Summary
Ici, nous présentons la micro-fragmentation sans enzyme s'adipeux humain à l'aide d'un dispositif système fermé. Cette nouvelle méthode permet l'obtention de grappes de tissus adipeux sous-millimétriques adaptées à la transplantation in vivo, à la culture in vitro et à l'isolement et à la caractérisation des cellules.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, les greffes de tissus adipeux ont été largement utilisées en chirurgie plastique et en orthopédie pour améliorer la réprobation et/ou la régénération des tissus. En conséquence, les techniques de récolte et de traitement des tissus adipeux humains ont évolué afin d'obtenir rapidement et efficacement de grandes quantités de tissu. Parmi ceux-ci, la technologie du système fermé représente un système novateur et facile à utiliser pour la récolte, le traitement et la réinjection de tissus adipeux raffinés en peu de temps et dans la même intervention (intraopératoire). Le tissu adipeux est recueilli par liposuccion, lavé, émulsionné, rincé et haché mécaniquement en grappes cellulaires de 0,3 à 0,8 mm. La transplantation autologue du tissu adipeux mécaniquement fragmenté a montré une efficacité remarquable dans différents traitements comme la médecine esthétique et la chirurgie, la chirurgie orthopédique et générale. La caractérisation du tissu adipeux micro-fragmenté a indiqué la présence de petits vaisseaux intacts dans les amas d'adipocyte ; par conséquent, la niche périvasculaire est laissée imperturbable. Ces grappes sont enrichies en cellules périvasculaires (c.-à-d. ancêtres de cellules souches mésenchymales (MSC) et l'analyse in vitro a montré une libération accrue de facteurs de croissance et de cytokines impliqués dans la réparation et la régénération des tissus, comparativement aux MSC dérivés enzymatiquement. Ceci suggère que le potentiel thérapeutique supérieur du tissu adipeux microfragmenté s'explique par une fréquence plus élevée des MSC sumptives et de l'activité sécrétrice améliorée. On ne sait pas si ces péricytes ajoutés contribuent directement à un facteur de croissance plus élevé et à la production de cytokine. Cette procédure cliniquement approuvée permet la transplantation de MSC présumés sans avoir besoin d'expansion et/ou de traitement enzymatique, contournant ainsi les exigences des lignes directrices sur les GMP et réduisant les coûts des thérapies cellulaires.
Introduction
Le tissu adipeux, longtemps utilisé comme remplisseur en chirurgie reconstructive et esthétique, est récemment devenu plus populaire en médecine régénérative autrefois reconnue comme source de cellules souches mésenchymales (MSC)1. Lipoaspirates dissociéens enzymatiquement en suspensions unicellulaires donnent une fraction vasculaire stromale sans adipocyte (SVF) qui est utilisée inchangée chez le patient ou, plus généralement, est cultivée pendant plusieurs semaines dans les MSCs2.
Cependant, la dissociation enzymatique rompt les microenvironnements tissulaires, séquant les cellules régulatrices voisines des cellules régénératrices présumées qui deviennent considérablement modifiées par la culture in vitro. Pour éviter de tels artefacts expérimentaux et les altérations fonctionnelles qui en découlent, des tentatives ont été faites pour traiter le tissu adipeux à des fins thérapeutiques tout en maintenant sa configuration indigène aussi intacte que possible3,4. Notamment, la perturbation mécanique de tissu a commencé à remplacer la dissociation enzymatique. À cette fin, l'immersion complète fermé système micro-fragments lipoaspirates en sous-millimètre, sans sang et sans huile grappes tissulaires (par exemple, Lipogems) via une séquence de filtration de tamis et de marbre d'acier induit perturbation3. La transplantation autologue du tissu adipeux micro-fragmenté, utilisant cette technologie fermée de système, a été réussie dans les indications multiples, couvrant des cosmétiques, orthopédiques, proctologie et gynécologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
La comparaison entre le tissu adipeux micro-fragmenté humain (MAT) obtenu avec le dispositif fermé de système et Le SVF isogénique a indiqué qu'en ce qui concerne la distribution vasculaire/stromale de cellules et l'activité sécrétrice dans la culture, MAT contient plus de péricytes, qui sont présumé MSCs14, et sécrète des quantités plus élevées de facteurs de croissance et cytokines15.
Le présent article illustre la micro-fragmentation sans enzymes du tissu adipeux sous-cutané humain à l'aide d'un dispositif système fermé, et le traitement ultérieur de ces tissus adipeux micronisés pour la culture in vitro, l'immunohistochimie et l'analyse FACS, afin d'identifier les types de cellules présentes et les facteurs solubles sécrétés (Figure 1). La méthode décrite génère sans risque des organoïdes dérivés d'adipose sous-millimètres contenant des populations viables de cellules adipeuses dans une niche intacte, adaptée à d'autres applications et études.
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Protocol
L'approbation éthique de l'utilisation des tissus humains dans cette recherche a été obtenue du South East Scotland Research Ethics Committee (référence : 16/SS/0103).
1. Sous-cutané abdominal Adipose Tissue Collection
REMARQUE: Tous les instruments utilisés dans la procédure manuelle de lipo-aspiration sont fournis par le fabricant de l'appareil de micro-fragmentation.
- Maintenir la stérilité de tous les fluides, conteneurs, instruments et la zone opérationnelle tout au long de l'expérience.
- Placez l'échantillon d'abdominoplastie (procuré par l'équipe chirurgicale dans un sac stérile sans aucune solution) sur un chiffon chirurgical avec la peau orientée vers le haut. Aucun lavage n'est nécessaire. Pour une utilisation optimale, maintenez l'échantillon à 4 oC et traitez l'échantillon adipeux dans les 16 h suivant la récolte.
- Injecter 50 à 100 ml de solution NaCl de 37 oC 0,9 %, selon la taille de l'échantillon tissulaire (utiliser 50 ml pour un maximum de 15 cm2 surface adipeuse et augmenter le volume en conséquence), à l'aide d'une canule d'infiltration de tissu jetable, dans le sous-cutané Adipeux. Manipulez le spécimen par la partie cutanée.
- Connectez une seringue de verrouillage Luer de 10 ml à une canule jetable de liposuccion.
- Instaurez soigneusement la canule à l'intérieur du tissu adipeux à partir des bords. Une fois à l'intérieur, créer le vide à l'intérieur de la seringue en tirant le piston. Maintenez le piston en position à la main pour fixer l'aspiration sous vide.
- Faire des mouvements radiaux à l'intérieur de l'échantillon de tissu adipeux jusqu'à ce que la seringue soit pleine de lipoaspirate. Retirez soigneusement la canule du tissu et débranchez la seringue. Connectez une nouvelle seringue vide.
- Répétez la procédure jusqu'à ce que 60 ml de lipoaspirate aient été collectés.
REMARQUE: La quantité maximale de lipoaspirate qui peut être traitée change en fonction du type d'appareil utilisé. S'il vous plaît se référer aux instructions du fabricant (Tableau des matériaux).
2. Micro-fragmentation du lipoaspirate
REMARQUE: Ce protocole est destiné à l'utilisation de la recherche seulement. La micro-fragmentation est réalisée à l'aide d'un appareil disponible dans le commerce (Tableau des matériaux).
- Retirez l'appareil de l'emballage et vérifiez que l'unité principale est connectée au sac à déchets. Placez le sac de collecte des déchets sur le sol et assurez-vous que les vannes sont fixées aux bouchons de l'unité de processus.
- Connectez la pointe terminale de la ligne d'entrée au sac salin en perçant le port de raccordement du sac. Gardez le sac salin plus haut que l'unité de traitement.
REMARQUE: Pour le type d'appareil utilisé dans ce protocole, un sac de 2 000 ml de salin stérile est recommandé. - Vérifier que les 5 pinces reliées aux tubes des circuits sont ouvertes. Placez l'unité de traitement en position verticale avec le capuchon gris vers le haut.
- Laissez la solution saline remplir l'unité de traitement. Vérifiez que le flux atteint le sac à déchets. Retirez toutes les bulles d'air de l'unité de traitement en la secouant.
REMARQUE: Tous les passages suivants doivent être effectués en l'absence d'air dans l'unité de traitement. - Placez l'unité de traitement en position verticale avec le capuchon bleu vers le haut et fermez la pince à côté de la ligne d'entrée.
- Commencez à injecter le lipoaspirate en connectant la seringue à la valve auto-occluding du bouchon d'entrée bleu. Gardez l'unité de traitement verticale pendant cette procédure et tirez lentement le piston de seringue jusqu'à ce que tout le lipoaspirate ait été transféré à l'unité. Répétez le processus jusqu'à ce que tout le lipoaspirate soit à l'intérieur de l'unité de traitement.
REMARQUE: Pour l'unité de traitement utilisée dans la vidéo, ajouter un maximum de 30 ml de lipoaspirate à l'époque. La procédure peut être effectuée au maximum deux fois, jusqu'à ce que 60 ml de lipoaspirate ont été traités. - Ouvrez la pince d'entrée pour rétablir le flux salin.
- Secouez vigoureusement l'unité de traitement pendant 2 min au moins, en vérifiant régulièrement le flux de solution saline dans le sac à déchets.
- Lorsque la solution saline de l'unité de traitement devient transparente, après environ 2 min de secousses, placez l'unité avec le capuchon gris vers le haut, et fermez la pince située sur le drain près du capuchon gris. Le tissu traité flottera en haut.
- Remplissez une seringue de verrouillage Luer de 10 ml d'une solution saline et connectez-la à la soupape de chargement du bouchon bleu. Fermez la pince située près du bouchon bleu. Connectez une seringue de verrouillage Luer vide de 10 mL, avec le piston complètement inséré, à la valve du bouchon gris.
REMARQUE: Utilisez des seringues de verrouillage Luer seulement. - Insufflez fermement la saline dans l'unité de traitement à partir du capuchon bleu. Assurez-vous que la seringue reliée à la valve grise est par conséquent remplie avec le tissu traité. Une fois injecté tous les salins, retirez soigneusement les deux seringues.
- Répétez les étapes 2.10 et 2.11 jusqu'à ce que tous les tissus traités soient recueillis.
REMARQUE: Le rendement moyen de MAT est de 30 ml à partir de 60 ml de lipoaspirate manuel. Certains tissus resteront à l'intérieur de l'unité de traitement et certains amas pourraient être présents attachés au bord bleu à l'intérieur de l'unité. - À la fin du traitement, retirez toutes les seringues, fermez toutes les pinces, détachez le sac salin et jetez l'appareil selon les protocoles locaux.
REMARQUE: Le dispositif de traitement ne peut pas être réutilisé.
3. Immunohistochimie de fluorescence
- Transférer 300-500 OL de MAT dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 1 ml de paraformaldéhyde tamponné (PFA) à 4 %, mélanger délicatement à la main (sans vortex) et laisser à 4 oC pendant la nuit (de 16 à 24 h).
- Recueillir le spécimen et le transférer dans un tube propre de 1,5 ml contenant 1 ml de PBS. Répétez l'étape deux fois pour enlever l'excès de PFA.
- Transférer le spécimen dans un saccharose de 15 % (w/v) dans la solution PBS et incuber à 4 oC pendant la nuit (de 16 à 24 h)
- Transférer le spécimen dans un puits d'une plaque de 24 puits et ajouter une solution d'intégration faite de 15% de saccharose et 7% de gélatine (w/v) en PBS. Remplissez le puits à mi-chemin. Incuber pendant 4 h à 37 oC.
- Transférer les échantillons à 4 oC. Après 2-4 h pour que la gélatine se solidifie, remplissez le puits avec la solution d'intégration et laissez-la à 4 oC pendant la nuit.
- Retirer les échantillons des puits. Enlever l'excès de composé d'incorporation et congeler sur la glace sèche. Conserver les échantillons à -80 oC.
- Couper des sections de 8 à 10 m d'épaisseur à l'aide d'un cryostat. Pour une section optimale, utilisez le cryostat à -30 oC. Les glissières peuvent être stockées à -80 oC.
- Avant de procéder à l'immunofluorescence, fixer les sections en 4 % de PFA pendant 7 min. Retirez le PFA et lavez-les deux fois avec du PBS tiède (37 oC) afin d'enlever la gélatine des sections.
- Bloquer la fixation non spécifique des anticorps en couvant les lames avec 10 % de sérum de chèvre dans PBS (v/v) pendant 1 h à température ambiante.
- Diluer les anticorps primaires dans le diluant d'anticorps ou 0,2 % (w/v) albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS (w/v) : souris anti-humaine-NG2 (1:100, stock 0.5 mg/mL), lapin anti-humain-PDGFRMD (1:100, stock 0.15 mg/mL).
- Retirez la solution de blocage et ajoutez les anticorps primaires dilués. Incuber à 4 oC pendant la nuit.
REMARQUE: Effectuer toutes les étapes d'incubation à partir de maintenant dans l'obscurité. - Retirer les anticorps primaires et laver 3 fois avec du PBS pendant 10 min à chaque fois.
- Diluer les anticorps secondaires dans le diluant d'anticorps ou 0,2% (w/v) BSA dans PBS : chèvre anti-souris- 555 (1:300), chèvre anti-lapin- 647 (1:300). Incuber 1 h à température ambiante.
- Retirer les anticorps secondaires et laver trois fois avec du PBS pendant 10 min à chaque fois.
- Si une lectine conjuguée à la biotine est utilisée, utilisez le kit de blocage de l'avidine/biotine. Incuber pendant 10 min avec chaque réactif fourni avec deux lavages entre les deux avec PBS.
- Répétez l'étape de blocage en couvant les diapositives pendant 1 h à température ambiante avec 10% de sérum de chèvre en PBS.
- Ajouter la lectine biotinylated, biotinylated Ulex europaeus lectin (1:200, stock 2 mg/mL), dilué soit en 0,2% BSA (w/v) en PBS ou diluant d'anticorps. Incuber 1 h et 30 min à température ambiante.
- Enlever l'excès de lectine biotinylated et laver trois fois avec PBS pendant 10 min à chaque fois.
- Ajouter l'anticorps conjugué secondaire streptavidin dilué dans 0,2% (w/v) BSA dans PBS ou diluant d'anticorps. Incuber pendant 1 h.
- Retirer l'anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS pendant 10 min à chaque fois.
- Les noyaux antitaches avec 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:500, stock 5 mg/mL), dilués en 0,2% BSA (w/v) en PBS, pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez la solution DAPI et lavez-la deux fois avec du PBS, 10 min à chaque fois.
- Montez les toboggans avec un agent de montage aqueuse. Laisser sécher complètement, soit pendant la nuit sur le banc dans l'obscurité ou 1 h à 37 oC.
- Maintenez les diapositives à 4 oC dans l'obscurité et acquérez des images sur un microscope à épifluorescence.
4. Digestion du tissu adipeux micro-fragmenté et de l'isolement cellulaire
- Transférer le tissu adipeux micro-fragmenté dans un récipient stérile.
- Fraîchement faire le milieu de digestion en dissolvant le type-II collagène dans DMEM à la concentration de 1 mg/mL.
- Ajouter le même volume de milieu de digestion au tissu adipeux micro-fragmenté (c.-à-d., pour 30 ml d'échantillon ajouter 30 ml de milieu de digestion).
- Placer le récipient scellé dans un bain d'eau à 120 tr/min pendant 45 min. Veuillez noter que le contenant doit permettre une secousse appropriée de l'échantillon. Si un grand contenant n'est pas disponible, utiliser deux tubes de 50 ml (30 ml de mélange moyen échantillon/digestion dans chacun) placés horizontalement.
- Après l'incubation, bloquer la digestion en ajoutant un volume égal de solution de blocage (2 % (v/v) FCS/PBS) et filtrer séquentiellement à travers des passoires à cellules de 100 et 70 m.
- Centrifugeuse la suspension filtrée pendant 5 min à 200 x g. Jetez le supernatant.
- Resuspendre la pastille dans environ 5 ml de tampon de lyse érythrocyte (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7,65). Le volume de tampon peut varier en fonction de la contamination par l'érythrocyte observée dans la pastille cellulaire. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Ajoutez un volume égal de solution de blocage et filtrez à travers une passoire cellulaire de 40 m.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 200 x g et jeter le supernatant.
- Resuspendre la pastille dans la solution de blocage. Bien mélanger par pipetting. Comptez les cellules viables avec l'exclusion bleue de Trypan sur un hémocytomètre.
- Mélanger un volume égal de la suspension cellulaire avec la tache bleu Trypan. Aspirez 10 L de la solution et placez-la sur un hémocytomètre.
- Comptez le nombre de cellules vivantes (brillantes et rondes) présentes dans au moins 5 carrés et obtenez le nombre moyen de cellules. Afin d'inclure le facteur de dilution des taches, multipliez le nombre moyen de cellules par 2. Pour obtenir le nombre total de cellules vivantes par 1 ml d'échantillon, multipliez le nombre obtenu par 104.
REMARQUE : La suspension à cellule unique obtenue, à savoir la fraction vasculaire stromale (SVF), peut être ensemencée à 20 000 cellules/cm2 dans le milieu de croissance périvasculaire (DMEM complété par 20 % de FCS inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % L-glutamine) ou utilisé pour l'analyse et le tri de la cytométrie du débit. Le rendement moyen des cellules nucléées dans le SVF est d'environ 3 x 104 cellules par mL de MAT. Les expériences de tri nécessitent au moins 8 x 105 cellules pour obtenir suffisamment de cellules périvasculaires pour la culture.
5. Étiquetage et tri des cellules
- Centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante pendant 5 min à 200 x g,et re-suspendre la pastille dans le milieu de blocage à une concentration de 1 x 106 cellules par 100 l.
- Aliquot au moins 50.000 cellules pour le contrôle non taché et la fluorescence moins un (FMO) contrôle dans le polystyrène rond tubes de cytométrie de flux de fond. Utilisez le reste des cellules pour la coloration multicolore en plaçant dans un autre tube.
REMARQUE : Une fois que les paramètres de l'expérience ont été établis (c.-à-d. intensité laser, stratégie de gating), le nombre de cellules utilisées pour le contrôle non taché et les ORF peuvent être réduits, si les anticorps utilisés sont les mêmes. - Ajoutez des anticorps CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) et CD146-BV711 (1:100) à la suspension à cellule unique pour coloration multicolore. Pour les contrôles FMO, ajouter: pour les volumes équivalents V450 FMO de CD34-PE et CD146-BV711 plus V450 contrôle isotype; pour les volumes équivalents PE FMO de CD31-V450, CD45-V450 et CD146-BV711 plus le contrôle de l'isotype PE; pour les volumes équivalents BV711 FMO de CD31-V450, CD45-V450 et CD34-PE plus BV711 isotype control.
- Doucement pipette, ou vortex lentement la solution dans le tube pour mélanger et incuber les tubes à 4 oC pendant 20 min dans l'obscurité.
- Préparer les perles de contrôle de compensation. Ajouter 15 l de perles positives et 15 l de perles négatives à 70 l de milieu de blocage dans 3 tubes de cytométrie à débit rond à fond de polystyrène. Ajoutez des anticorps CD34-PE, CD31-V450 ou CD45-V450, et des anticorps CD146-BV711, un par tube.
- Doucement pipette, ou vortex lentement, pour mélanger les anticorps avec les perles et incuber tous les tubes à 4 oC pendant 20 min dans l'obscurité.
REMARQUE : La procédure décrite peut être utilisée soit pour l'analyse de cytométrie de flux ou pour le tri cellulaire. - Préparer les tubes de collecte en prémouillant la surface intérieure des tubes avec un milieu de croissance endothéliale (EGM), laissant environ 50 ll de milieu au fond de chaque tube.
- Après l'incubation des anticorps, enlever l'excès d'anticorps en lavant les cellules et les perles avec 2 ml de milieu de blocage.
- Retirez la solution en centrifuant les tubes à 200 x g pendant 5 min et en aspirant soigneusement le supernatant. Recenser l'étape de lavage.
- Resuspendre les cellules dans le milieu de blocage à une concentration finale de 1 x 106 cellules par 250 L. Resuspendre les perles dans 100 l de milieu de blocage.
- Transférer les cellules dans de nouveaux tubes de cytométrie à écoulement à fond rond en polystyrène avec capuchon de passoire cellulaire. Cela permettra de perturber les amas cellulaires.
- Transportez toutes les suspensions de cellules et de perles au trieur de cellules sur la glace dans l'obscurité.
- Exécuter des cellules témoins non tachées pour établir la fluorescence de fond et définir les tensions.
- Exécuter les tubes de contrôle de compensation pour définir la compensation de fluorescence.
- Utilisez la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs zone de diffusion latérale (SSC-A) pour identifier les cellules, puis utilisez la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs la hauteur de diffusion vers l'avant (FSC-H) pour sélectionner les cellules uniques.
- Ajouter le DAPI, une solution de 5 g/mL pour chaque mL d'échantillon, au contrôle non taché pour définir le gating pour les cellules mortes (Figure 2). Aucun lavage n'est nécessaire après la coloration DAPI.
- Exécuter des contrôles d'isotype pour établir les seuils de fluorescence de fond liés à la liaison non spécifique et définir le gating.
- Exécuter l'échantillon souillé multicolore. Exclure les cellules hématopoïétiques et endothéliales en gating sur les cellules négatives CD31 et CD45. Recueillir les populations de péricytes (CD146et CD34-) et de cellules adventielles (CD146- CD34) dans des tubes de collecte (figure 2).
REMARQUE : Les rendements optimaux viables de cellules sont approximativement 2% de la dissociation totale de cellules vivantes pour des péricytes et 1.5% pour les cellules adventielles.
6. Culture cellulaire
- Graines de péritéytes fraîchement triés et de cellules adventielles à une densité de 30 000 à 40 000 cellules/cm2 sur des plaques de culture recouvertes de gélatine
- Pour enrober les plaques de culture, recouvrir la surface de la plaque de gélatine stérile de 0,2 % (w/v) dans la solution PBS (environ 100 l de solution par cm2). Incuber à température ambiante pendant 10 min et retirer la solution. Conserver les cellules fraîchement triées sur la glace pendant le revêtement de plaque de culture.
- Centrifugeuses cellules fraîchement récoltées à 200 x g pendant 5 min et re-suspendre doucement la pastille cellulaire dans une quantité appropriée de milieu de croissance endothéliale (EGM). Si le nombre de cellules recueillies est très faible, évitez la centrifugation et la plaque directement les cellules recueillies.
- Ensemencer les cellules sur des plaques recouvertes de gélatine. Incuber à 37 oC dans 5 % de CO2.
- Une fois que les cellules se sont installées et ont adhéré à la plaque (après au moins 72 h), échangez l'EGM avec le milieu de croissance périvasculaire (DMEM complété avec 20% de chaleur inactivée FCS, 1% pénicilline/streptomycine et 1% L-glutamine) pour les péricytes et les cellules adventices.
- Une fois que les péridytes et les cellules adventitielles ont atteint la confluence de 80%-90%, dissocient des cellules utilisant 0.05% trypsin-EDTA. Recueillir avec 5% FCS/PBS, centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min, re-suspendre dans le milieu de croissance des cellules périvasculaires, puis passer les cellules de 1:3 à 1:5 ratio (ou à environ 7.000 cellules/ cm2) sur des plaques ou des flacons de culture de polystyrène non couché.
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Representative Results
La dissociation mécanique des lipoaspirates manuels a entraîné la production de tissu adipeux micro-fragmenté (MAT), composé d'un agrégat d'adipocytes enveloppant un réseau microvasculaire(figure 3). L'analyse d'immunofluorescence du MAT gélatinisé et cryofixed met en évidence cette structure, montrant le réseau vasculaire marqué par le marqueur cellulaire endothélial Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) récepteur composé principalement de petits vaisseaux capillaires ( Figure 4). Notamment les péritéytes exprimant NG2 ou PDGFR sont normalement distribués, ensheathing cellules endothéliales (Figure 4). Ces données confirment que le processus mécanique de microfragmentation n'affecte pas le compartiment cellulaire périvasculaire. La présence des cellules périvasculaires, les péricytes et les cellules adventielles, a été confirmée par cytométrie de flux. Pour sélectionner les cellules, une zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs zone de dispersion latérale (SSC-A) a été utilisée (figure 2A). La population cellulaire identifiée a été plus fermée à l'aide de la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs hauteur de diffusion vers l'avant (FSC-H) pour sélectionner les cellules individuelles et les cellules vivantes ont été identifiées comme négatives pour la coloration DAPI (figure 2B-C). Les marqueurs CD31 et CD45 ont été utilisés pour exclure les cellules hématopoïétiques et endothéliales(figure 2C). Enfin, les péritéytes ont été identifiés comme Étant CD146et CD34- et les cellules adventices comme CD146- CD34( figure 2D). La stratégie de gating est résumée à la figure 2. La même stratégie de gating a été suivie pour les expériences de tri. Les péritéytes MAT purifiés par les FACS et les cellules adventielles présentent tous deux un fuseau à la morphologie stellate en culture. La culture pendant 8 jours a montré que MAT sécrète plus de cytokines (adiponectin, CD14, CD31, CD154, chitinase 3-like 1, complément facteur D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, T-NF, CD87), et angiogenic facteurs (angiogénine, angiostatine, DPPIV, endogène, HGF, leptine, PDGFAB/BB, PlGF, thrombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro que SVF. En outre, les cytokines et les facteurs angiogéniques produits par MAT et SVF étaient plus abondants dans les supernatants de MAT. En conséquence, MAT digéré avec de la collagène et placé en culture a produit un sécrome similaire à celui observé à partir de SVF15classique . À l'échelle mondiale, toutes ces données démontrent que le tissu adipeux microfragmenté est non seulement thérapeutiquement avantageux, mais aussi favorable aux investigations phénotypiques et fonctionnelles. En particulier, la petite taille des grappes de MAT permet d'tester l'activité sécrétrice dans la culture, ce qui serait plus difficile avec de gros morceaux de tissu adipeux.
Figure 1 : Représentation schématique de la micro-fragmentation du tissu adipeux sous-cutané. Lipoaspirate est prélevé dans un tissu adipeux sous-cutané à l'aide d'une canule. Le lipoaspirate collecté est micro-fragmenté à l'aide du dispositif système étroit. Le tissu adipeux micro-fragmenté résultant (MAT) est composé par plusieurs types de cellules comprenant des cellules périvasculaires et des adipocytes. MAT peut être utilisé dans plusieurs tests, y compris la culture d'explantation et l'immunohistochimie, et pour l'isolement cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de gating représentative pour l'analyse/tri des cellules périvasculaires à partir du MAT. Une zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs zone de dispersion latérale (SSC-A) est utilisée pour identifier les cellules (A), suivie de la zone de diffusion vers l'avant (FSC-A) vs hauteur de diffusion vers l'avant (FSC-H) pour sélectionner les cellules uniques (B). Les cellules non endothéliales et non hématopoïétiques viables sont fermées comme négatives pour DAPI, CD31-V450 et CD45-V450 respectivement, dans le même panneau (C). Enfin, les cellules périvasculaires sont identifiées comme des péritéytes (CD146- CD34-) ou des cellules adventices (CD146- CD34) (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Morphologie MAT. Vue lumineuse de champ de MAT cultivée dans le milieu basal. Barre d'échelle de 1 000 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Réseau Vasculature dans MAT. Les cellules endothéliales sont tachées d'UEA-1. Les zones en boîte en A sont montrées agrandies dans B et C. Arrowheads indiquent des péritéytes, qui ont été tachés à l'aide d'anticorps contre LE PDGFR et le NG2. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cet article décrit la fractionnement physique, utilisant un dispositif fermé de système, du tissu adipeux humain en petits groupes affichant la microanatomie normale de tissu adipeux.
Le tissu adipeux sous-cutané humain aspiré manuellement et la solution saline sont chargés dans un cylindre en plastique transparent contenant de grandes sphères métalliques de flipper-modèle qui, après secousse manuelle vigoureuse de l'appareil, rupture de la graisse en sous-millimètre Fragments. Les filtres et la prise ci-joint permettent d'éliminer les débris, le sang et les lipides libres et le MAT est recueilli dans une seringue reliée à l'appareil. Ici, MAT a été traité avec succès pour l'immunohistochimie, la cytométrie de flux et la culture, bien que ce dispositif spécifique ait été développé dans une perspective médicale, pour remplacer dans le théâtre le tissu adipeux enzymatiqueproduit stromal vasculaire vasculaire fraction ou culture dérivée des cellules souches adipeuses, et en effet s'est avéré très efficace dans la chirurgie plastique et diverses autres thérapies cellulaires4,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Par conséquent, le tissu adipeux longtemps utilisé intact comme simple remplisseur16 revient dans sa configuration tridimensionnelle indigène, après des années de dissociation enzymatique et de culture in vitro. Cela suit une tendance générale à la croissance et à l'étude des tissus dans leur arrangement multicellulaire inné plutôt que comme populations cellulaires dispersées, comme l'illustre la popularité croissante des organoïdes17.
La fragmentation de tissu adipeux utilisant ce dispositif mécanique s'est avérée fiable et reproductible et aucune modification du protocole original n'a jamais été nécessaire. L'approvisionnement ordinaire en graisse soumettale humaine pour des études expérimentales est un lipoaspirate collecté pour des raisons esthétiques, qui est chargé directement sur le dispositif de fragmentation. Une limitation pour les utilisateurs dans le laboratoire de recherche, cependant, est que le tissu adipeux à traiter doit être doucement aspiré à la main, pour maintenir la microarchitecture tissulaire aussi intacte que possible, et ne pas aspirer avec une pompe à vide comme c'est régulièrement fait dans le fonctionnement pièce. À moins qu'un chirurgien prêt à recueillir manuellement les graisses puisse être identifié, un résidu d'abdominoplastie fraîchement réséqué peut être utilisé. La graisse attachée à l'aspect intérieur de la peau abdominale peut alors être soigneusement et stérilement aspirée avec la seringue fournie avec le kit. C'est la raison pour laquelle nous avons décrit cette étape au début du protocole (étape 1).
Qu'est-ce qui explique réellement la supériorité thérapeutique du MAT sur le tissu adipeux dissocié enzymatique? L'analyse de cytométrie de flux de MAT enzymatiquement dissocié immédiatement après fractionnement a indiqué une proportion plus élevée de péricytes, connus sous le nom de précurseurs innés des cellules souches mésenchymales14,par rapport au tissu adipeux aspiré total15 . Plus directement, l'analyse comparative des supernatants de culture de MAT et de SVF a prouvé que les premiers sécrètents, qualitativement et quantitativement, plus de facteurs de croissance et de cytokines impliqués indirectement dans la réparation de tissu. Il s'agit notamment de facteurs pro-angiogéniques, ainsi que divers médiateurs de l'immuno-inflammation15.
Au-delà de ces résultats récents, il reste encore beaucoup à comprendre quant à la base moléculaire du potentiel thérapeutique mAT. À cette fin, la méthode décrite ici représente une technique simple et rapide qui a un faible impact sur la niche adipeuse et génère MAT idéal pour une manipulation expérimentale plus poussée. D'un point de vue accessoire, des recherches sont également menées pour améliorer la convivialité du MAT dans la clinique; à cet égard, déterminer si le tissu adipeux micro-fragmenté peut être congelé pour l'administration autologue ou allogénique retardée apparaît comme une priorité. Enfin, il sera important de déterminer si d'autres tissus et organes tels que la moelle osseuse, le pancréas ou le muscle squelettique, pour n'en citer que quelques-uns, peuvent être micro-fragmentés avec le même dispositif et fournir intacte microvasculature s'y prêtent niches cellulaires à l'intervention expérimentale.
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Disclosures
CT est l'un des fondateurs de Lipogems.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Claire Cryer et Fiona Rossi de l'Université d'Édimbourg pour leur aide experte en cytométrie des flux. Nous tenons également à remercier le personnel de l'hôpital de Murrayfield qui a contribué en fournissant des échantillons de tissus.
Ce travail a été soutenu par des subventions de la British Heart Foundation et lipogems, qui a fourni des kits de traitement des tissus adipeux. Des échantillons de tissus humains pour adultes ont été obtenus avec la pleine autorisation éthique du South East Scotland Research Ethics Committee (référence : 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
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