Vi præsenterer en protokol til at evaluere balancen mellem glutamat frigivelse og clearance på enkelt korticostriatal glutamatergic synapser i akutte skiver fra voksne mus. Denne protokol bruger fluorescerende sensor iGluu til glutamat detektion, en sCMOS kamera til signal erhvervelse og en enhed til fokal laser belysning.
Synapser er stærkt opdelte funktionelle enheder, der fungerer uafhængigt på hinanden. Ved Huntingtons Sygdom (HS) og andre neurodegenerative lidelser kan denne uafhængighed blive kompromitteret på grund af utilstrækkelig glutamatclearance og de deraf følgende udslips- og udslipseffekter. Ændret astrocytisk dækning af de presynaptiske terminaler og/eller dendritiske pigge samt en reduceret størrelse af glutamattransporterklynger på glutamatfrigivelsessteder har været involveret i patogenesen af sygdomme, der resulterer i symptomer på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer, der fører til dysfunktion af glutamatergic synapser i HS, er ikke godt forstået. Forbedring og anvendelse synapse imaging vi har fået data kaste nyt lys over de mekanismer, der hindrer indledningen af bevægelser. Her beskriver vi de vigtigste elementer i en relativt billig tilgang til at opnå en enkelt synapse opløsning ved hjælp af den nye genetisk kodede ultrahurtige glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en videnskabelig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser og en laser positionering system til at vurdere tilstanden af korticostriatal synapser i akutte skiver fra alder passende sunde eller syge mus. Glutamattransienter blev konstrueret ud fra enkelte eller flere pixels for at opnå skøn over i) glutamatfrigivelse baseret på den maksimale højde af glutamatkoncentrationen [Glu] ved siden af den aktive zone og ii) glutamatoptagelse som afspejlet i tidskonstanten af henfald (TauD) af perisyaptisk [Glu]. Forskelle i hvilebouton størrelse og kontrasterende mønstre af kortsigtede plasticitet tjente som kriterier for identifikation af korticostital terminaler som tilhører intratelencephalic (IT) eller pyramideformede tarmkanalen (PT) vej. Ved hjælp af disse metoder opdagede vi, at i symptomatiske HS-mus ~ 40% af PT-type korticostriatal synapser udviste utilstrækkelig glutamat clearance, hvilket tyder på, at disse synapser kan være i risiko for excitotoksiske skader. Resultaterne understreger nytten af TauD som en biomarkør for dysfunktionelle synapser hos HS-mus med en hypokinetisk fænotype.
Den relative virkning af hver synaptisk terminal, der tilhører en “enhedsforbindelse” (dvs. forbindelsen mellem 2 nerveceller) vurderes typisk ved dens indflydelse på det oprindelige segment af den postsynaptiske neuron1,2. Somatiske og/eller dendritiske optagelser fra postsynaptiske neuroner udgør de mest almindelige og indtil nu også de mest produktive midler til at afklare informationsbehandling under et top-down eller vertikalt perspektiv3,4,5. Tilstedeværelsen af astrocytter med deres diskrete og (i gnavere) ikke-overlappende områder kan imidlertid bidrage med et horisontalt perspektiv , der er baseret på lokale mekanismer for signaludveksling, integration og synkronisering på synaptiske steder6,7,8,9,10.
Fordi det er kendt, at astroglia spiller, i almindelighed, en stor rolle i patogenesen af neurodegenerative sygdomme11,12 og især en rolle i vedligeholdelse og plasticitet af glutamatergic synapser13,14,15,16, er det tænkeligt, at ændringer i synaptiske ydeevne udvikler sig i overensstemmelse med tilstanden af astrocytter i det fælles målområde af ferente fibre med forskellig oprindelse. For yderligere at undersøge de mål-/astroglia-afledte lokale reguleringsmekanismer inden for sundhed og sygdom er det nødvendigt at evaluere individuelle synapser. Denne tilgang blev udarbejdet for at vurdere rækken af funktionelle glutamat frigivelse og clearance indikatorer og til at definere kriterier, der kan anvendes til at identificere dysfunktionelle (eller genvundne) synapser i hjernen områder tættest relateret til bevægelse indledning (dvs. først og fremmest i den motoriske cortex og dorsale striatum).
Striatum mangler iboende glutamatergic neuroner. Derfor er det relativt let at identificere glutamatergic afferents af extrastriatal oprindelse. Sidstnævnte stammer for det meste i den mediale thalamus og i hjernebarken (se17,18,19,20 for mere). Korticostriatal synapser dannes af axoner af pyramideformede neuroner lokaliseret i kortikale lag 2/3 og 5. De respektive axoner danner bilaterale intra-telencephalic (IT) forbindelser eller ipsilaterale forbindelser via et fibersystem, der mere caudally udgør den pyramideformede tarmkanalen (PT). Det er endvidere blevet foreslået , at it- og PT-typeterminaler er forskellige med hensyn til deres frigivelseskarakteristika og størrelse21,22. I lyset af disse data kunne man også forvente visse forskelle i håndteringen af glutamat.
Striatum er det hårdest ramte hjerneområde ved Huntingtons Sygdom (HS)5. Human HS er en alvorlig genetisk arvelig neurodegenerativ lidelse. Q175-musemodellen giver mulighed for at undersøge det cellulære grundlag af den hypokinetiske stive form for HS, en tilstand, der har meget til fælles med parkinsonisme. Starter i en alder af omkring 1 år, homozygote Q175 mus (HOM) udviser tegn på hypokinesi, som det fremgår ved at måle den tid, der bruges uden bevægelse i et åbent felt23. De nuværende forsøg med heterozygote Q175-mus (HET) bekræftede de tidligere motoriske underskud, der blev observeret i HOM, og viste desuden, at de observerede motoriske underskud var ledsaget af et reduceret niveau af den astrocytiske eksterionsyretransportør 2 protein (EAAT2) i umiddelbar nærhed af korticostiriatal synaptiske terminaler24. Det har derfor været en hypotese , at et underskud i udbredelsen af astrocytisk glutamat kan føre til dysfunktion eller endog tab af respektive synapser25,26.
Her beskriver vi en ny tilgang, der gør det muligt at evaluere enkelt synapse glutamat clearance i forhold til mængden af den frigivne neurotransmitter. Den nye glutamat sensor iGluu blev udtrykt i korticostriatal pyramideformede neuroner. Det blev udviklet af Katalin Török27 og repræsenterer en ændring af den tidligere indførte høj-affinitet, men langsom glutamat sensor iGluSnFR28. Begge sensorer er derivater af det forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP). For spektrale og kinetiske egenskaber, se Helassa et al.27. Kort, iGluu er en lav-affinitet sensor med hurtig de-aktivering kinetik og derfor særligt velegnet til at studere glutamat clearance på glutamat-releasing synaptiske terminaler. Dissociationstidskonstanten for iGluu blev bestemt i en stop-flow-anordning, som afgjorde enTau-offværdi på 2,1 ms ved 20 °C, men 0,68 ms, når den ekstrapoleres til en temperatur på 34 °C27. Enkelt Schaffer sikkerhedsstillelse terminaler undersøgt ved 34 °C med spiral laserscanning i CA1 regionen organotypic hippocampal kulturer under en 2-foton mikroskop udstillet en gennemsnitlig tid konstant af henfald på 2,7 ms.
Forsøgene vedrører et spørgsmål af almen interesse — synapse uafhængighed og dens mulige tab i løbet af neurodegeneration, og vi beskriver en ny tilgang til at identificere berørte synapser i akutte hjerneskiver fra alderen (>1 år) mus. Drage fordel af de forbedrede kinetiske egenskaber af den nyligt indførte glutamat sensor iGluu eksperimenterne belyse forholdet mellem synaptisk glutamat frigivelse og optagelse på en måde, der ikke har været muligt før.
Indflydelsen …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af CHDI (A-12467), den tyske forskningsfond (Exc 257/1 og DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) og intramural Research Funds of the Charité. Vi takker K. Török, St. George’s, University of London, og N. Helassa, University of Liverpool, for iGluu plasmid og mange nyttige diskussioner. D. Betances og A. Schönherr ydede fremragende teknisk bistand.
Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |