Summary
ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。
Abstract
過去10年間、脂肪組織移植は、組織の再生および/または再生を強化するために、整形外科や整形外科で広く使用されてきました。したがって、ヒト脂肪組織を採取・処理する技術は、大量の組織を迅速かつ効率的に得るために進化してきた。これらの中で、クローズドシステム技術は、短時間で同じ介入(術中)で精製された脂肪組織を収穫、処理、再注入する革新的で使いやすいシステムを表します。脂肪組織は脂肪吸引によって採取され、洗浄され、乳化され、0.3~0.8mmの細胞クラスターに機械的にすすり込まれ、みじん切り.機械的に断片化された脂肪組織の自家移植は、異なる治療において顕著な有効性を示した。美容医学や手術、整形外科、一般的な手術などの適応症。微細断片化脂肪組織の特徴付けは、脂肪細胞クラスター内の無傷の小さな血管の存在を明らかにした。したがって、血管部膜のニッチは動揺しないままにされる。これらのクラスターは、血管細胞(すなわち、間葉系幹細胞(MSC)の祖先)に富み、インビトロ分析では、酵素的に由来するMSCと比較して、組織の修復および再生に関与する成長因子およびサイトカインの放出が増加したことを示した。これは、微細断片化された脂肪組織の優れた治療可能性が推定MSCのより高い頻度および増強された分泌活性によって説明されたことを示唆する。これらの添加されたペリサイトが高成長因子およびサイトカイン産生に直接寄与するかどうかは知られていない。この臨床的に承認された手順により、拡張および/または酵素治療を必要とせずに推定MSCを移植できるため、GMPガイドラインの要件を回避し、細胞ベースの治療のコストを削減できます。
Introduction
脂肪組織は、再建および美容手術の充填剤として長く使用され、最近では間葉系幹細胞(MSC)1の供給源として認識された再生医療においてより一般的になってきている。単細胞懸濁液を単細胞懸濁液に解離すると、患者に変わらず使用される脂肪細胞フリー間質血管画分(SVF)を得るか、より一般的には、MSC2に数週間培養される。
しかし、酵素解離は組織微小環境を破裂させ、インビトロ培養によってかなり修飾される推定再生細胞から隣接する調節細胞を隔離する。このような実験的なアーティファクトおよび結果的な機能的変化を避けるために、可能な限りそのネイティブ構成をそのまま維持しながら、治療用の脂肪組織を処理する試みがなされている3,4。特に、機械的組織の破壊は酵素解離に取って代わり始めている。この目的のために、完全な浸漬閉塞系マイクロフラグメントリポアスは、サブミリメートル、血液および無油組織クラスター(例えば、リポゲム)にふるい質濾過および鋼大理石誘発破壊3のシーケンスを介して、マイクロ断片化脂肪組織の自家移植は、この閉じたシステム技術を使用して、複数の適応症、化粧品、整形外科、直腸および婦人科4、5、複数の適応症で成功している。6,7,8,9,10,11,12,13.
閉じたシステム装置と同位体SVFで得られたヒト微細断片脂肪組織(MAT)との比較は、血管/間質細胞分布および培養中の分泌活性に関して、MATはより多くのペリサイトを含有することを明らかにした。推定MSC14、および成長因子およびサイトカイン15のより高い量を分泌する。
本記事は、閉じたシステム装置を用いたヒト皮下脂肪組織の酵素フリー微小断片化、及びインビトロ培養用微小化脂肪組織のさらなる処理、免疫組織化学およびFACS分析、存在する細胞型と分泌される可溶性因子を同定するために(図1)。記載された方法は、生存可能な脂肪組織細胞集団を含む脂肪由来のサブミリメートルオルガノイドを無傷のニッチで安全に生成し、さらなる応用および研究に適している。
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Protocol
本研究におけるヒト組織の使用に関する倫理的承認は、南東スコットランド研究倫理委員会(参照:16/SS/0103)から得られた。
1. 皮下腹部脂肪組織コレクション
注:手動リポ吸引手順で使用されるすべての器械はマイクロ断片化装置の製造業者によって提供される。
- 実験を通じて、すべての流体、容器、計器、および操作領域に対する無菌性を維持します。
- 腹部形成術サンプル(溶液なしで無菌袋に外科チームによって調達)を、皮膚が上向きに向いている外科布の上に置きます。洗濯は不要です。最適な使用のために、4 °Cでサンプルを維持し、収穫の16時間以内に脂肪サンプルを処理します。
- 37°C 0.9%NaCl溶液の50~100mLを注入し、組織試料の大きさに応じて(最大15cm2脂肪組織表面に50mLを使用し、それに応じて体積を増やす)、使い捨て組織浸潤カニューレを使用して、皮下に脂肪組織。皮の部分によって標本を扱う。
- 10 mLルアーロックシリンジを使い捨て脂肪吸引カニューレに接続します。
- 慎重にエッジから脂肪組織内のカニューレを導入します。中に入ったら、プランジャーを引っ張ってシリンジ内に真空を作ります。真空吸引を確保するために手でプランジャーを位置に保ちます。
- 注射器がリポアポーズでいっぱいになるまで、脂肪組織サンプル内の放射状の動きを行います。組織からカニューレを慎重に取り外し、注射器を取り外します。新しい空の注射器を接続します。
- リポアプシーの60mLが回収されるまで手順を繰り返す。
注:処理可能なリポアプサスの最大量は、使用するデバイスの種類に応じて変化する。製造元の説明書(資料表)を参照してください。
2. リポアプサーの微細断片化
注:このプロトコルは、研究用のみを対象としています。マイクロフラグメンテーションは、市販のデバイス(材料の表)の助けを借りて行われます。
- パッケージからデバイスを取り外し、本体が廃棄物袋に接続されていることを確認します。廃棄物回収袋を地面に置き、バルブがプロセスユニットキャップに固定されていることを確認します。
- 入力ラインの端子スパイクを袋接続ポートに突き刺して生理生理生データに接続します。生理生理生の袋は処理単位より高く保つ。
注:このプロトコルで使用される装置のタイプのために、無菌生理生理生理の2,000 mL袋が推薦される。 - 回路のチューブに接続されている5つのクランプがすべて開いていることを確認します。処理部をグレーキャップを上向きに垂直位置に配置します。
- 生理生理生理物系の溶液が処理単位を充填できるようにします。流れが廃棄物袋に達していることを確認します。それを振ることによって、処理ユニットからすべての気泡を取り除きます。
注:以下のすべての通路は、処理装置内の空気がない場合に行う必要があります。 - 処理部を青いキャップを上向きに垂直な位置に置き、入力ラインの横にあるクランプを閉じます。
- 青入力キャップの自己閉塞弁にシリンジを接続してリポアセ海賊の注入を開始する。この手順の間に処理ユニットを垂直に保ち、すべてのリポアセ海賊がユニットに移されるまで、シリンジプランジャーをゆっくりと引っ張ります。すべてのリポアセ海賊が処理ユニット内になるまで、このプロセスを繰り返します。
注:ビデオで使用される処理ユニットの場合は、その時点で最大30mLのリポアセ海賊を追加します。この手順は、リポアプシーの60mLが処理されるまで、最大2回行うことができる。 - 入力クランプを開いて、生理生の流れを復元します。
- 少なくとも2分間精力的に処理部を振り、廃棄物袋に生理液の流れを定期的にチェックする。
- 処理部の生理生理液が透明になったら、約2分の揺れの後、グレーキャップを上に置き、グレーキャップ付近のドレインにあるクランプを閉じます。処理された組織は上部に浮かびます。
- 10 mL Luerロックシリンジを生理生理生理液で充填し、青いキャップのローディングバルブに接続します。青いキャップの近くにあるクランプを閉じます。空の10 mL Luerロックシリンジを、プランジャーを完全に挿入して、グレーキャップのバルブに接続します。
注:ルアーロックシリンジのみを使用してください。 - 青いキャップから加工部に生理生をしっかりと注入します。灰色の弁に接続されている注射器が処理されたティッシュで満たされていることを確認してください。すべての生理食道を注入したら、慎重に両方の注射器を削除します。
- 処理されたすべての組織が収集されるまで、手順 2.10 と 2.11 を繰り返します。
注:MATの平均収量は手動脂肪吸引の60 mLから30 mLである。一部の組織は処理装置の中に残り、一部の塊はユニット内の青い端に取り付けられている場合があります。 - 処理の最後に、すべての注射器を取り外し、すべてのクランプを閉じ、生理生理生殖器袋を取り外し、ローカルプロトコルに従って装置を処分する。
注:処理装置を再利用できません。
3. 蛍光免疫組織化学
- MATの300-500 μLを1.5 mLチューブに移します。4%の緩衝パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLを追加し、手で穏やかに混合(渦なし)し、一晩(16〜24時間)4°Cで残します。
- 試料を回収し、1 mLのPBSを含むクリーンな1.5 mLチューブに移します。この手順を 2 回繰り返して、PFA の過剰を除去します。
- PBS溶液中に15%(w/v)スクロースで試料を移し、一晩4°C(16~24時間)でインキュベートする
- 24ウェルプレートの井戸に試料を移し、PBSに15%ショ糖と7%ゼラチン(w/v)で作られた埋め込み溶液を追加します。井戸を半分に満たしてください。37 °Cで4時間インキュベートします。
- サンプルを4°Cに移します。ゼラチンが固化するために2〜4時間後、埋め込み溶液で井戸を充填し、一晩4°Cに残します。
- 井戸からサンプルを取り除く。余分な埋め込み化合物を取り除き、ドライアイスで凍結します。サンプルは-80°Cで保存してください。
- クライオスタットを使用して8-10 μmの厚いセクションを切断します。最適な断面化のために、-30 °Cでクライオスタットを使用してください。スライドは-80 °Cで貯えることができる。
- 免疫蛍光を続行する前に、4%PFAの切片を7分間固定し、PFAを取り出し、断面からゼラチンを除去するためにぬるま湯PBS(37°C)で2回洗浄します。
- PBS(v/v)で10%ヤギ血清でスライドを1時間室温で1時間インキュベートすることにより、非特異的抗体結合をブロックします。
- PBS(w/v):マウス抗ヒト-NG2(1:100、ストック0.5mg/mL)、ウサギ抗ヒトPDGFRβ(1:100、ストック0.15mg/mL)で抗体希釈または0.2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)で一次抗体を希釈する。
- ブロッキング溶液を除去し、希釈した一次抗体を添加する。一晩4°Cでインキュベートする。
注:暗闇の中でこれからすべてのインキュベーションステップを実行します。 - 一次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
- PBSにおける抗体希釈剤または0.2%(w/v)BSA中の二次抗体を希釈する:ヤギ抗マウス-555(1:300)、ヤギ抗ウサギ-647(1:300)。室温で1時間インキュベートする。
- 二次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
- ビオチン共役レクチンを使用する場合は、アビジン/ビオチン遮断キットを使用してください。PBSとの間に2つの洗い物を提供する各試薬で10分間インキュベートする。
- PBSで10%ヤギの血清で室温で1時間スライドをインキュベートすることによってブロッキングステップを繰り返します。
- ビオチン化レクチン、ビオチン化ウレックスエウロウエウスレクチン(1:200、ストック2mg/mL)を添加し、PBSまたは抗体希釈剤で0.2%BSA(w/v)のいずれかで希釈した。室温で1時間30分をインキュベートする。
- 過剰なビオチン化レクチンを除去し、毎回10分間PBSで3回洗浄する。
- PBSまたは抗体希釈剤で0.2%(w/v)BSAのいずれかで希釈した二次ストレプトアビジン共役抗体を添加する。1時間インキュベートします。
- 二次抗体を取り出し、PBSで毎回3回洗浄します。
- 4',6-ダイアミド-2-フェニリンドール(DAPI,1:500,ストック5mg/mL)を用いたカウンターステイン核を、PBSで0.2%BSA(w/v)で希釈し、室温で10分間希釈した。
- DAPI溶液を取り出し、PBSで2回、毎回10分ずつ洗います。
- 水性取り付け剤でスライドを取り付けます。暗闇の中で一晩、または37°Cで1時間、完全に乾燥させてください。
- 暗いところで4°Cのスライドを保ち、エピ蛍光顕微鏡で画像を取得します。
4. 微細断片化脂肪組織の消化と細胞分離
- 微細断片化した脂肪組織を無菌容器に移す。
- 1mg/mLの濃度でDMEMにタイプIIコラゲナーゼを溶解することにより、消化培地を作り上げます。
- 微細断片化した脂肪組織に同じ体積の消化培地を加える(すなわち、30mLの試料の消化培地を加える)。
- 密封容器を37°Cの振水浴に入れ、120rpmに設定し、45分間使用します。容器はサンプルの適切な揺れを可能にする必要がありますのでご注意ください。大きな容器が利用できない場合は、水平に配置された2本の50mLチューブ(それぞれに30mLのサンプル/消化培地混合物)を使用してください。
- インキュベーション後、同量のブロッキング溶液(2%(v/v)FCS/PBS)を加えて消化をブロックし、100μmおよび70 μmセルストレーナーを通して順次濾過します。
- 200 x gで5分間フィルタリングされた懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
- 赤血球逆流バッファーの約5 mL(155 mM NH4Cl、170 mMトリス、pH 7.65)でペレットを再ステーペンドします。緩衝液の体積は、細胞ペレットで観察される赤血球汚染に応じて変化してもよい。室温で15分間インキュベートします。
- 同量のブロッキング溶液を追加し、40 μmセルストレーナーを通してフィルターを行います。
- 200 x gで5分間セル懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。
- ブロッキング溶液中のペレットを再中断します。ピペッティングでよく混ぜます。血球計でトリパンブルーの除外で生存細胞を数えます。
- セル懸濁液の同じ体積をトリパンブルーの汚れと混ぜます。溶液の10 μLを吸引し、ヘモサイトメーターに置きます。
- 少なくとも5つの正方形に存在する生細胞(明るく丸い)の数を数え、平均セル数を取得します。染色希釈係数を含めるために、平均細胞数に2を掛けます。サンプルの1 mL当たりの生細胞の総数を取得するには、得られた数に104を掛ける。
注:得られた単一細胞懸濁液、すなわち間質血管画分(SVF)は、皮膜細胞増殖培地で20,000細胞/cm2で播種することができる(DMEMはFCSで20%の熱を補充し、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%であるL-グルタミン)またはフローサイトメトリー分析およびソートに使用される。SVFにおける核細胞の平均収率は、MATのmL当たり約3x104細胞である。並べ替え実験では、培養に十分な血管細胞を得るために、少なくとも 8 x 105細胞が必要です。
5. セルのラベリングとソート
- 室温で細胞懸濁液を200xgで5分間遠心分離し、100μL当たり1x106細胞の濃度でブロッキング培地でペレットを再懸濁する。
- アリコートは、未染色コントロールおよび蛍光マイナス1(FMO)に対して少なくとも50,000細胞をポリスチレン丸底流れ細胞測定チューブに対して制御する。別のチューブに入れることによって、多色染色のために細胞の残りの部分を使用してください。
注:実験の設定が確立されると(すなわち、レーザー強度、ゲーティング戦略)、未染色コントロールおよびFMOに使用される細胞の数を減らすことができる場合、使用される抗体は同じである。 - CD31-V450(1:400)、CD34-PE(1:100)、CD45-V450(1:400)、CD146-BV711(1:100)抗体を多色染色用単細胞懸濁液に追加します。FMO コントロールの場合は、V450 FMO 同等のボリュームの CD34-PE および CD146-BV711 と V450 アイソタイプ コントロールに追加します。CD31-V450、CD45-V450およびCD146-BV711プラスPEアイソタイプ制御のPE FMO同等のボリュームのために;BV711 FMO同等のボリュームのCD31-V450、CD45-V450およびCD34-PEプラスBV711アイソタイプコントロール用。
- 穏やかにピペット、または渦はゆっくりと暗闇の中で20分間4°Cでチューブを混合し、インキュベートするチューブ内の溶液。
- 補償制御ビーズを準備します。3ポリスチレン丸底流量細胞メトリーチューブで、正ビーズ15μL、負ビーズ15μLを70μLのブロッキング培地に加えます。CD34-PE、CD31-V450 または CD45-V450、および CD146-BV711 抗体をチューブごとに 1 つ追加します。
- 穏やかにピペット、または渦をゆっくりと、ビーズと抗体を混合し、暗闇の中で20分間4°Cですべてのチューブをインキュベートする。
注: 説明する手順は、フローサイトメトリー分析または細胞ソートのいずれかに使用できます。 - 内皮成長培地(EGM)でチューブの内面をあらかじめ濡らして回収管を準備し、各チューブの底部に約50μLの培地を残します。
- 抗体インキュベーション後、細胞およびビーズを2mLの遮断培地で洗浄して抗体の過剰を除去する。
- チューブを200 x gで5分間遠心分離し、上清を慎重に吸引して溶液を取り出します。洗浄工程を複製します。
- ブロッキング培地中の細胞を、250 μL当たり1x106細胞の最終濃度で再中断し、ビーズを100μLのブロッキング培地で再中断する。
- 細胞ストレーナーキャップを持つ新しいポリスチレン丸底フローサイトメトリーチューブに細胞を移します。これにより、セルの束が中断されます。
- 暗闇の中で氷の上のセルソーターにすべてのセルとビーズ懸濁液を輸送します。
- 染色されていない制御セルを実行して、背景蛍光を確立し、電圧を設定します。
- 補正制御チューブを実行して、蛍光補正を設定します。
- 前方散布領域(FSC-A)とサイドスキャッタエリア(SSC-A)を使用してセルを識別し、フォワードスキャッタエリア(FSC-A)と前方散布高さ(FSC-H)を使用して単一のセルを選択します。
- DAPIを加え、試料の各mLに対して5μg/mL溶液の1 μLを加え、染色されていないコントロールに死細胞のゲーティングを設定する(図2)。DAPI染色後は洗浄不要です。
- アイソタイプコントロールを実行して、非特異的結合に関連する背景蛍光閾値を設定し、ゲーティングを設定します。
- マルチカラー染色サンプルを実行します。CD31およびCD45陰性細胞をゲーティングすることにより、血化細胞および内皮細胞を除外する。集採取管に集血(CD146+ CD34-) およびアドベンティシャルセル (CD146- CD34+) 集団を収集チューブに集める(図2)。
注:最適な生存細胞収率は、ペリサイトの全生存細胞解離の約2%、アドベンティシャル細胞の1.5%である。
6. 細胞培養
- ゼラチン被覆培養プレート上の30,000~40,000細胞/cm2の密度で新たに選別されたペリサイトおよびアドベンティシャル細胞
- 培養プレートをコーティングするには、PBS溶液中の無菌0.2%(w/v)ゼラチン(cm2当たり溶液約100μL)でプレート領域を覆う。室温で10分間インキュベートし、溶液を除去します。培養プレートコーティング中に氷の上に新鮮にソートされた細胞を保管してください。
- 遠心分離機は、200 x gで5分間採取し、細胞ペレットを適切な量の内皮増殖培地(EGM)で穏やかに再中断する。採取した細胞の数が非常に少ない場合は、遠心分離を避け、採取した細胞を直接プレートに入れます。
- ゼラチンコーティングされたプレートに細胞を種をまきます。5% CO2で 37 °C でインキュベートします。
- 細胞がプレートに定着して(少なくとも72時間後)、外皮細胞増殖媒とEGMを交換し(DMEMは20%熱不活性化FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1%L-グルタミンを補充)、ペリサイトおよびアドベンショナル細胞の両方について。
- ペリサイトおよびアドベンティカル細胞が80%〜90%の合流に達すると、0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を解離する。5%FCS/PBSで収集し、遠心分離機を200 x gで5分間集め、血管細胞増殖培地で再中断し、1:3~1:5の比率(または約7,000セル/cm2)からコーティングされていないポリスチレン培養プレートまたはフラスコに細胞を通過させます。
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Representative Results
手動リポアセッセンシーの機械的解離は、微小血管ネットワークを包む脂肪細胞の集合体からなる微小断片化脂肪組織(MAT)の産生をもたらした(図3)。ゼラチン埋め込みおよび凍結固定MATの免疫蛍光分析は、この構造を強調し、主に小さな毛細血管様血管からなる内皮細胞マーカーウレックス・エウロペウス・アグルチニン1(UEA-1)受容体によってマークされた血管ネットワークを示す(図 4)。特にNG2またはPDGFRβを発現するペリサイトは、正常に分布し、内皮細胞を包化する(図4)。これらのデータは、機械的マイクロ断片化プロセスが血管部細胞コンパートメントに影響を及ぼさないことを確認する。血管細胞の存在は、ペリサイトとアドベンティシャル細胞の両方であり、フローサイトメトリーによって確認されている。セルを選択するには、前方散布領域(FSC-A)と側散乱領域(SSC-A)ゲートを使用した(図2A)。同定された細胞集団は、前方散乱領域(FSC-A)と前方散乱高(FSC-H)を用いてさらにゲート化し、単一細胞および生細胞を選択し、DAPI染色に対して陰性であると同定した(図2B-C)。CD31およびCD45マーカーを用いて、血化細胞および内皮細胞を排除した(図2C)。最後に、ペリサイトをCD146+CD34-およびアドベンティシャル細胞をCD146-CD34+(図2D)として同定した。ゲーティング戦略を図 2に要約します。同じゲーティング戦略を用いて、実験を選別した。FACS精製MATペリサイトおよびアドベンティシャル細胞はいずれも培養中の形態をステラするスピンドルを示す。8日間の培養は、MATがより多くのサイトカインを分泌することを示した(アディポネクチン、CD14、 CD31、CD154、キチナーゼ3様1、補体因子D、CD147、GDF-15、IGFBP-2、IL1RA、IP-10、M-CSF、MIF、CXCL9、CCL19、PDGFAA、CCL5、RBP-4、リラックス-2、STgio-2、TN-N因子(アンジオジェニン、アンジオスタチン、DPPIV、エンドグリン、HGF、レプチン、PDGFAB/BB、PlGF、トロンボスポンジン2、TIMP4、uPA)SVFよりもインビトロ。さらに、MATとSVFの両方によって産生されるサイトカインおよび血管新生因子は、MAT上清においてより豊富であった。従って、MATはコラゲナーゼで消化し、培養に入れ、従来のSVF15から観察したものと同様の分泌物を産生した。世界的に、これらのデータはすべて、微細断片化された脂肪組織が治療的に有利であるだけでなく、発話性および機能的調査にも適していることを示している。特に、MATクラスターの小型化は、培養中の分泌活性の試験を可能にし、大きな脂肪組織チャンクではより困難であろう。
図1:皮下脂肪組織の微小断片化の概略表現。リポアセ海賊は、カニューレを用いて皮下脂肪組織から採取される。収集されたリポアプサは、近接系装置を用いて微細断片化される。得られた微小断片化脂肪組織(MAT)は、血管細胞および脂肪細胞を含む複数の細胞型によって構成される。MATは、植物培養および免疫組織化学を含む複数の試験で、および細胞単離のために使用することができる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MATからの血管細胞分析/ソートのための代表的なゲーティング戦略前方散布領域(FSC-A)と側散布領域(SSC-A)ゲートは、セル(A)を識別するために使用され、次に前方散布領域(FSC-A)と前方散布高さ(FSC-H)を使用して単一セル(B)を選択します。生存可能な非内皮および非造血細胞は、DAPI、CD31-V450およびCD45-V450に対してそれぞれ陰性としてゲートされる(C)。最後に、血管細胞は、ペリサイト(CD146+CD34-)または臨進化細胞(CD146- CD34+)(D)として同定される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MAT形態。基底媒体で培養されたMATの明るい視野。スケールバー = 1,000 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MATにおける血管系ネットワーク。内皮細胞はUEA-1で染色される。Aの箱詰め領域は、PdGFRβおよびNG2に対する抗体を用いて染色されたペリサイトを示すBおよびC.アローヘッドにおいて拡大を示す。スケールバー = 50 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、閉じたシステム装置を用いて、正常な脂肪組織微小解剖学を示す小さなクラスターにヒト脂肪組織の物理的分画について説明する。
手動吸引ヒト皮下脂肪組織および生理液は、装置の激しい手動振盪の際に、脂肪をサブミリメートルに破裂させる大きなピンボールスタイルの金属球を含む透明なプラスチックシリンダーにロードされるフラグメント。付属のフィルターおよび出口は破片、血および自由な脂質を除去することを可能にし、MATは装置にリンクされる注射器で集める。ここで、MATは免疫組織化学、フローサイトメトリーおよび培養のためにさらに処理に成功しており、この特定の装置は医学的観点から開発されたものの、酵素的に産生された脂肪組織間質血管を劇場で置き換える分数または培養は脂肪幹細胞を誘導し、実際に整形手術および多様な他の細胞ベースの治療法4、5、6、7、8で非常に効率的であることが証明された。9,10,11,12,13.
したがって、単なる充填剤16としてそのまま使用される脂肪組織は、酵素解離およびインビトロ培養の年後に、そのネイティブ3次元構成に戻る。これは、オルガノイド17の人気の高まりによって示されるように、分散細胞集団としてではなく、その生来の多細胞配列で組織を成長させ、研究する一般的な傾向に従う。
この機械装置を使用して脂肪組織の断片化は、信頼性が高く、再現性が証明されており、元のプロトコルの変更はこれまで必要ではなかった。実験的研究のためのヒト皮下脂肪の通常の供給は、断片化装置に直接ロードされる化粧品の理由のために収集されたリポア海賊である。しかし、研究室のユーザーにとっての制限は、処理される脂肪組織を手で優しく吸引し、組織マイクロアーキテクチャを可能な限りそのまま維持し、操作で日常的に行われているように真空ポンプで吸い出さなくなければならないということです。部屋。手動で脂肪を採取する外科医が特定できない限り、新たに切除された腹部形成術残渣を使用することができる。腹部の皮膚の内側に取り付けられた脂肪は、キットに付属の注射器で慎重かつ無菌吸引することができます。これが、プロトコルの先頭でこの手順を説明した理由です (手順 1)。
酵素解離脂肪組織に対するMATの治療上の優位性を実際に説明するものは何ですか?分画直後に酵素的に解離したMATのフローサイトメトリー解析は、間葉系幹細胞の先見先駆者として知られるペリサイトの割合が高いことを明らかにした14,全吸引脂肪組織15.より直接的に、MATおよびSVF培養上清の比較分析は、前者が、質的および定量的に、組織修復に間接的に関与するより多くの成長因子およびサイトカインを分泌することを示した。これらには、血管新生因子、ならびに免疫炎症15の多様なメディエーターが含まれる。
これらの最近の結果を超えて、MAT治療電位の分子基盤に関して多くが理解されるべきである。この目的のために、ここで説明する方法は、脂肪ニッチへの影響が少ないシンプルで高速な技術を表し、さらなる実験操作に最適なMATを生成する。補助的な観点からは、クリニックでのMATの使いやすさを向上させる研究も行われています。この点において、微細断片化した脂肪組織が遅れた自家投与または同種投与のために凍結されることができるかどうかの決定が優先事項として現れる。最後に、骨髄、膵臓、骨格筋などの他の組織や器官が、少数を引用して、同じ装置で微小断片化し、無傷の微小血管系関連細胞ニッチを提供できるかどうかを決定することが重要です。実験的介入に。
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Disclosures
CTはリポジェムの創設者です。
Acknowledgments
著者らは、エジンバラ大学のクレア・クライアーとフィオナ・ロッシに、フローサイトメトリーの専門家の支援に感謝したいと考えています。また、組織標本の提供に貢献したマレーフィールド病院の職員に感謝します。
この研究は、脂肪組織処理キットを提供した英国心臓財団とリポゲムズからの助成金によって支えられました。ヒト成人組織サンプルは、南東スコットランド研究倫理委員会の完全な倫理許可を得て調達された(参照:16/SS/0103)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
