपोलाराइजिंग वर्तमान दालों को वितरित करने के लिए उत्तेजक चालू करें। 2 μA (10 माइक्रोन से अधिक नहीं) के आसपास वर्तमान तीव्रता का उपयोग करें।
    4. मल्टी-चैनल बाथ एप्लीकेशन सिस्टम चालू करें जहां एक चैनल मानक स्नान समाधान प्रदान करता है और अन्य चैनल आयन चैनलों, ट्रांसपोर्टरों या झिल्ली रिसेप्टर्स के आवश्यक अवरोधक वितरित करते हैं। रिकॉर्डिंग की साइट पर प्रवाह को नियंत्रित करें और फिर टेट्रोडोटॉक्सिन (टीटीएक्स) चैनल (बाथ सॉल्यूशन प्लस 1 माइक्रोन टीटीएक्स) पर स्विच करें। 2-3 मिन के बाद, ब्याज के बाउटन को फिर से उत्तेजित करें, लेकिन अब कार्रवाई क्षमता पीढ़ी के अभाव में। रिलीज सीधे वोल्टेज पर निर्भर कैल्शियम चैनलों के माध्यम से कैल्शियम की आमद के कारण है ।
    5. उत्तेजक पर तीव्रता कुंजी मोड़ करके, उत्तेजना वर्तमान समायोजित करने के लिए कार्रवाई क्षमता के माध्यम से प्राप्त उन लोगों के समान प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए । आमतौर पर, उत्तेजना वर्तमान 0.5 एमएस ध्रुवीकरण के लिए 6 माइक्रोन के आसपास होगा।
    6. तैयारी के बुनियादी परीक्षण के लिए, 0.5 mM सीडीसीएल2लागू करें। इस कैल्शियम चैनल अवरोधक ग्लूटामेट रिलीज की उपस्थिति सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिलीज को पूरी तरह से रोकती है जिससे सीधे पैदा किए गए ग्लूटामेट सिग्नल की कैल्शियम निर्भरता को मान्य किया जा सके।
      नोट: निम्नलिखित सामान्य सिफारिश स्ट्रेटम में एकल सिनेप्स प्रयोगों की सफलता दर को बढ़ाने में मदद कर सकती है। बरकरार रिलीज मशीनरी के साथ ग्लूटामर्गिक सिनैप्टिक टर्मिनलों का चयन करने के लिए, एक वैरिकाइसहोना चाहिए: (i) एक चिकनी धुरी की तरह आकार होना चाहिए; (ii) एकाक्षी विभाजन से नहीं जुड़ा होना; (iii) पीली छवि पर अन्य संरचनाओं की तुलना में उज्जवल रहें; (iv) फाइबर ट्रैक्ट के बजाय स्ट्रीटल न्यूरोपिल में रहते हैं; (v) एक बहुत पतली एक्सन शाखा पर रहते हैं; (vi) स्लाइस के गहरे हिस्सों के भीतर नहीं रहते हैं ।

3. ग्लूटामेट रिलीज और क्लीयरेंस का दृश्य

  1. रिकॉर्डिंग मोड
    नोट: ऑटोफ्लोरेसेंस (चरण 2.2) के घटाव और ब्याज के बाउटन (चरण 2.3) की जवाबदेही के लिए कुछ प्रारंभिक परीक्षणों के बाद, डेटा अधिग्रहण शुरू हो सकता है। एकल एक्सॉन टर्मिनलों से ग्लूटामेट रिलीज की विद्युत सक्रियण प्रतिक्रियाओं को आगे विश्लेषण उपकरण लागू किए बिना सीधे छवि(चित्रा 2)में देखा जा सकता है। हालांकि, सिनेप्स प्रदर्शन(चित्रा 3)के कुछ बुनियादी संकेतकों को तुरंत निकालना बहुत सुविधाजनक साबित हुआ। इस जानकारी के लिए प्रयोग के बाद के पाठ्यक्रम पर निर्णय लेने की जरूरत है, जैसे विशेष टर्मिनल प्रकार का चयन, HD से संबंधित परिवर्तन ों का तेजी से आकलन, परीक्षणों या दवाओं की संख्या और आवृत्ति सुपरफ्यूजन प्रणाली के साथ लागू किया जाएगा । यह भी अंततः प्रदर्शित कलाकृतियों से निपटने के लिए आवश्यक हो सकता है । सबसे पहले, डेटा रिकॉर्डिंग के लिए मानक सेटिंग्स का वर्णन किया गया है।
    1. माइक्रोस्कोप XY ड्राइव का उपयोग करना, परीक्षण iGluयू-सकारात्मकbouton व्यूफील्ड केंद्र के करीब जगह है । गर्भपात अधिग्रहण बटनके साथ छवि अधिग्रहण बंद करो । पिछले अधिग्रहीत चित्र पर, बाएं माउस बटन के साथ उस पर क्लिक करके आराम करने वाले बावन केंद्र की XY स्थिति निर्धारित करें। सेट कर्सर के XY निर्देशांक अधिग्रहण खिड़की के नीचे स्थिति पैनल पर दिखाया जाएगा।
    2. अंशांकन डेटा (चरण 2.1.6) का उपयोग करके, साइट के निर्देशांक की गणना करें जहां लेजर बीम को iGluu फ्लोरेसेंस के उत्तेजना के लिए भेजा जाना चाहिए। निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करें: एक्स लेजर = एक्स कैमरा * एक्स फैक्टर + एक्स ऑफसेट, वाई लेजर = वाई ऑफसेट - वाई कैमरा * वाई फैक्टर। इस पुनर्गणना को करते समय, कैमरे की ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज फ्लिप सेटिंग्स पर ध्यान दें।
    3. गणना निर्देशांक का उपयोग कर लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एक बिंदु अनुक्रम बनाएं। इस उद्देश्य के लिए, लेजर कंट्रोल सॉफ्टवेयर के अनुक्रम पृष्ठ पर अनुक्रम बॉक्स में ऐड में प्वाइंट का चयन करें। शुरुआत को ट्रिगर करने के लिए देरी के लिए 10 μs का चयन करें और लेजर पल्स समय के लिए 180 एमएस। माउस को गणना किए गए निर्देशांक पर ले जाएं और बाएं बटन पर क्लिक करें।
    4. लेजर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित सेटिंग्स का चयन करें: रन:0, रन देरी:0, अनुक्रम:टीटीएल पर भागो। इसके बाद स्टार्ट सीक्वेंसपर क्लिक करें ।
    5. कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में, निम्नलिखित सेटिंग्स का चयन करें: बिनिंग/आरओआई पेज पर, सेट इमेज एरिया:कस्टम, पिक्सेल बिनिंग:2x2, ऊंचाई:20, चौड़ाई: 20, लेफ्ट:एक्स-सांदोलन ऑफ आराम iGluयू-पॉजिटिवस्पॉट माइनस 10 पीसीएक्स, बॉटम: बाकी iGluयू-पॉजिटिवस्पॉट माइनस 10 पीसीएक्स, एक्विजिशन मोड: काइनेटिक सीरीज, काइनटिक सीरीज,टाइम लेंथ40: 0.0003744s (न्यूनतम मूल्य)। इस तरह की सेटिंग के साथ, अधिग्रहण दर 2.48 kHz होगी।
    6. ट्रिगर मोडका चयन करें: बाहरी। कैमरा कंट्रोल सॉफ्टवेयर में सिग्नल लें पर क्लिक करें। ट्रिगर डिवाइस के लिए निर्धारित प्रायोगिक प्रोटोकॉल शुरू करें।
    7. निम्नलिखित समय रेखा के साथ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल परीक्षण को लागू करें: 0 एमएस - परीक्षण शुरू करें, 1 एमएस - लेजर रोशनी शुरू करें, 20 एमएस - कैमरे के साथ छवि अधिग्रहण शुरू करें, 70 एमएस - विद्युत उत्तेजना शुरू करें 1, 120 - विद्युत उत्तेजना शुरू करें 2, 181 एमएस - अंत परीक्षण (लेजर और कैमरा बंद)। इस प्रकार, एक परीक्षण के दौरान कैमरा 2.48 किलोवाट की आवृत्ति के साथ 400 फ्रेम प्राप्त करता है। 2.3.3 और 2.3.5 कदम देखें। विद्युत उत्तेजना पर विवरण के लिए।
    8. प्रेग्नेंसी वेसिकल पूल की पर्याप्त वसूली के लिए अनुमति देने के लिए, 0.1 हर्ट्ज या उससे कम की पुनरावृत्ति आवृत्ति के साथ प्रोटोकॉल परीक्षण लागू करें।
  2. ग्लूटामेट क्षणिक और ग्लूटामेट रिलीज के तेजी से आकलन और रोग सिनेप्स की पहचान के लिए निकासी का ऑफ-लाइन निर्माण
    1. मूल्यांकन दिनचर्या चालू करें। यहां, हम एक इन-हाउस-लिखित सॉफ्टवेयर सिंबाउट v. 3.2 का उपयोग करते हैं। (लेखक: एंटोन Dvorzhak) । चित्रा 2के वीडियो में एलिवेटेड इग्लूयू फ्लोरेसेंस के साथ पिक्सल से एक एफ क्षणिक निर्माण के लिए निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता है ।
    2. बाटन आकार का निर्धारण करने के लिए, उत्तेजना की शुरुआत से पहले, बाकी (एफ) में आरओआई फ्लोरेसेंस तीव्रता के मतलब और मानक विचलन (एसडी) की गणना करें। एफएंडजीटी के साथ पिक्सल द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र का निर्धारण और बॉक्स + 3 एसडी(चित्रा 3ए)। एक आभासी व्यास (μm में) सुप्रा-दहलीज क्षेत्र के एक परिपत्र रूप संभालने का निर्धारण करें।
    3. पीक तीव्रता मूल्य और एफ के बीच अंतर के रूप में निर्धारित करें उत्तेजक वर्तमान और समय के खिलाफ एफ(चित्रा 3बी)। आराम से (उत्तेजना की शुरुआत से पहले) और "पीक आयाम" पर F/F के एसडी की गणना करें । चोटी से क्षय के लिए मोनोएक्सपोन्शियल फिटिंग करने के लिए 3 से अधिक एसडी ऑफ पीक आयाम के साथ पिक्सेल का उपयोग करें। एफ/एफ के क्षय तौद का समय स्थिर निर्धारित करें ।
    4. किसी दिए गए सिनेप्स में "मैक्सिमल आयाम" का अनुमान लगाने के लिए, उच्चतम एफ/एफ मूल्य के साथ पिक्सेल का चयन करें। यह आम तौर पर आराम करने वाले बावन iGluu फ्लोरेसेंस की सीमाओं के भीतर या उसके बगल में स्थित है। "मैक्सिमल आयाम" एक भी सिनेप्स की निकासी मशीनरी को प्रस्तुत ग्लूटामेट लोड का सबसे अच्छा संकेतक होगा।
    5. iGluयू सिग्नल के स्थानिक विस्तार का अनुमान लगाने के लिए, एक आभासी सर्कल बनाने के लिए संयुक्त सभी सुप्रा-दहलीज पिक्सेल के क्षेत्र के व्यास का निर्धारण करें। संबंधित व्यास को "स्प्रेड" कहा जाता है। शब्द "पीक स्प्रेड" तो औसत प्रसार क्षणिक के पीक मूल्य को संदर्भित करता है(चित्रा 3सी,बिंदीदार लाल रेखाओं के बीच अंतर) ।
  3. संभावित कलाकृतियों के लिए सुधार
    नोट: विद्युत ध्रुवीकरण इंट्रा-पिपेट समाधान के जावक प्रवाह से जुड़ा हुआ है। इसके परिणामस्वरूप एक छोटा ऊतक विस्थापन हो सकता है। iGluयू और छवि के आउट-ऑफ-फोकस बदलावों की उत्तेजना-प्रेरित परिवर्तनों के बीच भेदभाव करने के लिए, कोई भी विस्थापन कलाकृतियों(चित्र4)की पहचान करने और उन्हें खत्म करने के लिए निम्नलिखित दृष्टिकोण का उपयोग कर सकता है।
    1. विस्थापन के संकेतों के साथ आरओआई से प्राप्त सुप्राथ्रेस पिक्सल की स्थानिक विशेषताओं का विश्लेषण करें(चित्र4एफ-एच)।
    2. बाकी पर bouton की शुरू में निर्धारित सीमाओं के बाहर पिक्सल का पता लगाएं(चित्रा 4एफ-एच,लाल रंग में बॉक्स्ड) ।
    3. अंततः मौजूदा नकारात्मक पिक्सेल तीव्रता मूल्यों की पहचान करें(चित्र4I, J)। किसी भी एक आयाम के साथ नकारात्मक दिशा में किसी भी पूर्व उत्तेजना मतलब ± 3 एसडी विरूपण साक्ष्य के रूप में माना जाना चाहिए, और रिकॉर्ड खारिज कर दिया जाना चाहिए ।
    4. आउट-ऑफ-फोकस कलाकृतियों से बचने के लिए, उत्तेजना इलेक्ट्रोड को सिनैप्टिक बाउटन के एंटेरो-लेटरल साइड पर रखें, बिफसिक विद्युत उत्तेजना का उपयोग करें और उत्तेजना तीव्रता/अवधि को कम करें।
      नोट: आउट-ऑफ-फोकस कलाकृतियों को कैमरे से भी प्राप्त किया जा सकता है। यदि बाद को माइक्रोस्कोप के लिए इष्टतम रूप से तय नहीं किया जाता है तो यह दोलन का उत्पादन कर सकता है, कैमरा कूलिंग सिस्टम के छोटे कंपन के कारण सबसे अधिक संभावना है। इस तरह के कंपन ५० हर्ट्ज की आवृत्ति के साथ घूर्णन छवियों में एक "यिन और यांग" पैटर्न बनाते हैं । कंपन को गणितीय रूप से फ्लोरेसेंस सिग्नल से घटाया जा सकता है, लेकिन माप की अंतिम गुणवत्ता तब रिकॉर्डिंग समय पर गंभीर रूप से निर्भर करेगी।
    5. कैमरे को माइक्रोस्कोप पर ठीक करें ताकि कंपन नदारद हो। यदि उत्तरार्द्ध रहता है, तो कैमरे और माइक्रोस्कोप एडाप्टर के बीच एक रबर गैसकेट रखें।
      नोट: कोई इस संभावना को नजरअंदाज नहीं कर सकता कि ब्याज के सिनेप्स के आसपास स्ट्रीटल न्यूरोपिल में ग्लूटाएर्गिक वैरिकोजिटीज शामिल हैं जो iGluयू को व्यक्त नहीं करते हैं और इसलिए अदृश्य रहते हैं। उनके सह-सक्रियण (टीटीएक्स की अनुपस्थिति में अधिक संभावना) के मामले में ब्याज के मुकाबलों से प्राप्त यात्रियों को फैल-ओवर से प्रभावित किया जा सकता है। यही बात iGluयू-व्यक्तकरने वाले टर्मिनलों पर भी लागू होती है जो ध्यान से बाहर थे । इस मामले में एक विशेषता घटना यह होगी कि फ्लोरेसेंस क्षणिक एक बहुत व्यापक क्षेत्र से उत्पन्न होते हैं। चूंकि यह प्रतिक्रिया टीटीएक्स द्वारा समाप्त हो जाती है, इसलिए कोई भी इसे अनुचित बहु-फाइबर सक्रियण द्वारा प्रेरित एक अविशिष्ट प्रतिक्रिया के रूप में व्याख्या कर सकता है।
    6. इस अविशिष्ट बहु-फाइबर प्रतिक्रिया के लिए सही करने के लिए, चित्रा 5में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें। व्यूफील्ड सीमाओं पर पिक्सल के फ्लोरेसेंस सिग्नल का उपयोग करें। पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया को कम करने के लिए, उत्तेजना तीव्रता और अवधि को कम करने या टीटीएक्स का उपयोग करें।

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Representative Results

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कॉर्टिकोस्ट्रीटल ग्लूटामर्गिक वैरिकेजिटीज के दो प्रकार की पहचान
आईटी और पीटी एफिडेंस क्रमशः परत 2/3 और 5 में उत्पन्न होते हैं, और आईपीएसआइलेटरल और कॉन्ट्रालेटरल (केवल आईटी टर्मिनल) स्ट्राइटम में अंतर असर और समाप्ति पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। आंदोलनों की दीक्षा के दौरान देखी गई दोहराव सक्रियण स्थितियों के तहत ग्लूटामेट रिहाई और निकासी के गुणों के बारे में अभी भी कम जाना जाता है, लेकिन यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि संबंधित ग्लूटामेट-रिलीजिंग वैरिकोस आकार22में भिन्न होती है। एक आकार मापदंड लागू करने, यह पाया गया कि आईटी और पीटी टर्मिनल अल्पकालिक प्लास्टिसिटी24के विषम रूपों का प्रदर्शन करते हैं । 50 एमएस के प्रोत्साहन अंतराल पर, छोटे आईटी टर्मिनलों को जोड़ा पल्स डिप्रेशन (पीपीडी) का खतरा था, जबकि बड़े पीटी टर्मिनलों ने जोड़ी दाल सुविधा दिखाई। यह अंतर भी कम अंतराल (20 एमएस) और 6 दालों की एक श्रृंखला के दौरान देखा गया था । चित्रा 3 और चित्रा 6 इन प्रयोगों को दर्शाते हैं जहां सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिलीज को शारीरिक सीए2 +/एमजी2 + एकाग्रता पर कार्रवाई संभावित तंत्र के माध्यम से प्राप्त किया गया था।

उन्नत हंटिंगटन रोग के साथ चूहों में बेकार सिनेप्स की पहचान
अल्जाइमर, पार्किंसंस और हंटिंगटन रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की विशेषता ग्लूटाएग्नेस सिनेप्स36की कभी प्रगति की हानि है। उपन्यास चिकित्सा का उद्देश्य इस घातक प्रगति को बाधित करना या रिवर्स करना भी है। क्या वास्तव में एक सिनेप्स के लापता होने से पता चलता है, और जब, काफी हद तक अज्ञात है । आगे की अंतर्दृष्टि अध्ययन ों से उम्मीद की जा सकती है जो ग्लूटार्मिक सिनेप्स के एक विशेष वर्ग की महत्वपूर्ण पहचान के लिए मानदंड प्रदान करते हैं और (ख) बेकार बनाम सामान्य रूप से प्रदर्शन करने वाले संपर्कों का पता लगाते हैं। यहां यह दिखाया जाएगा कि कैसे पीटी-प्रकार के टर्मिनलों से प्राप्त तकिएडी मूल्यों का उपयोग एक पहचान मोटर फेनोटाइप के साथ Q175 विषमताओं में बेकार सिनेप्स के अंश का अनुमान लगाने के लिए किया गया था।

एकल सिनेप्स इमेजिंग प्रयोगों से पहले, चूहों को उनके अन्वेषणात्मक व्यवहारों में परिवर्तन के लिए तेजी से बल्कि मजबूत परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया गया था। इस परीक्षण को "स्टेप-ओवर टेस्ट" कहा जाता है। जानवर को पेट्री डिश (185 मिमी व्यास और 28 मिमी दीवार ऊंचाई) के केंद्र में रखा गया था। यह टेस्ट वीडियो कैमरे से रिकॉर्ड किया गया था । ऑफ़लाइन विश्लेषण का उपयोग करके, कोई भी प्रयोगकर्ता के हाथ के टेक-ऑफ और उस क्षण के बीच का समय निर्धारित कर सकता है जब जानवर के पास पकवान से सभी 4 फीट बाहर होते हैं। 12 से 18 महीने के बीच की उम्र में 100 से अधिक डब्ल्यूटी और Q175 एचटी से डेटा की साजिश रचने से पता चलता है कि >300 s के एक कदम से अधिक विलंबता वाले चूहों को हाइपोकाइनेटिक के रूप में निदान किया जा सकता है। चित्रा 7 खुले मैदान में कुल पथ चलाने के लिए प्राप्त परिणामों और कदम से अधिक विलंबता के बीच एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध दिखाता है ।

एकल सिनेप्स iGluयू इमेजिंग से पता चला है कि इन रोगसूचक एचडी चूहों ने एकल (या एक अनुक्रम में पहले) उत्तेजनाओं(चित्रा 7बी, सी)से ताऊड मूल्यों में परिलक्षित होने के रूप में मुक्सटेसिनैप्टिक ग्लूटामेट क्षय की गति में कमी का प्रदर्शन किया। डब्ल्यूटी में, ग्लूटामेट तेज के चयनात्मक गैर-परिवहनीय अवरोधक के आवेदन के बाद ही इस तरह का दीर्घीकरण देखा गया था -डीएल-थ्रियो-ए-बेंजिलऑक्सीएस्पार्टिक एसिड (TBOA, चित्रा 7डी,ई)। यह सिनैप्टिक ग्लूटामेट क्लीयरेंस के नियमन में एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों की भूमिका का सुझाव देता है । पेरिसिनैप्टिक स्पेस में ग्लू के प्रसार में परिवर्तन24नहीं पाए गए हैं . लेकिन, निश्चित रूप से, वास्तव में एचडी में धीमा ग्लूटामेट क्लीयरेंस के कारण के साथ-साथ पार्किंसंसिज्म के अन्य रूपों में पहचानने के लिए बहुत अधिक काम की आवश्यकता है। एस्ट्रोसाइट निकटता9 में परिवर्तन और कम slc1A2 अभिव्यक्ति37के अलावा, एक के रूप में अच्छी तरह से पेरिसेनैपिक एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं (PAPs) के प्लाज्मा झिल्ली में EAAT2 की रोग से संबंधित अस्थिरता पर विचार कर सकते हैं। यह EAAT2 इंटरैक्टोम में परिवर्तन का परिणाम हो सकता है। दरअसल, प्रयोगशाला में हाल ही में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों में StriATAL एस्ट्रोसाइट्स (हिर्शबर्ग, Dvorzhak, किर्चनर, Mertins और Grantyn, अप्रकाशित) में EAAT2-dystrophin बातचीत के नुकसान की ओर इशारा करते हैं ।

एचडी की प्रगति के साथ सिनैप्टिक डिसफंक्शन की समयरेखा के बारे में बहुत कम जाना जाता है, लेकिन यह बहुत संभावना है कि स्वस्थ सिनेप्स पहले से ही बिगड़ा हुआ लोगों के साथ सह-अस्तित्व में है। वर्गीकरण मापदंड की खोज में, हमने विभिन्न चूहों से टाड डेटा की जांच की। इस उद्देश्य के लिए, लगातार 3 युग्मित परीक्षणों से आयाम और तऊद मूल्यों को पहली प्रतिक्रिया के लिए सामान्यीकृत किया गया था (एक प्रयोगात्मक योजना के लिए चित्रा 6एफ देखें), और दिए गए तऊद मूल्य की घटना की संभावना की तुलना आयु-मिलान डब्ल्यूटी बनाम Q175 HET(चित्रा 6जी)में की गई थी। यह पाया गया कि डब्ल्यूटी टाउडी में कभी भी 15 एमएस से अधिक नहीं हुआ, जबकि रोगसूचक Q175 एचटी में, 40% सिनेप्स ने 16 से 58 एमएस के बीच ताऊड मूल्यों का प्रदर्शन किया, बावजूद इसके कि जारी ग्लूटामेट(चित्रा 6एच, आई)की मात्रा में कमी की प्रवृत्ति है। TauD तो HD में बेकार synapses के लिए एक बायोमार्कर के रूप में माना जा सकता है और आगे एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट परिवहन को लक्षित प्रयोगों में कार्यात्मक वसूली सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: iGluयूकी पहचान-सकारात्मक वैरिकेयंस । (A)फ्लोरेसेंस छवि 510 एनएम उच्च पास फिल्टर ("पीली छवि") के साथ प्राप्त की गई है। (ख)600 एनएम हाई पास फिल्टर ("लाल छवि") के साथ एक ही दृश्य क्षेत्र का अधिग्रहण किया गया। ध्यान दें कि काले तीरके के साथ चिह्नित जगह (बी) में गायब हो गई है। (ए) और (बी) का ओवरले । सफेद तीर = ऑटोफ्लोरेसेंस, काला तीर = iGluयू-सकारात्मकवैरिकायपन। (D)(ए) से (बी) के घटाव द्वारा प्राप्त छवि । ऑटोफ्लोरोसेंट स्पॉट अंधेरे होते हैं और iGluu+ स्पॉट उज्ज्वल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक धीमी गति वीडियो (मंदी कारक 1240x) से अभी भी फिल्म । ऊपरी पंक्ति: WT (बाएं), Q175 HET (मध्य) और HOM (दाएं) से छवियां । निचली पंक्ति: उच्चतम ग्लूटामेट ऊंचाई (मैक्सिमल एएफ/एफ)के साथ पिक्सेल से संबंधित iGluu यात्रियों। लाल कर्सर ट्रेस के ऊपर छवि के अनुरूप क्षणिक पर बिंदु इंगित करता है। iGluu फ्लोरेसेंस (लाल पिक्सल और एफ ट्रांसिएंट्स) की लंबे समय तक ऊंचाई पर ध्यान दें। संशोधित और Dvorzhak एट अल से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित ।24कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कॉर्टिकोस्टल न्यूरॉन्स में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अल्ट्राफास्ट ग्लू सेंसर iGluयू की एकल सिनेप्स छवियों से कार्यात्मक संकेतकों की निकासी। (, डी) एक पीटी (ए) और आईटी (डी) बाकी पर संबंधित iGluयू फ्लोरेसेंस के साथ bouton का उदाहरण (बाएं) और एक एपी मध्यस्थता iGluयू प्रतिक्रिया (दाएं) के चरम पर । (ए, डी) में दिखाए गए मुकाबलों से दर्ज की गईबी, सी, ई, एफ)iGluu प्रतिक्रियाएं; E 2 mM Ca2+ और 1 mM Mg2 +में प्रयोग करें । (ख)उत्तेजना वर्तमान (ऊपरी ट्रेस) की एक साथ रिकॉर्डिंग और सुप्रा-दहलीज पिक्सल (नीचे ट्रेस) की तीव्रता का मतलब है । सभी निशान के लिए एक ही समय पैमाने पर। पीक आयाम (बिंदीदार लाल क्षैतिज रेखाओं के बीच) और इस चोटी (लाल ओवरले) से क्षय के लिए लगे एक मोनोएक्सपोनशियल फ़ंक्शन। इसी ताऊद (α) मूल्यों फिटिंग घटता के बगल में दिखाया गया है। (ई, एफ) समय के विरुद्ध फैलाने की साजिश। पीक स्प्रेड: बिंदीदार लाल क्षैतिज रेखाओं के बीच अंतर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विस्थापन विरूपण साक्ष्य (एफ-जे) के विपरीत ग्लूटामेट-प्रेरित iGluu क्षणिक (ए-ई) की विशेषताएं। (ए, बी)और(एफ, जी)मनमाने ढंग से इकाइयों (au) में आराम (ए, एफ) और उत्तेजना (बी, जी) के बाद पूर्ण फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाते हैं । (C, H) उत्तेजना (ΤF/F%) से पहले आराम करने वाले फ्लोरेसेंस के प्रतिशत में फ्लोरेसेंस बदलजाता है । (D, I) मनमाने ढंग से इकाइयों में सभी पिक्सल से iGluu यात्रियों की अधिस्थिति। (ई, जम्मू) IGluयू के सभी पिक्सल से अधिस्थान F/F% में । सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिलीज के मामले में, आराम टर्मिनल के बगल में पिक्सल उत्तेजना के बाद एक फ्लोरेसेंस वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं, जबकि आउट-ऑफ-फोकस के मामले में प्रतिभाशाली पिक्सेल को आराम से केवल आरओआई में अपनी स्थिति बदल देता है, दृश्य-क्षेत्र की ओवर-ऑल फ्लोरेसेंस तीव्रता में एक साथ वृद्धि के बिना। एक विस्थापन विरूपण साक्ष्य भी नकारात्मक F/F संकेतों (जम्मू) की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अविशिष्ट iGluयू प्रतिक्रिया के लिए सुधार। (ए-डी) एक अविशिष्ट पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया से दूषित बनती सिनैप्टिक प्रतिक्रिया का उदाहरण। (ई-एच) सुधार के बाद भी। (ए, ई) उत्तेजना से पहले। (B, F) उत्तेजना के दौरान। (C, G) उत्तेजना के बाद। (D, H) आरओआई के सभी पिक्सल से इसी आरोपित तीव्रता के क्षणिक (एफएफ/एफ में) । छवियों के अधिग्रहण का समय तीर सिर पर इसी छोटे अक्षरों द्वारा चिह्नित किया गया है। ध्यान दें कि पैनल सी में पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया बहुत व्यापक और धीरे-धीरे खस्ताहाल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: iGluu क्षणिक के आयाम बनती पल्स अनुपात (पीपीआर) में अलग आकार और आकार से संबंधित अंतर। (क)कॉर्टिकोस्टल सर्किटरी22की सरलीकृत योजना, पिरामिड पथ (पीटी) न्यूरॉन्स के तरजीही प्रक्षेपण की अवधारणा को अप्रत्यक्ष मार्ग के लिए अप्रत्यक्ष मार्ग स्ट्रेटल प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स (आईसीपीएन) और इंट्राटेलेएन्सेफेलिक (आईटी) न्यूरॉन्स को सीधे मार्ग एसपीएनएस (डीएसपीएन) के लिए, आईटी और पीटी टर्मिनलों के बीच आकार के अंतर के साथ दर्शाती है । (ख)उत्तेजना से पहले फ्लोरेसेंस को आराम देने वाली सुप्रा-दहलीज द्वारा निर्धारित बौने व्यास का बिमोदल वितरण । व्यास के साथ Boutons ‧0.63 μm "बड़े" के रूप में परिभाषित किया गया था और पीटी अक्षों द्वारा जारी किया जा मान लिया। पीटी और आईटी-प्रकार के सिनेप्स से मूल छवियों और नमूने के निशान के लिए चित्र3देखें। (ग)पीक आयामों के पीपीआर और बावन व्यास के बीच महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध देखा जाता है । प्रत्येक डेटा बिंदु प्रत्येक bouton के पहले 3 परीक्षणों से औसत का प्रतिनिधित्व करता है । * पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एक हाइपोकाइनेटिक फेनोटाइप के साथ Q175 चूहों में बेकार सिनेप्स की पहचान। (A)सिंगल सिनेप्स इमेजिंग के दिन मोटर टेस्टिंग के नतीजे। स्टेप-ओवर विलंबता और gt;300 एमएस को पैथोलॉजिकल माना जाता था। परीक्षण की गई उम्र (औसत 16 महीने) पर, 17/54 एचईटी ने स्टेप-ओवर टेस्ट में एक स्पष्ट फेनोटाइप का प्रदर्शन किया । हाइपोकिनेशिया के संबंध में, स्टेप-ओवर टेस्ट ओपन फील्ड टेस्ट से अधिक संवेदनशील लगता है। फिर भी, स्टेप-ओवर टेस्ट के परिणाम (प्लेसमेंट और बैरियर के बीच समय सभी चार फीट के साथ पार) और ओपन फील्ड टेस्ट (यानी कुल पथ 5 मिन में चलाने) के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध था। Y = -0.01511X + 458,7; पी = 0.0044 (सरल प्रतिगमन)। (ख)औसत एकल सिनेप्स iGluu यात्रियों को एक ही चोटी आयाम के लिए सामान्यीकृत पैदा करने के लिए सिंप्टिक रूप से जारी ग्लूटामेट की मंजूरी में HD से संबंधित मतभेदों को समझाने के लिए । संबंधित फिटिंग घटता ग्लूटामेट यात्रियों की अवधि में अंतर को उजागर करता है। (ग)जंगली प्रकार (ग्रे), एचईटी (लाल) और HOM (मजेंटा) से परिणामों का परिमाणीकरण । (D, E) टीएफबी-टीबीओए के 100 एनएम में डब्ल्यूटी स्लाइस का ऊष्मायन HOM में मनाए गए ग्लूटामेट क्लीयरेंस के अवसाद का अनुकरण करता है। (एफ)सिनेप्स एक्टिवेशन और डेटा ऑर्गनाइजेशन की स्कीम। (जी) #1 तौद मूल्यों के संचयी हिस्टोग्राम । (एच, मैं) सामान्यीकृत #2 प्रतिक्रियाओं के भूखंड। 31 डब्ल्यूटी और 30 एचटी सिनेप्स (पीटी प्रकार के सभी) से डेटा। डब्ल्यूटी नमूने में सभी TauDmax मूल्यों को एचटी नमूने में 15 एमएस थे, 40% सिनेप्स ने डब्ल्यूटी में सबसे लंबे समय तक तौडमैक्स द्वारा परिभाषित 15 एमएस सीमा से अधिक TauDmax मूल्यों का प्रदर्शन किया। ये रेखांकन अधिकतम आयाम (यानी, उच्चतम iGluu फ्लोरेसेंस वृद्धि के साथ पिक्सेल से मूल्य) और TauDmax (उच्चतम ऊंचाई के साथ पिक्सेल के TauD) की श्रेणियों में एचडी से संबंधित मतभेदों पर जोर देते हैं। विशेष रूप से एचईटी में सामना किए गए तौडमैक्स मूल्यों को लाल रंग में दिखाया गया है, और विशेष रूप से डब्ल्यूटी में देखे गए आयाम मूल्यों को ग्रे में दिखाया गया है। * पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.001। उपयोग किए गए सांख्यिकीय परीक्षण संबंधित ग्राफ के बगल में इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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प्रयोग सामान्य रुचि का सवाल है - न्यूरोडिज़नरेशन के दौरान निर्भरता और इसके संभावित नुकसान की चिंता है, और हम वृद्ध (>1 वर्ष) चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में प्रभावित सिनेप्स की पहचान करने के लिए एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हाल ही में पेश की ग्लूटामेट सेंसर iGluयू की बेहतर गतिज विशेषताओं का लाभ उठाते हुए प्रयोग सिनैप्टिक ग्लूटामेट रिलीज और तेज के बीच संबंधों को एक तरह से रोशन करते हैं जो पहले संभव नहीं हो पाया है।

सिनेप्स के कार्य और रखरखाव पर ग्लूटामेट क्लीयरेंस का प्रभाव बहुत अच्छी तरह से स्पष्ट नहीं है, हालांकि ग्लूटामेट-प्रेरित एक्सीटोटॉक्सिकिसिटी से न्यूरॉन लॉस हो सकता है और सिनेप्स छंटाई का उल्लेख मिर्गी, स्ट्रोक और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों पर लगभग किसी भी प्रासंगिक समीक्षा में किया गया है38,,39,,40,,41। हालांकि, उपलब्ध सबूत साहित्य से संभवतः प्रत्याशित से अधिक सीमित है । इस तथ्य से भ्रम की स्थिति और बढ़ जाती है कि सकल उत्तेजना और रिकॉर्डिंगतकनीक42,43के साथ प्राप्त परिणामों की व्याख्या करते समय कम स्थानिक और लौकिक समाधान से जुड़ी समस्याओं को देखते हुए चयनित प्रायोगिक उपकरण अपर्याप्त हो सकते हैं । यह झूठी नकारात्मक आगे अनुसंधान को हतोत्साहित करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो है हंटिंगटन रोग के रूप में गंभीर के रूप में गंभीर के रूप में न्यूरोलॉजिक विकारों को देखते हुए दुर्भाग्यपूर्ण से अधिक है । वर्तमान दृष्टिकोण बेहतर संकेत भेदभाव सुनिश्चित करता है और इसलिए इस विचार का मजबूत समर्थन है कि HD में कोर्टिकोस्टरिकल सिनेप्स का एक महत्वपूर्ण अंश बिगड़ा ग्लूटामेट मंजूरी के संकेत प्रदर्शित करता है ।

वर्तमान परिणामों ने कोर्टिकोस्टरिटल मार्ग के भीतर अल्पकालिक प्लास्टिसिटी के मतभेदों का खुलासा किया । यद्यपि उत्तरार्द्ध17,,44के कई अध्ययनों के ध्यान में था, यह अनुमान नहीं लगाया गया है कि ऊपरी कॉर्टिकल परतों से उत्पन्न होने वाले एफ्रेरेंट आवृत्ति-निर्भर अवसाद का प्रदर्शन करेंगे, पिरामिड पथ परत 5 में उत्पन्न होने वाले एफ्रेंस के विपरीत। बाद में अधिमानतः रिलीज की आवृत्ति पर निर्भर शक्तिशाली दिखाया और इसलिए ग्लूटामेट तेज अपर्याप्तता के लिए उच्च जोखिम में हो सकता है ।

वयस्क चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस पर प्रयोग जीवन की एक उचित उम्र में सिनैप्टिक परिवर्तन ों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यदि एस्ट्रोसाइट्स ब्याज के तंत्र में शामिल थे तो तैयारी की आयु और कार्यात्मक स्थिति विशेष रूप से प्रासंगिक है। यहां, यह आवश्यक है कि एस्ट्रोसाइट्स ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर गतिविधि और संबंधित क्लोराइड होमोस्टोसिस45के वयस्क स्तरों को प्रदर्शित करने के लिए पर्याप्त परिपक्व हों।

एकल सिनेप्स परखों से अनिवार्य मस्तिष्क46में ग्लूटामर्गिक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन के एचडी-संबंधित परिवर्तनों की बेहतर समझ की दिशा में सड़क का मार्ग प्रशस्त होगा। यह दिखाया गया है कि अक्षुण्ण मस्तिष्क में एकल सिनेप्स संकल्प भी प्राप्त किया जा सकता है, बशर्ते कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स47की सतही परतों में रुचि के सिनेप्स को स्थानीयकृत किया जाए।

अंत में, वर्तमान प्रयोगात्मक दृष्टिकोण अपील है कि यह कई अनुयायियों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि आवश्यक उपकरण अभी भी कम लागत की ओर है ।

संक्षेप में, फ्लोरेसेंस ग्लूटामेट रिलीज की रिपोर्ट करने का संकेत देता है और बरकरार मस्तिष्क में ग्लूटामेट की एकाग्रता में निकटता परिवर्तन किसी भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विधि के साथ डेटा अप्राप्य प्रदान कर सकते हैं। लेकिन किसी भी नई विधि के साथ के रूप में, इस दृष्टिकोण अपनी सीमाओं और नुकसान है कि भाग में है कदम २.२ और ३.३ में संबोधित किया गया है । तेज और उच्च आत्मीयता iGluयू सेंसर के कम आराम फ्लोरेसेंस आगे परीक्षण के लिए उपयुक्त वैरिकेयपन की पहचान करने के लिए व्यायाम/अनुभव के एक बिट की आवश्यकता है । एक्ससीएएमपी-आर48 और कम से कम दो समन्वित लेजर रोशनी प्रणालियों जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (जीसीआई) की सह-अभिव्यक्ति के साथ, कार्यात्मक एक्सॉन टर्मिनलों की खोज बहुत आसान हो जाएगी। किसी भी मामले में, iGluयू रिकॉर्डिंग से पहले और दौरान रोमांचक प्रकाश के लिए जितना संभव हो उतना कम तैयारी का पर्दाफाश करना महत्वपूर्ण है।

एक 473 एनएम लेजर (नियमित रूप से पूरे क्षेत्र उन्मूलन के बजाय) का उपयोग iGluu फ्लोरेसेंस प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उत्सर्जन प्राप्त करने के लिए एक शर्त है, लेकिन यह भी ब्लीचिंग का कारण होगा। दी गई शर्तों के तहत, iGluयू पूरी तरह से 10 उत्तेजना/अधिग्रहण परीक्षणों के बाद प्रक्षालित किया गया था (५० एमएस के एक अंतर उत्तेजना अंतराल पर 10 उत्तेजना जोड़े और 1/10 एस की पुनरावृत्ति दर) । वर्तमान में उपयोग किए गए 1 फोटॉन लेजर सिस्टम के साथ स्थिर-राज्य डेटा अधिग्रहण के लिए अधिकतम कुल रोशनी समय और वर्णित सेटिंग लगभग 2 एस थी। iGluयू की ब्लीचिंग घातीय है, रोशनी शुरू करने के बाद पहले 20 एमएस के दौरान बहुत मजबूत किया जा रहा है और उसके बाद बहुत धीमी । इसलिए प्रत्येक परीक्षण के पहले 20 एमएस के दौरान संकेत अधिग्रहण से बचने और कुल 10 प्रतिक्रिया जोड़े से अधिक नहीं प्राप्त करने की सलाह दी जाती है। एकल उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाएं वर्तमान में इस्तेमाल १८० एमएस के बजाय 60-80 एमएस के एक्सपोजर समय के साथ दर्ज की जा सकती है ।

एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा इग्लूयूका अभिव्यक्ति स्तर है हेलसा एट अल27के अग्रणी अध्ययन में, वायरल निर्माण को इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा सुसंस्कृत न्यूरॉन्स27पर लागू किया गया था, जो सेंसर के उच्च अभिव्यक्ति स्तर का उत्पादन करता है और संभवतः कम ब्लीचिंग भी करता है, खासकर यदि एक फोटोन लेजर स्कैनिंग डिवाइस का उपयोग एक फोटोटॉन माइक्रोस्कोप के बजाय किया जा सकता है। Dürst एट अल.49 रिपोर्ट ~ 100 परीक्षणों में CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में iGluयू की पोस्टसिनैप्टिक अभिव्यक्ति के नियमित अधिग्रहण (प्रत्येक केवल 80 एमएस के लिए उजागर)। हालांकि, सुसंस्कृत मस्तिष्क ऊतक एक विकल्प नहीं है जब प्रयोगों का उद्देश्य वृद्ध मस्तिष्क में एस्ट्रोसाइट-निर्भर सिनैप्टिक कार्यों को स्पष्ट करना है। एक मजबूत प्रमोटर का उपयोग करके iGluयू की एक CaMKII-क्रे-निर्भर अभिव्यक्ति कम कोशिकाओं में मजबूत अभिव्यक्ति के साथ तैयारी प्रदान कर सकती है, जिससे विधि के समाधान में वृद्धि हो सकती है और प्रति सिनैप्स अधिक परीक्षणों के अधिग्रहण के लिए अनुमति दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को CHDI (A-12467), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (Exc 257/1 और DFG प्रोजेक्ट-आईडी 327654276 - SFB 1315) और चारिट के इंट्राम्यूरल रिसर्च फंड्स द्वारा समर्थित किया गया था। हम के Török, सेंट जॉर्ज, लंदन विश्वविद्यालय, और एन Helassa, लिवरपूल विश्वविद्यालय, iGluयू प्लाज्मिड और कई उपयोगी चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । डी Betances और ए Schönherr उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

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ग्लूटामेट रिलीज के एकल सिनैप्स संकेतक और सामान्य और हंटिंगटन चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में तेज
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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

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