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Biology

Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung

doi: 10.3791/60117 Published: October 20, 2019

Summary

Hier präsentieren wir menschliche Fettgewebe enzymfreie Mikrofragmentierung mit einem geschlossenen Systemgerät. Diese neue Methode ermöglicht die Gewinnung von Submillimeter-Clustern von Fettgewebe, die für In-vivo-Transplantationen, In-vitro-Kulturen und weitere Zellisolation und -charakterisierung geeignet sind.

Abstract

In den letzten zehn Jahren wurden Fettgewebetransplantationen häufig in der plastischen Chirurgie und Orthopädie eingesetzt, um die Gewebeaufreicherung und/oder Regeneration zu verbessern. Dementsprechend haben sich Techniken zur Ernte und Verarbeitung von menschlichem Fettgewebe entwickelt, um schnell und effizient große Mengen an Gewebe zu erhalten. Unter diesen stellt die geschlossene Systemtechnologie ein innovatives und einfach zu bedienendes System zur Ernte, Verarbeitung und Reinjektion von raffiniertem Fettgewebe in kurzer Zeit und in der gleichen Intervention (intraoperativ) dar. Adiposegewebe wird durch Fettabsaugung, gewaschen, emulgiert, gespült und mechanisch in Zellcluster von 0,3 bis 0,8 mm gehackt. Indikationen wie ästhetische Medizin und Chirurgie, orthopädische und allgemeine Chirurgie. Die Charakterisierung von mikrofragmentiertem Fettgewebe ergab das Vorhandensein intakter kleiner Gefäße in den Adipozyten-Clustern; daher bleibt die perivaskuläre Nische ungestört. Diese Cluster sind in perivaskulären Zellen angereichert (d. h. mesenchymale Stammzell (MSC) Vorfahren) und In-vitro-Analysen zeigten eine erhöhte Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, die an der Gewebereparatur und -regeneration beteiligt sind, im Vergleich zu enzymatisch abgeleiteten MSCs. Dies deutet darauf hin, dass das überlegene therapeutische Potenzial des mikrofragmentierten Fettgewebes durch eine höhere Häufigkeit von mutmaßlichen MSCs und verbesserte sekretore Aktivität erklärt wird. Ob diese zusätzlichen Pericyte direkt zu einem höheren Wachstumsfaktor und zur Zytokinproduktion beitragen, ist nicht bekannt. Dieses klinisch zugelassene Verfahren ermöglicht die Transplantation mutmaßlicher MSCs ohne Erweiterung und/oder enzymatische Behandlung, wodurch die Anforderungen der GMP-Richtlinien umgangen werden und die Kosten für zellbasierte Therapien gesenkt werden.

Introduction

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Adipose Gewebe, lange als Füllstoff in der rekonstruktiven und kosmetischen Chirurgie verwendet, ist in letzter Zeit beliebter in der regenerativen Medizin einmal als Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs)anerkannt1 . Lipoaspiraturen, die enzymatisch in einzellige Suspensionen dissoziiert sind, ergeben eine adipozytenfreie stromale Gefäßfraktion (SVF), die unverändert beim Patienten verwendet wird oder, häufiger, für mehrere Wochen in MSCs2kultiviert wird.

Die Enzymdissoziation bricht jedoch die Gewebemikroumgebungen und schützt benachbarte regulatorische Zellen von mutmaßlichen regenerativen Zellen ab, die durch die In-vitro-Kultur erheblich verändert werden. Um solche experimentellen Artefakte und daraus resultierenden funktionellen Veränderungen zu vermeiden, wurden Versuche unternommen, Fettgewebe für den therapeutischen Gebrauch zu verarbeiten und gleichzeitig seine native Konfiguration so intakt wie möglich zu halten3,4. Insbesondere die mechanische Gewebestörung hat begonnen, die enzymatische Dissoziation zu ersetzen. Zu diesem Zweck wird das vollständige Tauchsystem Mikrofragmente Lipoaspiraten in submillimeter-, blut- und ölfreie Gewebehaufen (z.B. Lipogems) über eine Sequenz von Siebfiltration und Stahlmarmor induzierte Störung3. Die autologe Transplantation von mikrofragmentiertem Fettgewebe mit dieser geschlossenen Systemtechnologie war in mehreren Indikationen erfolgreich, die Kosmetika, Orthopädie, Proktologie und Gynäkologie umfassen4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.

Der Vergleich zwischen menschlichem mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das mit dem geschlossenen Systemgerät gewonnen wurde, und isogener SVF ergab, dass MAT in Bezug auf die vaskuläre/stromale Zellverteilung und die sekretorische Aktivität in der Kultur mehr Pericyte enthält, die mutmaßliche MSCs14und sezerniert höhere Mengen an Wachstumsfaktoren und Zytokinen15.

Der vorliegende Artikel veranschaulicht die enzymfreie Mikrofragmentierung des menschlichen subkutanen Fettgewebes mit einem geschlossenen Systemgerät und die Weiterverarbeitung solcher mikronisierten Fettgewebe für In-vitro-Kultur, Immunhistochemie und FACS-Analyse, um die vorhandenen Zelltypen und die sezernierten löslichen Faktoren zu identifizieren (Abbildung 1). Die beschriebene Methode erzeugt sicher adipose abgeleitete Submillimeter-Organoide, die lebensfähige Fettgewebezellpopulationen in einer intakten Nische enthalten, die für weitere Anwendungen und Studien geeignet ist.

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Protocol

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Die Ethikkommission für die Verwendung von menschlichem Gewebe in dieser Forschung wurde von der South East Scotland Research Ethics Committee (Referenz: 16/SS/0103) erteilt.

1. Subkutane Abdominal Adipose Gewebesammlung

HINWEIS: Alle im manuellen Lipo-Aspirationsverfahren verwendeten Instrumente werden vom Hersteller des Mikrofragmentierungsgeräts zur Verfügung gestellt.

  1. Bewahren Sie die Sterilität für alle Flüssigkeiten, Behälter, Instrumente und den Betriebsbereich während des gesamten Experiments aufrecht.
  2. Legen Sie die Abdominoplastikprobe (vom chirurgischen Team beschafft in einen sterilen Beutel ohne Lösung) auf ein chirurgisches Tuch mit der Nachobenhaut. Es ist kein Waschen erforderlich. Für eine optimale Anwendung die Probe bei 4 °C aufbewahren und die Fettprobe innerhalb von 16 h nach der Ernte verarbeiten.
  3. Injizieren Sie 50 bis 100 ml 37 °C 0,9% NaCl-Lösung, abhängig von der Größe der Gewebeprobe (verwenden Sie 50 ml für maximal 15 cm2 Fettgewebeoberfläche und erhöhen Sie das Volumen entsprechend), mit einer Einweg-Gewebeinfiltrationskanüle, in die subkutane Fettgewebe. Behandeln Sie die Probe durch den kutanen Teil.
  4. Schließen Sie eine 10 ml Luer-Sperrspritze an eine Einweg-Fettsaugkanüle an.
  5. Führen Sie die Kanüle vorsichtig in das Fettgewebe von den Rändern ein. Sobald Sie drinnen sind, erstellen Sie das Vakuum in der Spritze, indem Sie den Kolben ziehen. Halten Sie den Kolben von Hand in Position, um die Vakuumabsaugung zu sichern.
  6. Machen Sie radiale Bewegungen innerhalb der Fettgewebeprobe, bis die Spritze voller Lipoaspirat ist. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle aus dem Gewebe und trennen Sie die Spritze. Schließen Sie eine neue leere Spritze an.
  7. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 60 ml Lipoaspirat gesammelt wurden.
    HINWEIS: Die maximale Menge an Lipoaspirat, die verarbeitet werden kann, ändert sich je nach Art des verwendeten Geräts. Bitte beachten Sie die Herstelleranleitung (Materialtabelle).

2. Mikrofragmentierung des Lipoaspirats

HINWEIS: Dieses Protokoll ist nur für die Forschungsnutzung gedacht. Die Mikrofragmentierung erfolgt mit Hilfe eines handelsüblichen Geräts (Materialtabelle).

  1. Entfernen Sie das Gerät aus der Verpackung, und stellen Sie sicher, dass das Hauptgerät mit dem Abfallbeutel verbunden ist. Legen Sie den Abfallsammelbeutel auf den Boden und stellen Sie sicher, dass die Ventile an den Verschlüssen der Prozesseinheit befestigt sind.
  2. Schließen Sie die Klemmenspitze der Eingangsleitung an den Saline-Beutel an, indem Sie den Sackanschluss durchbohren. Halten Sie den Salinebeutel höher als die Verarbeitungseinheit.
    HINWEIS: Für den in diesem Protokoll verwendeten Gerätetyp wird ein 2.000 ml Beutel steriler Saline empfohlen.
  3. Stellen Sie sicher, dass alle 5 Klemmen, die mit den Rohren der Schaltkreise verbunden sind, geöffnet sind. Platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position mit der grauen Kappe nach oben.
  4. Lassen Sie die Saline-Lösung die Verarbeitungseinheit füllen. Prüfen Sie, ob der Fluss den Abfallbeutel erreicht. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Verarbeitungseinheit, indem Sie sie schütteln.
    HINWEIS: Alle folgenden Passagen müssen in Abwesenheit von Luft in der Verarbeitungseinheit durchgeführt werden.
  5. Platzieren Sie die Verarbeitungseinheit in einer vertikalen Position mit der blauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemme neben der Eingangslinie.
  6. Beginnen Sie mit der Injektion des Lipoaspirats, indem Sie die Spritze an das selbstverschließende Ventil der blauen Eingangskappe anschließen. Halten Sie die Verarbeitungseinheit während dieses Vorgangs vertikal und ziehen Sie den Spritzenkolben langsam, bis das gesamte Lipoaspirat auf das Gerät übertragen wurde. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich das gesamte Lipoaspirat innerhalb der Verarbeitungseinheit befindet.
    HINWEIS: Für die im Video verwendete Verarbeitungseinheit fügen Sie maximal 30 ml Lipoaspirat hinzu. Das Verfahren kann maximal zweimal durchgeführt werden, bis 60 ml Lipoaspirat verarbeitet wurden.
  7. Öffnen Sie die Eingangsklemme, um den Saline-Fluss wiederherzustellen.
  8. Mindestens 2 min die Verarbeitungseinheit kräftig schütteln und den Schaummittel-Lösungsfluss in den Abfallbeutel regelmäßig überprüfen.
  9. Wenn die Saline-Lösung in der Verarbeitungseinheit transparent wird, legen Sie nach ca. 2 min Schütteln das Gerät mit der grauen Kappe nach oben und schließen Sie die Klemme am Abfluss in der Nähe der grauen Kappe. Das verarbeitete Gewebe schwebt oben.
  10. Füllen Sie eine 10 ml Luer-Sperrspritze mit Einer saline Lösung und schließen Sie sie an das Ladeventil der blauen Kappe an. Schließen Sie die Klemme in der Nähe der blauen Kappe. Schließen Sie eine leere 10 ml Luer-Verriegelungsspritze mit vollständig eingesetztem Kolben an das Ventil der grauen Kappe an.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur Luer-Sperrspritzen.
  11. Die Saline aus der blauen Kappe fest in die Verarbeitungseinheit einspritzen. Stellen Sie sicher, dass die mit dem Grauen Ventil verbundene Spritze folglich mit dem verarbeiteten Gewebe gefüllt wird. Nachdem Sie die gesamte Saline injiziert haben, entfernen Sie vorsichtig beide Spritzen.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 2.10 und 2.11, bis das gesamte verarbeitete Gewebe gesammelt ist.
    HINWEIS: Die durchschnittliche Ausbeute von MAT beträgt 30 ml ab 60 ml manueller Lipoaspirat. Ein Teil des Gewebes bleibt in der Verarbeitungseinheit und einige Klumpen können an der blauen Kante innerhalb des Geräts befestigt sein.
  13. Am Ende der Verarbeitung alle Spritzen entfernen, alle Klemmen schließen, den Säumbeutel lösen und das Gerät nach lokalen Protokollen entsorgen.
    HINWEIS: Das Verarbeitungsgerät kann nicht wiederverwendet werden.

3. Fluoreszenz-Immunhistochemie

  1. Übertragen Sie 300-500 l MAT in ein 1,5 ml Rohr. 1 ml 4% gepuffertes Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, vorsichtig von Hand mischen (kein Wirbeln) und bei 4 °C über Nacht (von 16 bis 24 h) ablassen.
  2. Sammeln Sie die Probe und übertragen Sie in ein sauberes 1,5 ml Rohr mit 1 ml PBS. Wiederholen Sie den Schritt zweimal, um pfA-Überschuss zu entfernen.
  3. Die Probe in 15% (w/v) Saccharose in PBS-Lösung übertragen und bei 4 °C über Nacht inkubieren (von 16 auf 24 h)
  4. Die Probe in einen Brunnen einer 24-Well-Platte geben und eine Einbettlösung aus 15% Saccharose und 7% Gelatine (w/v) in PBS hinzufügen. Füllen Sie den Brunnen auf halbem Weg. 4 h bei 37 °C inkubieren.
  5. Übertragen Sie die Proben auf 4 °C. Nach 2-4 h für die Gelatine zu erstarren, füllen Sie den Brunnen mit der Einbettlösung und lassen Sie bei 4 °C über Nacht.
  6. Entfernen Sie die Proben aus den Brunnen. Überschüssige Einbettungsmasse entfernen und auf Trockeneis einfrieren. Bewahren Sie die Proben bei -80 °C auf.
  7. Schneiden Sie 8-10 'm dicke Abschnitte mit einem Kryostat. Für eine optimale Schnittierung verwenden Sie das Kryostat bei -30 °C. Dias können bei -80 °C gelagert werden.
  8. Bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren, fixieren Sie die Abschnitte in 4% PFA für 7 min. Entfernen Sie das PFA und waschen Sie zweimal mit lauwarmem PBS (37 °C), um Gelatine aus den Abschnitten zu entfernen.
  9. Blockieren Sie die unspezifische Antikörperbindung, indem Sie die Dias mit 10% Ziegenserum in PBS (v/v) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Verdünnung der primären Antikörper in Antikörperverdünnung simpermittel oder 0,2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS (w/v): Maus Anti-Human-NG2 (1:100, Lager 0,5 mg/ml), Kaninchen anti-human-PDGFR (1:100, Lager 0,15 mg/ml).
  11. Entfernen Sie die Blockierlösung, und fügen Sie die verdünnten Primärantikörper hinzu. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
    HINWEIS: Führen Sie von nun an alle Inkubationsschritte im Dunkeln aus.
  12. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie 3 Mal mit PBS für 10 min jedes Mal.
  13. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper in Antikörperverdünnung oder 0,2% (w/v) BSA in PBS: Ziege Anti-Maus- 555 (1:300), Ziege Anti-Kaninchen- 647 (1:300). 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  14. Entfernen Sie die sekundären Antikörper und waschen Sie dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal.
  15. Wenn ein Biotin konjugiertes Lektin verwendet wird, verwenden Sie das Avidin/Biotin-Blockierungskit. 10 min mit jedem Reagenz mit zwei Waschungen dazwischen mit PBS inkubieren.
  16. Wiederholen Sie den Blockierschritt, indem Sie die Dias 1 h bei Raumtemperatur mit 10% Ziegenserum in PBS inkubieren.
  17. Fügen Sie das biotinylatierte Lektin, biotinyliertes Ulex europaeus lectin (1:200, Vorrat 2 mg/ml), entweder in 0,2% BSA (w/v) in PBS oder Antikörperverdünnung verdünnt hinzugeben. 1 h und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  18. Überschüssiges biotinyliertes Lektin entfernen und dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal waschen.
  19. Fügen Sie den sekundären streptavidin konjugierten Antikörper hinzu, der entweder in 0,2% (w/v) BSA in PBS oder Antikörperverdünnung verdünnt ist. Inkubieren für 1 h.
  20. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie dreimal mit PBS für 10 min jedes Mal.
  21. Counterstain-Kerne mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1:500, Lager 5 mg/ml), verdünnt in 0,2% BSA (w/v) in PBS, für 10 min bei Raumtemperatur.
  22. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie sie zweimal mit PBS, jeweils 10 min.
  23. Montieren Sie die Dias mit einem wässrigen Montagemittel. Lassen Sie es vollständig trocknen, entweder über Nacht auf der Bank im Dunkeln oder 1 h bei 37 °C.
  24. Halten Sie die Dias bei 4 °C im Dunkeln und erfassen Sie Bilder auf einem Epifluoreszenzmikroskop.

4. Verdauung des mikrofragmentierten Fettgewebes und Zellisolierung

  1. Übertragen Sie das mikrofragmentierte Fettgewebe in einen sterilen Behälter.
  2. Das Verdauungsmedium frisch aufstellen, indem man die Typ-II-Kollagenase in DMEM in der Konzentration von 1 mg/ml auflöst.
  3. Fügen Sie dem mikrofragmentierten Fettgewebe das gleiche Volumen des Verdauungsmediums hinzu (d. h. für 30 ml Probe 30 ml Verdauungsmedium hinzufügen).
  4. Legen Sie den versiegelten Behälter 45 min in ein 37 °C Schüttelwasserbad mit 120 Umdrehungen pro Minute. Bitte beachten Sie, dass der Behälter ein ordnungsgemäßes Schütteln der Probe ermöglichen sollte. Wenn kein großer Behälter verfügbar ist, verwenden Sie zwei 50 ml Rohre (jeweils 30 ml Proben-/Verdauungsmediummischung) horizontal platziert.
  5. Blockieren Sie nach der Inkubation die Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen an Blockierlösung (2% (v/v) FCS/PBS) hinzufügen und sequenziell durch 100 m und 70 m Zellsiebe filtern.
  6. Zentrifugieren Sie die gefilterte Aufhängung für 5 min bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand.
  7. Das Pellet in ca. 5 ml Erythrozytenlysepuffer (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7,65) wieder aufsetzen. Das Puffervolumen kann je nach der erythrozytenKontamination, die im Zellpellet beobachtet wird, variieren. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
  8. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Blockierlösung hinzu und filtern Sie durch ein 40-m-Zellensieb.
  9. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 200 x g und entsorgen Sie den Überstand.
  10. Setzen Sie das Pellet in der Sperrlösung wieder aus. Durch Pipettieren gut mischen. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypan-Blauausschluss auf einem Hämozytometer.
    1. Mischen Sie ein gleiches Volumen der Zellsuspension mit Trypan blauen Fleck. 10 l der Lösung aspirieren und auf ein Hämozytometer legen.
    2. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen (hell und rund), die in mindestens 5 Quadraten vorhanden sind, und erhalten Sie die mittlere Zellzahl. Um den Fleckenverdünnungsfaktor einzubeziehen, multiplizieren Sie die mittlere Zellzahl mit 2. Um die Gesamtzahl der lebenden Zellen pro 1 ml der Probe zu erhalten, multiplizieren Sie die erhaltene Zahl mit 104.
      HINWEIS: Die erhaltene einzellige Suspension, nämlich die stromale Gefäßfraktion (SVF), kann entweder mit 20.000 Zellen/cm2 im perivaskulären Zellwachstumsmedium (DMEM ergänzt durch 20% Inaktivierte Wärme, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) oder zur Analyse und Sortierung der Durchflusszytometrie verwendet. Die durchschnittliche Ausbeute von Nukleatzellen im SVF beträgt etwa 3 x 104 Zellen pro ml MAT. Sortierexperimente erfordern mindestens 8 x 105 Zellen, um genügend perivaskuläre Zellen für die Kultivierung zu erhalten.

5. Zellkennzeichnung und -sortierung

  1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min bei 200 x gund setzen Sie das Pellet in einem Blockiermedium in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen pro 100 l wieder auf.
  2. Aliquot mindestens 50.000 Zellen für die ungefärbte Kontrolle und die Fluoreszenz minus eins (FMO) steuert in Polystyrol runden Bodenfluss Zytometrie-Röhren. Verwenden Sie den Rest der Zellen für die mehrfarbige Färbung, indem Sie sie in ein anderes Rohr legen.
    HINWEIS: Sobald die Einstellungen des Experiments festgelegt wurden (d. h. Laserintensität, Gating-Strategie), kann die Anzahl der Zellen, die für die unbefleckte Steuerung verwendet werden, und die FMOs reduziert werden, wenn die verwendeten Antikörper identisch sind.
  3. Fügen Sie CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) und CD146-BV711 (1:100) Antikörper zur Einzelzellsuspension für mehrfarbige Färbung hinzu. Fügen Sie für die FMO-Steuerelemente hinzu: für die V450 FMO-Äquivalent-Volumes cd34-PE und CD146-BV711 plus V450-Isotypsteuerung; für die PE FMO-Äquivalent-Volumes cd31-V450, CD45-V450 und CD146-BV711 plus PE-Isotypkontrolle; für die BV711 FMO-Äquivalent-Volumes von CD31-V450, CD45-V450 und CD34-PE plus BV711-Isotypsteuerung.
  4. Sanft Pipette, oder Wirbel langsam die Lösung in der Röhre zu mischen und bebrüten die Rohre bei 4 °C für 20 min im Dunkeln.
  5. Vorbereiten von Kompensationskontrollperlen. Fügen Sie in 3 Polystyrol-Rundboden-Flow-Cytometrie-Röhren 15 L positive Perlen und 15 L Negativperlen zu 70 l Blockiermedium hinzu. Fügen Sie CD34-PE, CD31-V450 oder CD45-V450 und CD146-BV711 Antikörper hinzu, eine pro Tube.
  6. Sanft Pipette, oder Wirbel langsam, um die Antikörper mit den Perlen zu mischen und alle Rohre bei 4 °C für 20 min im Dunkeln zu inkubieren.
    HINWEIS: Das beschriebene Verfahren kann entweder für die Durchflusszytometrieanalyse oder die Zellsortierung verwendet werden.
  7. Bereiten Sie Sammelrohre vor, indem Sie die Innenfläche der Rohre mit endothelialem Wachstumsmedium (EGM) vorbenetzen, sodass ca. 50 l Medium auf der Unterseite jedes Rohres übrig bleiben.
  8. Nach der Antikörperinkubation, entfernen Sie den Überschuss an Antikörpern, indem Sie die Zellen und die Perlen mit 2 ml Blockiermedium waschen.
  9. Entfernen Sie die Lösung, indem Sie die Rohre 5 min bei 200 x g zentrieren und den Überstand sorgfältig anstreuen. Replizieren Sie den Waschschritt.
  10. Setzen Sie die Zellen im Blockiermedium in einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen pro 250 l aus. Setzen Sie die Perlen in 100 l Blockiermedium wieder aus.
  11. Übertragen Sie die Zellen in neue Polystyrol-Rund-Boden-Flow-Zytometrie-Röhren mit Zellsiebkappe. Dies wird die Störung von Zellklumpen ermöglichen.
  12. Transportieren Sie alle Zell- und Perlensuspensionen im Dunkeln zum Zellsortierer auf Eis.
  13. Führen Sie ungefärbte Steuerzellen aus, um die Hintergrundfluoreszenz zu ermitteln und die Spannungen einzustellen.
  14. Führen Sie die Kompensationskontrollröhrchen aus, um die Fluoreszenzkompensation einzustellen.
  15. Verwenden Sie Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs. Side Scatter Area (SSC-A), um Zellen zu identifizieren, und verwenden Sie dann Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H), um einzelne Zellen auszuwählen.
  16. Fügen Sie dAPI, 1 l von 5 g/ml Lösung für jede ml Probe, dem unbefleckten Steuerelement hinzu, um das Gating für abgestorbene Zellen festzulegen (Abbildung 2). Nach der DAPI-Färbung ist kein Waschen erforderlich.
  17. Führen Sie Isotypsteuerelemente aus, um Hintergrundfluoreszenzschwellenwerte für die nicht spezifische Bindung festzulegen und die Gating festzulegen.
  18. Führen Sie die mehrfarbige gebeizte Probe aus. Ausschließen von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen durch Gating auf CD31 und CD45 negativen Zellen. Sammeln Sie die Pericyte -(CD146+ CD34- )und die Adventitialcell (CD146- CD34+) Populationen in Sammelröhren (Abbildung 2).
    HINWEIS: Die optimalen zellfähigen Zellerträge betragen etwa 2 % der gesamten Livezelldissoziation für Pericyten und 1,5 % für adventliche Zellen.

6. Zellkultur

  1. Samen frisch sortierte Pericyten und adventliche Zellen mit einer Dichte von 30.000 bis 40.000 Zellen/cm2 auf gelatinebeschichteten Kulturplatten
  2. Um die Kulturplatten zu beschichten, bedecken Sie den Plattenbereich mit steriler 0,2% (w/v) Gelatine in PBS-Lösung (ca. 100 l Lösung pro cm2). Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren und die Lösung entfernen. Frisch sortierte Zellen während der Kulturplattenbeschichtung auf Eis halten.
  3. Zentrifugieren Sie frisch gesammelte Zellen bei 200 x g für 5 min und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig in einer angemessenen Menge an endothelialer Wachstumsmedium (EGM) wieder auf. Wenn die Anzahl der gesammelten Zellen sehr gering ist, vermeiden Sie die Zentrifugation und Platte direkt die gesammelten Zellen.
  4. Säen Sie die Zellen auf gelatinebeschichteten Platten. Bei 37 °C in 5%CO2inkubieren.
  5. Sobald sich die Zellen abgelegt und an der Platte haften (nach mindestens 72 h), tauschen Sie EGM mit dem perivaskulären Zellwachstumsmedium (DMEM ergänzt durch 20% hitzeinaktiviertes FCS, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin) gegen Pericytes und adventliche Zellen.
  6. Sobald Pericyten und adventliche Zellen 80%-90% Zusammenfluss erreicht haben, dissoziieren Zellen mit 0,05% Trypsin-EDTA. Mit 5% FCS/PBS, Zentrifuge bei 200 x g für 5 min, Re-Suspend in perivaskulärezelligem Zellwachstumsmedium, und dann die Zellen von 1:3 bis 1:5 Verhältnis (oder bei ca. 7.000 Zellen/cm2)auf unbeschichtete Polystyrol-Kulturplatten oder -Flaschen übertragen.

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Representative Results

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Die mechanische Dissoziation manueller Lipoaspiraten führte zur Herstellung von mikrofragmentiertem Fettgewebe (MAT), das aus einem Aggregat von Adipozyten besteht, die ein mikrovaskuläres Netzwerk umhüllen (Abbildung 3). Die Immunfluoreszenzanalyse von gelatine- und kryofixiertem MAT hebt diese Struktur hervor und zeigt das Gefäßnetzwerk, das durch den endothelialen Zellmarker Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1)-Rezeptor gekennzeichnet ist, der hauptsächlich aus kleinen, kapillaren Gefäßen besteht ( Abbildung 4). Insbesondere Pericyte, die NG2 oder PDGFR exdrücken, sind normal verteilt, ensheathing endotheliale Zellen (Abbildung 4). Diese Daten bestätigen, dass der mechanische Mikrofragmentierungsprozess das perivaskuläre Zellkompartiment nicht beeinflusst. Das Vorhandensein von perivaskulären Zellen, sowohl Pericyten als auch adventliche Zellen, wurde durch Durchflusszytometrie bestätigt. Zur Auswahl von Zellen wurde ein Vorwärtsstreubereich (FSC-A) vs. Side Scatter Area (SSC-A) Gate verwendet (Abbildung 2A). Die identifizierte Zellpopulation wurde weiter mit Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs. Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) abgegrenzt, um einzelne Zellen auszuwählen, und lebende Zellen wurden als negativ für DAPI-Färbung identifiziert (Abbildung 2B-C). CD31- und CD45-Marker wurden verwendet, um hämatopoetische und endotheliale Zellen auszuschließen (Abbildung 2C). Schließlich wurden Pericyte als CD146+ CD34- und adventitelle Zellen als CD146- CD34+ (Abbildung 2D) identifiziert. Die Gating-Strategie ist in Abbildung 2zusammengefasst. Die gleiche Gating-Strategie wurde für Sortierexperimente verfolgt. FACS-gereinigte MAT-Pericyten und adventliche Zellen weisen beide eine Spindel zur stellaten Morphologie in der Kultur auf. Kultur für 8 Tage zeigte, dass MAT mehr Zytokine (Adiponectin, CD14, CD31, CD154, Chitinase 3-like 1, Komplementfaktor D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-, CD87) und angiogenic Faktoren (Angiogenin, Angiostatin, DPPIV, Endoglin, HGF, Leptin, PDGFAB/BB, PlGF, Thrombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro als SVF. Darüber hinaus waren Zytokine und angiogene Faktoren, die sowohl von MAT als auch von SVF produziert wurden, häufiger bei MAT-Übertreibungen. Dementsprechend produzierte MAT, das mit Kollagenase verdaut und in Kultur platziert wurde, ein Sekretatom, das dem des herkömmlichen SVF15ähnelt. Weltweit zeigen all diese Daten, dass mikrofragmentiertes Fettgewebe nicht nur therapeutisch vorteilhaft ist, sondern auch für phänotypische und funktionelle Untersuchungen geeignet ist. Insbesondere die geringe Größe von MAT-Clustern ermöglicht das Testen von sekretore Aktivität in der Kultur, was bei großen Fettgewebestücken schwieriger wäre.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Mikrofragmentierung des subkutanen Fettgewebes. Lipoaspirat wird aus subkutanem Fettgewebe mit einer Kanüle gesammelt. Gesammeltes Lipoaspirat wird mit dem nahstehenden Systemgerät mikrofragmentiert. Das resultierende mikrofragmentierte Fettgewebe (MAT) besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich perivaskulärer Zellen und Adipozyten. MAT kann in mehreren Tests, einschließlich Explantkultur und Immunhistochemie, sowie zur Zellisolation verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Gating-Strategie für die perivaskuläre Zellanalyse/-sortierung aus MAT. Ein Vorwärtsstreubereich (FSC-A) vs. Side Scatter Area (SSC-A) Gate wird verwendet, um Zellen (A) zu identifizieren, gefolgt von Vorwärtsstreufläche (FSC-A) vs Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H), um einzelne Zellen auszuwählen (B). Lebensfähige nicht-endotheliale und nicht-hämatopoetische Zellen werden als negativ für DAPI, CD31-V450 bzw. CD45-V450 im selben Panel (C) abgegrenzt. Schließlich werden perivaskuläre Zellen als Pericyte (CD146+ CD34-) oder adventitelle Zellen (CD146- CD34+) (D) identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: MAT-Morphologie. Helle Ansicht von MAT kultiviert in Basalmedium. Maßstabsleiste = 1.000 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Vaskulaturnetzwerk in MAT. Endothelzellen sind mit UEA-1 gefärbt. Boxed Areas in A werden vergrößert in B und C gezeigt. Pfeilspitzen zeigen Pericyte, die mit Antikörpern gegen PDGFR und NG2 gefärbt wurden. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

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Dieses Papier beschreibt die physikalische Fraktionierung von menschlichem Fettgewebe in kleinen Clustern, die normale Fettgewebe-Mikroanatomie zeigen, mit einem geschlossenen Systemgerät.

Manuell angesaugte menschliches subkutanes Fettgewebe und eine Saline-Lösung werden in einen transparenten Kunststoffzylinder geladen, der große metallische Kugeln im Flipperstil enthält, die beim kräftigen manuellen Schütteln des Geräts das Fett in sub-Millimeter zerbrechen. Fragmente. Angeschlossene Filter und Auslass ermöglichen die Beseitigung von Schmutz, Blut und freien Lipiden und MAT wird in einer Spritze gesammelt, die mit dem Gerät verbunden ist. Hierwurde MAT erfolgreich für Immunhistochemie, Durchflusszytometrie und Kultur weiterverarbeitet, obwohl dieses spezifische Gerät aus medizinischer Sicht entwickelt wurde, um im Theater das enzymatisch erzeugte Fettgewebe stromal vaskuläre Fraktion oder Kultur abgeleitet Fettstammzellen, und in der Tat erwies sich als hocheffizient in der plastischen Chirurgie und verschiedenen anderen zellbasierten Therapien4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.

Daher kehrt Fettgewebe, das lange intakt als bloßer Füllstoff16 verwendet wurde, in seiner nativen dreidimensionalen Konfiguration nach Jahren enzymatischer Dissoziation und In-vitro-Kultur zurück. Dies folgt einem allgemeinen Trend, Gewebe in ihrer angeborenen mehrzelligen Anordnung zu wachsen und zu studieren, anstatt als dispergierte Zellpopulationen, wie die wachsende Popularität von Organoiden17zeigt.

Die Zersplitterung des Adipose-Gewebes mit diesem mechanischen Gerät hat sich als zuverlässig und reproduzierbar erwiesen, und es war nie eine Änderung des ursprünglichen Protokolls erforderlich. Die gewöhnliche Versorgung mit menschlichem subkutanem Fett für experimentelle Studien ist ein aus kosmetischen Gründen gesammeltes Lipoaspirat, das direkt auf das Fragmentierungsgerät geladen wird. Eine Einschränkung für die Anwender im Forschungslabor ist jedoch, dass das zu verarbeitende Fettgewebe sanft von Hand angesaugt werden muss, um die Gewebemikroarchitektur so intakt wie möglich zu erhalten, und nicht mit einer Vakuumpumpe aussaugen muss, wie es routinemäßig in der zimmer. Wenn kein Chirurg, der bereit ist, Fett manuell zu sammeln, identifiziert werden kann, kann ein frisch resektierter Abdominoplastik-Rückstand verwendet werden. Das Fett, das an den inneren Aspekt der Bauchhaut angebunden ist, kann dann mit der mit dem Kit gelieferten Spritze sorgfältig und steril angesaugt werden. Aus diesem Grund haben wir diesen Schritt am Anfang des Protokolls beschrieben (Schritt 1).

Was erklärt eigentlich die therapeutische Überlegenheit von MAT gegenüber enzymdissoziiertem Fettgewebe? Die Flusszytometrie-Analyse von MAT, die unmittelbar nach der Fraktionierung enzymatisch dissoziiert wurde, ergab einen höheren Anteil an Pericyten, bekannt als angeborene Vorläufer mesenchymaler Stammzellen14, im Vergleich zum gesamten angesaugten Fettgewebe15 . Direkter zeigte die vergleichende Analyse von MAT- und SVF-Kulturüberstand, dass die ehemaligen Sezer, qualitativ und quantitativ, mehr Wachstumsfaktoren und Zytokine indirekt an der Gewebereparatur beteiligt sind. Dazu gehören pro-angiogene Faktoren, sowie verschiedene Mediatoren der Immunentzündung15.

Über diese jüngsten Ergebnisse hinaus bleibt viel zu verstehen über die molekulare Basis des MAT-Therapiepotenzials. Zu diesem Zweck stellt die hier beschriebene Methode eine einfache, schnelle Technik dar, die auf die Fettnische wenig wirkt und MAT ideal für weitere experimentelle Manipulationen erzeugt. Aus nebenatorischer Sicht wird auch geforscht, um die Benutzerfreundlichkeit von MAT in der Klinik zu verbessern; in diesem Zusammenhang erscheint die Bestimmung, ob mikrofragmentiertes Fettgewebe für verzögerte autologe oder allogene Verabreichung eingefroren werden kann, als Priorität. Schließlich wird es wichtig sein, zu bestimmen, ob andere Gewebe und Organe wie das Knochenmark, die Bauchspeicheldrüse oder der Skelettmuskel, um nur einige zu zitieren, mikrofragmentiert mit dem gleichen Gerät sein können und intakte Mikrovaskulatur assoziierte zelluläre Nischen zur Verfügung stellen experimentelle intervention.

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Disclosures

CT ist ein Gründer von Lipogems.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Claire Cryer und Fiona Rossi von der Universität Edinburgh für ihre fachkundige Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir möchten auch dem Personal des Murrayfield-Krankenhauses danken, das durch die Bereitstellung von Gewebeproben dazu beigetragen hat.

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der British Heart Foundation und Lipogems unterstützt, die Fettgewebe-Verarbeitungskits lieferten. Menschliche Gewebeproben für Erwachsene wurden mit vollständiger ethischer Genehmigung der South East Scotland Research Ethics Committee beschafft (Referenz: 16/SS/0103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA) VWR chemicals 9317.901
0.9% NaCl Solution Baxter 3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG  Life Technologies A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG Life Technologies  A21245
Ammonium chloride fisher chemicals 1158868
Antigent Diluent Life Technologies 3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus BD Biosciences 560497
Avidin/Biotin Blocking Kit Life Technologies 4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer  BD Biosciences Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies 
Biotinylated Ulex europaeus lectin Vector Laboratories Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control BD Biosciences 563044
CD146-BV711 BD Biosciences 563186
CD31-V450 BD Biosciences 561653
CD34-PE BD Biosciences 555822
CD45-V450 BD Biosciences 560367
DAPI Life Technologies D1306 stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)   Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0) BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate Life Technologies 61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM Lonza  CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich F2442
FlowJo (v.10.0) FlowJo
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Gelatin Acros Organics 410870025
Lipogems Surgical Kit Lipogems  LG SK 60
Mouse anti human- NG2 BD Biosciences 554275 stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap  BD Biosciences 352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes BD Biosciences 352003
Rabbit anti human - PDGFRb Abcam 32570 stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488 Life Technologies  S32354
Sucrose Sigma-Aldrich 84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)  Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Tris base fisher chemicals BP152-500
Type- II Collagenase Gibco 17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 560373
Widefield Zeiss observer Zeiss Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) Zeiss DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm 

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References

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  2. Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25, (4), 818-827 (2007).
  3. Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
  4. Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2, (4), (2014).
  5. Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10, (2), 337-341 (2015).
  6. Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3, (7), 1073-1075 (2016).
  7. Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11, (3), 229-234 (2015).
  8. Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3, (2), (2015).
  9. Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3, (2), 57-67 (2014).
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  16. Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118, (3), 108S-120S (2006).
  17. Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20, (6), 633 (2018).
Human Adipose Tissue Mikrofragmentierung für Zell-Phänotypisierung und Secretome-Charakterisierung
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Vezzani, B., Gomez-Salazar, M., Casamitjana, J., Tremolada, C., Péault, B. Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization. J. Vis. Exp. (152), e60117, doi:10.3791/60117 (2019).More

Vezzani, B., Gomez-Salazar, M., Casamitjana, J., Tremolada, C., Péault, B. Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization. J. Vis. Exp. (152), e60117, doi:10.3791/60117 (2019).

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