Summary
Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.
Abstract
Son on yılda, yağ dokusu nakli yaygın doku repletion ve / veya rejenerasyon geliştirmek için plastik cerrahi ve ortopedi de kullanılmıştır. Buna göre, insan yağ dokusunun hasat ve işleme teknikleri, büyük miktarda dokuyu hızlı ve verimli bir şekilde elde etmek için gelişmiştir. Bunlar arasında, kapalı sistem teknolojisi, rafine yağ dokusunun kısa sürede ve aynı müdahalede (intra-operatif) hasat, işleme ve yeniden enjekte edilen yenilikçi ve kullanımı kolay bir sistemi temsil eder. Adipoz dokusu liposuction ile toplanır, yıkanır, emülsifiye edilir, durulanır ve mekanik olarak 0,3 ila 0,8 mm hücre kümelerine doğrlanır. Mekanik olarak parçalanmış yağ dokusunun otolog transplantasyonu farklı terapötik terapide dikkate değer bir etkinlik göstermiştir estetik tıp ve cerrahi, ortopedik ve genel cerrahi gibi endikasyonlar. Mikro-parçalanmış yağ dokusunun karakterizasyonu, adiposit kümeleri içinde bozulmamış küçük damarların varlığını ortaya; bu nedenle, perivasküler niş tedirgin bırakılır. Bu kümeler perivasküler hücrelerde zenginleştirilmiştir (yani, mezenkimal kök hücre (MSC) ataları) ve in vitro analizler enzimatik olarak elde edilen MSC'lere kıyasla, doku onarımı ve rejenerasyonunda rol oynayan büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin salınımını artırdı. Bu mikroparçalanmış yağ dokusunun üstün terapötik potansiyeli varsayımsal MSCs ve gelişmiş salgı aktivitesi daha yüksek bir sıklıkta açıklanır düşündürmektedir. Bu eklenen perisitlerin doğrudan daha yüksek büyüme faktörüne ve sitokin üretimine katkıda bulunup bulunmadığı bilinmemektedir. Klinik olarak onaylanmış bu prosedür, genişleme ve/veya enzimatik tedaviye gerek kalmadan, GMP kılavuzlarının gerekliliklerini atlayarak ve hücre bazlı tedavilerin maliyetlerini azaltarak, varsayımsal MSC'lerin nakline olanak sağlar.
Introduction
Adipoz doku, uzun rekonstrüktif ve kozmetik cerrahi bir dolgu olarak kullanılan, son zamanlarda daha popüler bir kez mezenkimal kök hücreler için bir kaynak olarak tanınan rejeneratif tıp haline gelmiştir (MSCs)1. Lipoaspirates tek hücreli süspansiyonlar içine enzimatik ayrıştırılmış hastada değiştirilmeden kullanılan bir adiposit içermeyen stromal vasküler fraksiyonu (SVF) verim veya daha yaygın olarak, MSCs içine birkaç hafta kültürlü2.
Ancak, enzim dissosiasyonu doku mikroortamlarını yırtar, in vitro kültür tarafından önemli ölçüde modifiye edilen varsayımsal rejeneratif hücrelerden komşu düzenleyici hücrelerden göz lerden uzaktır. Bu tür deneysel eserler ve sonuç fonksiyonel değişiklikler önlemek için, girişimleri mümkün olduğunca bozulmamış olarak doğal yapılandırma korurken terapötik kullanım için yağ dokusu işlemek için yapılmıştır3,4. Özellikle mekanik doku bozulması enzimatik dissosilasyonun yerini almaya başlamıştır. Bu amaçla, tam daldırma kapalı sistem mikro-parçaları lipoaspirates içine milimetre, kan- ve yağsız doku kümeleri (örneğin, Lipogems) elek filtrasyon ve çelik mermer indüklenen bozulma bir dizi aracılığıyla3. Mikro parçalı yağ dokusunun otolog transplantasyonu, bu kapalı sistem teknolojisini kullanarak, kozmetik, ortopedi, proktoloji ve jinekoloji4,5 , 6,7,8,9,10,11,12,13.
Kapalı sistem cihazı ve izojenik SVF ile elde edilen insan mikro-parçalanmış yağ dokusu (MAT) arasında yapılan karşılaştırmada, kültürde vasküler/stromal hücre dağılımı ve salgı aktivitesi açısından MAT'ın daha fazla perisit içerdiğini ortaya koymuştur. presumptive MSCs14, ve büyüme faktörleri ve sitokinler15daha yüksek miktarlarda salgılar .
Bu makalede, kapalı bir sistem cihazı kullanılarak insan deri altı yağ dokusunun enzimsiz mikro-parçalanması ve in vitro kültür, immünohistokimya ve FACS analizi için bu mikronize edilmiş yağ dokusunun daha fazla işlenmesi, mevcut hücre tiplerini ve salgılanan çözünür faktörleri belirlemek için (Şekil 1). Açıklanan yöntem, daha fazla uygulama ve çalışmalar için uygun olan, sağlam bir niş içinde canlı yağ dokusu hücre popülasyonları içeren yağ türetilmiş milimetre-altı organoidler güvenli bir şekilde üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırmada insan dokularının kullanımına etik onay Güney Doğu İskoçya Araştırma Etik Komitesi'nden alınmıştır (referans: 16/SS/0103).
1. Subkutan Abdominal Yağ Dokusu Koleksiyonu
NOT: Manuel lipo aspirasyon prosedüründe kullanılan tüm aletler mikro parçalanma cihazının üreticisi tarafından sağlanır.
- Deney boyunca tüm sıvılar, konteynerler, aletler ve çalışma alanı için steriliteyi koruyun.
- Abdominoplasti örneğini (cerrahi ekip tarafından herhangi bir çözüm olmaksızın steril bir torbaya yerleştirin) deri yukarı bakacak şekilde cerrahi bir bezin üzerine yerleştirin. Yıkama gerekmez. En iyi kullanım için numuneyi 4 °C'de tutun ve yağ numunesini hasattan sonraki 16 saat içinde işlayın.
- Doku örneğinin büyüklüğüne bağlı olarak %37 °C 0,9 NaCl çözeltisinin 50 ila 100 mL'sini enjekte edin (maksimum 15 cm2 yağ doku yüzeyi için 50 mL kullanın ve buna göre hacmi artırın), tek kullanımlık doku infiltrasyon kanülünü kullanarak deri altı içine yağ dokusu. Örneği kutanöz kısımla sapla.
- 10 mL Luer kilit şırıngasından tek kullanımlık liposuction kanülüne bağlayın.
- Dikkatle kenarlarından yağ dokusu içinde kanül tanıtmak. Bir kez içeri, piston çekerek şırınga içinde vakum oluşturun. Vakum emme güvenliğini sağlamak için el ile piston pozisyonda tutun.
- Şırınga lipoaspirate dolu olana kadar yağ dokusu örneği içinde radyal hareketler yapın. Kanülleri dikkatlice dokudan çıkarın ve şırıngayı çıkarın. Yeni bir boş şırınga bağlayın.
- 60 mL lipoaspirate toplanana kadar işlemi tekrarlayın.
NOT: İşlenebilecek maksimum lipoaspirate miktarı kullanılan cihazın türüne göre değişir. Lütfen üretici talimatlarına bakın(Malzeme Tablosu).
2. Lipoaspirate mikro-parçalanma
NOT: Bu protokol sadece araştırma kullanımı içindir. Mikro parçalanma, ticari olarak kullanılabilen bir cihaz(Malzeme Tablosu)yardımıyla gerçekleştirilir.
- Cihazı paketten çıkarın ve ana ünitenin atık torbasına bağlı olduğundan doğrulayın. Atık toplama torbasını yere yerleştirin ve vanaların proses ünitesi kapaklarına sabitolduğundan emin olun.
- Giriş hattının terminal başak çanta bağlantı bağlantı noktasını delerek tuzlu çanta ya da bağlayın. Tuzlu torbayı işleme ünitesinden daha yüksek tutun.
NOT: Bu protokolde kullanılan cihazın türü için 2.000 mL'lik steril salin torbası önerilir. - Devrelerin tüplerine bağlı 5 kelepçenin hepsinin açık olduğunu doğrulayın. İşleme ünitesini gri kapak yukarı doğru dikey bir konuma yerleştirin.
- İşlembirimi doldurmak için tuzlu çözeltiye izin verin. Akışın atık torbasına ulaştığından kontrol edin. Onu sallayarak işleme ünitesinden tüm hava kabarcıkları çıkarın.
NOT: Aşağıdaki tüm pasajlar işlem ünitesinde hava yokluğunda yapılmalıdır. - İşlem ünitesini mavi kapak yukarı doğru dikey bir konuma yerleştirin ve giriş çizgisinin yanındaki kelepçeyi kapatın.
- Şırıngayı mavi giriş kapağının kendi kendini tıkayan vanasına bağlayarak lipoaspirate enjekte etmeye başlayın. İşlem ünitesini bu işlem sırasında dikey tutun ve tüm lipoaspirate üniteye aktarılana kadar şırınga pistonunu yavaşça çekin. Tüm lipoaspirate işlem ünitesi içinde olana kadar işlemi tekrarlayın.
NOT: Videoda kullanılan işlem birimi için, o anda en fazla 30 mL lipoaspirate ekleyin. 60 mL lipoaspirate işlenene kadar işlem en fazla iki kez yapılabilir. - Tuzlu akışı geri yüklemek için giriş kıskacını açın.
- En az 2 dakika boyunca işleme ünitesini şiddetle sallayın, atık torbaya tuzlu çözelti akışını düzenli olarak kontrol edin.
- İşlem birimindeki tuzlu çözelti saydam hale geldiğinde, yaklaşık 2 dakika sallayarak sonra, üniteyi gri kapağı yukarı doğru yerleştirin ve gri kapağın yanındaki drenajda bulunan kelepçeyi kapatın. İşlenmiş doku en üstte yüzecek.
- 10 mL Luer kilit şırıngını tuzlu çözeltiyle doldurun ve mavi kapağın yükleme vanasına bağlayın. Mavi kapağın yanında bulunan kelepçeyi kapatın. Boş bir 10 mL Luer kilit şırıngayı, piston tamamen takılı, gri kapağın vanasına bağlayın.
NOT: Sadece Luer kilit şırıngalarını kullanın. - Sıkıca mavi kapaktan işlem birimine tuzlu enjekte. Gri kapakçığa bağlanan şırınganın işlenmiş dokuyla doldurulduğundan emin olun. Bir kez tüm tuzlu enjekte ettikten sonra, dikkatle her iki şırınga çıkarın.
- Tüm işlenmiş doku toplanana kadar 2.10 ve 2.11 adımlarını tekrarlayın.
NOT: MAT'ın ortalama verimi manuel lipoaspirate'ın 60 mL'den 30 mL'dir. Bazı dokular işlem ünitesiiçinde kalır ve bazı kümeler ünitenin içindeki mavi kenarına bağlı olarak bulunabilir. - İşlemin sonunda, tüm şırıngaları çıkarın, tüm kelepçeleri kapatın, tuzlu torbayı çıkarın ve cihazı yerel protokollere göre imha edin.
NOT: İşleme aygıtı yeniden kullanılamaz.
3. Floresan İmmünohistokimya
- 300-500 μL MAT'ı 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. %4 tamponlu paraformaldehit (PFA) 1 mL ekleyin, elle hafifçe karıştırın (girdap yok) ve gece boyunca 4 °C'de (16 ila 24 saat) bırakın.
- Numuneyi toplayın ve 1 mL PBS içeren temiz 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. PFA fazlalıklarını gidermek için adımı iki kez tekrarlayın.
- Numuneyi PBS çözeltisinde %15 (w/v) sakaroz ve gece boyunca 4 °C'de (16 ila 24 saat) inkübüne aktarın
- Numuneyi 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın ve PBS'de %15 sakaroz ve %7 jelatinden (w/v) yapılmış bir katıştırma çözeltisi ekleyin. Kuyuyu yarıyolda doldurun. 37 °C'de 4 saat kuluçka.
- Numuneleri 4 °C'ye aktarın. Jelatinin katılaşması için 2-4 saat sonra, kuyuyu gömme çözeltisi ile doldurun ve gece boyunca 4 °C'de bırakın.
- Kuyulardan örnekleri çıkarın. Aşırı gömme bileşiği çıkarın ve kuru buz üzerinde dondurun. Örnekleri -80 °C'de saklayın.
- Bir kriyostat kullanarak 8-10 μm kalınlığında kesin. Optimum kesit için kriyostat'ı -30 °C'de kullanın. Slaytlar -80 °C'de saklanabilir.
- İmmünofloresansa geçmeden önce, 7 dk. PfA'yı çıkarın ve jelatini kesitlerden çıkarmak için iki kez ılık PBS (37 °C) ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de (v/v) %10 keçi serumu ile slaytları kuluçkaya yatırarak spesifik olmayan antikor bağlanmasını engelleyin.
- PBS'de (w/v) antikor dilüent veya %0.2 (w/v) sığır serum albumininde (BSA) birincil antikorları seyreltin: fare anti-insan-NG2 (1:100, stok 0.5 mg/mL), tavşan anti-insan-PDGFRβ (1:100, stok 0.15 mg/mL).
- Engelleme çözeltisini çıkarın ve seyreltilmiş birincil antikorları ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Şu andan itibaren karanlıkta tüm kuluçka adımlarını gerçekleştirin. - Birincil antikorları çıkarın ve her seferinde 10 dakika PBS ile 3 kez yıkayın.
- Antikor dilüent veya PBS'de %0.2 (w/v) BSA'daki ikincil antikorları seyreltin: keçi anti-fare- 555 (1:300), keçi anti-tavşan- 647 (1:300). Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka.
- İkincil antikorları çıkarın ve her seferinde 10 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
- Biotin konjuge lektin kullanılırsa, avidin/biotin bloke kitini kullanın. PBS ile arasında iki yıkama ile sağlanan her reaktif ile 10 dakika kuluçka.
- PBS'de %10 keçi serumu ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca slaytları kuluçkaya yatırarak engelleme adımını tekrarlayın.
- Biyotinylated lektin, biyotinylated Ulex europaeus lektin (1:200, stok 2 mg / mL), pbs veya antikor dilüent 0.2% BSA (w / v) seyreltilmiş ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat ve 30 dk kuluçka.
- Fazla biyotinylated lektin çıkarın ve 10 dakika her zaman PBS ile üç kez yıkayın.
- PBS veya antikor dilüent% 0.2 (w / v) BSA seyreltilmiş ikincil streptavidin konjuge antikor ekleyin. 1 saat kuluçka.
- İkincil antikor çıkarın ve 10 dakika her zaman PBS ile üç kez yıkayın.
- 4 ile Counterstain çekirdekleri,,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1:500, stok 5 mg /mL), PBS% 0.2 BSA seyreltilmiş (w / v), oda sıcaklığında 10 dakika.
- DAPI çözeltisini çıkarın ve her seferinde 10 dk olan PBS ile iki kez yıkayın.
- Kaydırakça sulu montaj maddesi ile monte edin. Karanlıkta bir gece veya 37 °C'de 1 saat boyunca tamamen kurusun.
- Slaytları karanlıkta 4 °C'de tutun ve bir epifloresan mikroskobunda görüntüler elde edin.
4. Mikro-parçalanmış yağ dokusunun sindirimi ve hücre izolasyonu
- Mikro-parçalanmış yağ dokusunu steril bir kap içine aktarın.
- DMEM'de tip-II kollajenaz1 mg/mL konsantrasyonu ile yeni bir sindirimi ortamını kurutun.
- Mikro-parçalanmış yağ dokusuna aynı hacimde sindirim ortamı ekleyin (örneğin 30 mL'si için 30 mL sindirim ortamı ekleyin).
- 45 dakika boyunca 120 rpm için ayarlanmış bir 37 ° C sallayarak su banyosu mühürlü konteyner yerleştirin. Konteynerin numunenin düzgün bir şekilde sallanıyorolması gerektiğini lütfen unutmayın. Büyük bir kap yoksa, yatay olarak yerleştirilen iki adet 50 mL 'lik (her birinde 30 mL numune/sindirim orta karışımı) kullanın.
- Kuluçkadan sonra, eşit hacimde blokaj çözeltisi (2% v/v) FCS/PBS) ekleyerek sindirimi engelleyin ve 100 μm ve 70 μm hücreli süzgeçler arasından sırayla filtre uygulayın.
- 200 x g5 dakika için filtreli süspansiyon santrifüj . Supernatant atın.
- Eritrosit lysis tamponunun yaklaşık 5 mL'lik (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7.65) içinde peletin yeniden askıya alınması. Tampon hacmi hücresel pelette gözlenen eritrosit kontaminasyonuna göre değişebilir. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
- Eşit hacimli blokaj çözeltisi ekleyin ve 40 μm'lik bir hücresüzden filtreuygulayın.
- 200 x g 5 dakika hücre süspansiyon santrifüj ve supernatant atın.
- Engelleme çözeltisinde peleti yeniden askıya alın. Pipetleme ile iyice karıştırın. Hemositometrede Trypan mavisi hariç tutulabilir hücreleri sayın.
- Hücre süspansiyonunun eşit hacmini Trypan mavisi lekeyle karıştırın. Çözeltinin 10 μL'lik aspire edin ve hemositometreye yerleştirin.
- En az 5 karede bulunan canlı hücre sayısını (parlak ve yuvarlak) sayın ve ortalama hücre numarasını alın. Leke seyreltme faktörlerini eklemek için ortalama hücre sayısını 2 ile çarpın. Numunenin 1 mL'si başına toplam canlı hücre sayısını elde etmek için elde edilen sayıyı 104ile çarpın.
NOT: Elde edilen tek hücreli süspansiyon, yani stromal vasküler fraksiyon (SVF), perivasküler hücre büyüme ortasında 20.000 hücre/cm 2(DMEM %20 ısı inaktive FCS, %1 penisilin/streptomisin ve %1 ile desteklenmiştir) tohumlanabilir. L-glutamin) veya akış sitometri analizi ve sıralama için kullanılır. SVF'deki çekirdekli hücrelerin ortalama verimi mAT başına yaklaşık 3 x 104 hücredir. Sıralama deneyleri, kültür için yeterli perivasküler hücre elde etmek için en az 8 x 105 hücre gerektirir.
5. Hücre etiketleme ve sıralama
- 200 x g'de5 dakika oda sıcaklığında hücre süspansiyonuna santrifüj edin ve 100 μL'de 1 x 106 hücre konsantrasyonunda bloke ortamında peleti yeniden askıya alın.
- Aliquot lekesiz kontrol ve floresan eksi bir (FMO) polistiren yuvarlak alt akış sitometri tüpleri içine kontrolleri için en az 50.000 hücreleri. Başka bir tüp yerleştirerek çok renkli boyama için hücrelerin geri kalanını kullanın.
NOT: Deneyin ayarları belirlendikten sonra (yani lazer yoğunluğu, gating stratejisi), lekesiz kontrol için kullanılan hücre sayısı ve FmO'lar azaltılabilir, eğer kullanılan antikorlar aynıysa. - Çok renkli boyama için tek hücreli süspansiyona CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) ve CD146-BV711 (1:100) antikorları ekleyin. FMO kontrolleri için şunu ekleyin: CD34-PE ve CD146-BV711 artı V450 isotype kontrolüv450 FMO eşdeğer hacimleri için; CD31-V450, CD45-V450 ve CD146-BV711 artı PE isotip kontrolü PE FMO eşdeğer hacimleri için; CD31-V450, CD45-V450 ve CD34-PE artı BV711 isotip kontrolü BV711 FMO eşdeğer hacimleri için.
- Yavaşça pipet, ya da girdap yavaş yavaş tüp çözeltisi karıştırmak ve 4 °C'de tüpleri kuluçkaya yatırın 20 dk karanlıkta.
- Tazminat kontrol boncukları hazırlayın. 3 polistiren yuvarlak-alt akış-sitometri tüpünde 70 μL bloke ortamına 15°L pozitif boncuk ve 15°L negatif boncuk ekleyin. CD34-PE, CD31-V450 veya CD45-V450 ve CD146-BV711 antikorları, tüp başına bir ekleyin.
- Yavaşça pipet, ya da girdap yavaş yavaş, boncuk ile antikorları karıştırmak ve karanlıkta 20 dakika için 4 ° C tüm tüpler inkübün.
NOT: Açıklanan yordam akış sitometri analizi veya hücre sıralama için kullanılabilir. - Tüplerin iç yüzeyini endotel büyüme ortamı (EGM) ile önceden ıslatarak ve her tüpün altında yaklaşık 50°L orta bırakarak toplama tüpleri hazırlayın.
- Antikor inkübasyonu sonra, hücreleri ve boncukları 2 mL bloke ortamı ile yıkayarak antikor fazlalığını ortadan kaldırın.
- 5 dk için 200 x g tüpleri santrifüj ve dikkatle supernatant aspirating tarafından çözeltiyi çıkarın. Yıkama adımını kopyalayın.
- 250 μL'de 1 x 106 hücrenin son konsantrasyonunda bloke ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın.
- Hücreleri hücre süzgeci kapağı ile yeni polistiren yuvarlak-alt akış sitometri tüpleri içine aktarın. Bu hücre kümelerinin bozulmasına izin verecektir.
- Tüm hücre ve boncuk süspansiyonlarını karanlıkta buz üzerindeki hücre ayırıcısına taşıyın.
- Arka plan floresankurmak ve voltajayarlamak için lekesiz kontrol hücreleri çalıştırın.
- Floresan telafisini ayarlamak için tazminat kontrol tüplerini çalıştırın.
- Hücreleri tanımlamak için ileri dağılım alanını (FSC-A) vs yan dağılım alanı (SSC-A) kullanın ve ardından tek hücreleri seçmek için ileri dağılım alanı (FSC-A) ile ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) kullanın.
- Ölü hücrelerin gating'ini ayarlamak için lekesiz kontrole, numunenin her mL'si için 1 μL, 5 g/mL çözeltisi olan DAPI ekleyin(Şekil 2). DAPI boyama dan sonra yıkama gerekmez.
- Spesifik olmayan bağlamaile ilgili arka plan floresan eşikleri oluşturmak ve gating ayarlamak için isotype denetimleri çalıştırın.
- Çok renkli lekeli örneği çalıştırın. CD31 ve CD45 negatif hücrelere gating ederek hematopoetik ve endotel hücreleri hariç. Perisit (CD146+ CD34-) ve adventif hücre (CD146- CD34+) popülasyonlarını toplama tüplerine toplayın (Şekil 2).
NOT: Optimal canlı hücre verimleri perisitler için toplam canlı hücre ayrışması yaklaşık % 2 ve adventif hücreler için% 1.5'tir.
6. Hücre kültürü
- Jelatin kaplı kültür plakalarında 30.000 ila 40.000 hücre/cm2 yoğunlukta taze sıralanmış perisitler ve adventif hücreler
- Kültür plakalarını kaplamak için plaka alanını PBS çözeltisinde steril %0,2 (w/v) jelatinle kaplayın (cm2'deyaklaşık 100 μL çözelti). 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka ve çözelti çıkarın. Kültür plaka kaplama sırasında buz üzerinde taze sıralanmış hücreleri tutun.
- 5 dk için 200 x g taze toplanan hücreleri santrifüj ve yavaşça endotel büyüme ortamı (EGM) uygun miktarda hücre pelet askıya. Toplanan hücre sayısı çok düşükse, santrifüjden kaçının ve toplanan hücreleri doğrudan plakalayın.
- Jelatin kaplı tabaklarda hücreleri tohum. 37 °C'de %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
- Hücreler yerleştikten ve tabağa yapıştıktan sonra (en az 72 saat sonra), perivasküler hücre büyüme ortamıyla (DMEM %20 ısı inaktive FCS, %1 penisilin/streptomisin ve %1 L-glutamin ile desteklenmiştir) hem perisitler hem de adventif hücreler için EGM'yi değiştirin.
- Perisitler ve adventif hücreler %80-90 biraraya geldiklerinde hücreleri %0.05 tripsin-EDTA kullanarak ayırın. %5 FCS/PBS ile toplayın, 5 dakika için 200 x g'de santrifüj, perivasküler hücre büyüme ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri 1:3'ten 1:5'e (veya yaklaşık 7.000 hücre/cm2'de)kaplamasız polistiren kültür plakalarına veya şişelere iletin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manuel lipoaspire'lerin mekanik ayrışması, mikrovasküler ağı saran bir adiposit toplamından oluşan mikro parçalı yağ dokusunun (MAT) üretimine yol açmıştır (Şekil 3). Jelatin gömülü ve kriyofixed MAT'ın immünfloresans analizi bu yapıyı vurgular, endotel hücre belirteci Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) reseptörü ile işaretlenmiş vasküler ağı gösterirken esas olarak küçük, kılcal damarlardan oluşur ( Şekil 4). Özellikle NG2 veya PDGFRβ ifade eden perisitler normalde dağıtılır, endotel hücreleri ensheathing(Şekil 4). Bu veriler mekanik mikro parçalanma işleminin perivasküler hücre bölmesi etkilemediğini doğrulamaktadır. Perivasküler hücrelerin varlığı, hem perisitler hem de adventif hücreler, akış sitometrisi ile doğrulanmıştır. Hücreleri seçmek için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) vs yan dağılım alanı (SSC-A) kapısı kullanılmıştır (Şekil 2A). Tanımlanan hücre popülasyonu, tek hücre seçmek için ileri dağılım alanı (FSC-A) vs ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) kullanılarak daha da geçitlendi ve canlı hücreler DAPI boyama için negatif olarak tanımlandı(Şekil 2B-C). CD31 ve CD45 belirteçleri hematopoetik ve endotel hücrelerini dışlamak için kullanılmıştır(Şekil 2C). Son olarak perisitler CD146+ CD34ve adventif hücreler CD146- CD34+ (Şekil 2Dolarak tanımlanmıştır. Gating stratejisi Şekil 2'deözetlenmiştir. Aynı gating stratejisi deneyleri sıralama için takip edildi. FACS saflaştırılmış MAT perisitleri ve adventif hücreler kültürde stellat morfolojisi için bir mil sergilerler. 8 gün boyunca kültür MAT daha fazla sitokins salgılar gösterdi (adiponektin, CD14, CD31, CD154, chitinaz 3 benzeri 1, kompleman faktörü D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-α, CD87), veanjenik faktörler (anjiyojenin, anjiyostatin, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, trombopondin 2, TIMP4, uPA) in vitro svf daha. Ayrıca Hem MAT hem de SVF tarafından üretilen sitokinler ve anjiyojenik faktörler MAT süpernatantlarında daha boldur. Buna göre, MAT kollajenaz ile sindirilir ve kültür yerleştirilen geleneksel SVF15gözlenen benzer bir salgı üretti. Tüm bu veriler, mikro-parçalanmış yağ dokusunun sadece terapötik açıdan avantajlı olmakla kalmamış, aynı zamanda henotibik ve fonksiyonel araştırmalara da uygun olduğunu göstermektedir. Özellikle, MAT kümelerinin küçük boyutu kültürde salgı aktivitesinin test edilmesine olanak sağlar, bu da büyük yağ dokusu parçalarıyla daha zor olacaktır.
Şekil 1: Deri altı yağ dokusunun mikro parçalanmasının şematik gösterimi. Lipoaspirate bir kanül kullanılarak deri altı yağ dokusundan toplanır. Toplanan lipoaspirate yakın sistem cihazı kullanılarak mikro-parçalanmış. Ortaya çıkan mikro-parçalanmış yağ dokusu (MAT) perivasküler hücreler ve adipositler de dahil olmak üzere birden fazla hücre tipi tarafından oluşur. MAT eksplant kültürü ve immünohistokimya dahil olmak üzere birden fazla testte ve hücre izolasyonu için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MAT'tan perivasküler hücre analizi/sıralama için temsili gating stratejisi. Bir ileri dağılım alanı (FSC-A) vs yan dağılım alanı (SSC-A) kapısı hücreleri tanımlamak için kullanılır(A),ileri dağılım alanı (FSC-A) vs ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) tek hücreleri seçmek için takip(B). Canlı non-endotel ve non-hematopoetik hücreler dapi, CD31-V450 ve CD45-V450 sırasıyla negatif olarak geçitli, aynı panelde(C). Son olarak perivasküler hücreler perisit (CD146+ CD34-) veya adventif hücreler (CD146- CD34+)(D)olarak tanımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MAT morfolojisi. Bazal ortamda kültürlenmiş MAT parlak alan görünümü. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MAT'ta vaskülatür ağı. Endotel hücreleri UEA-1 ile boyanmıştır. A'daki kutulu alanlar B ve C'de genişlemiş olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazı, normal yağ dokusu mikroanatomi gösteren küçük kümeler halinde insan yağ dokusukapalı bir sistem cihazı kullanarak, fiziksel fraksiyonu açıklar.
Elle emişli insan deri altı yağ dokusu ve tuzlu çözelti, cihazın güçlü manuel sallayarak üzerine, alt milimetre içine yağ yırtmak büyük langırt tarzı metalik küreler içeren şeffaf bir plastik silindir içine yüklenir Parça. Ekli filtreler ve priz enkaz ortadan kaldırılması na izin, kan ve serbest lipidler ve MAT cihaza bağlı bir şırınga toplanır. Burada, MAT başarıyla immünohistokimya, akış sitometri ve kültür için işlenmiş, bu özel cihaz tıbbi bir bakış açısıyla geliştirilmiş olmasına rağmen, tiyatroda enzimatik olarak üretilen yağ dokusu stromal vasküler yerine fraksiyonu veya kültür elde edilen yağ kök hücreleri, ve gerçekten plastik cerrahi ve çeşitli diğer hücre tabanlı tedaviler de son derece verimli olduğunu kanıtladı4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Bu nedenle, adipoz doku uzun sadece bir dolgu olarak bozulmamış olarak kullanılan16 yerli 3 boyutlu yapılandırma döner, enzimatik dissosyasyon ve in vitro kültür yıl sonra. Bu büyümek ve organoidlerin artan popülaritesi ile gösterildiği gibi, dağınık hücre popülasyonları olarak yerine doğuştan gelen çok hücreli düzenleme dokuları çalışma genel bir eğilim izler17.
Bu mekanik cihazı kullanarak yağ dokusu parçalanması güvenilir ve tekrarlanabilir kanıtlanmıştır ve orijinal protokolde herhangi bir değişiklik gerekli olmamıştır. Deneysel çalışmalar için insan deri altı yağ sıradan kaynağı kozmetik nedenlerle toplanan bir lipoaspirate, doğrudan parçalanma cihazına yüklenir. Araştırma laboratuvarında kullanıcılar için bir sınırlama olsa da, işlenecek yağ dokusu yavaşça elle aspire edilmesi gerektiğini, mümkün olduğunca bozulmamış doku mikromimarisi korumak için, ve rutin olarak çalışma yapılır gibi bir vakum pompası ile emmek değil Oda. El ile yağ toplamak isteyen bir cerrah tespit edilmedikçe, taze rezeke abdominoplasti kalıntısı kullanılabilir. Karın derisinin iç yönüne bağlı yağ daha sonra kiti ile sağlanan şırınga ile dikkatli ve steril bir şekilde aspire edilebilir. Bu nedenle protokolün başında bu adımı açıkladık (adım 1).
MAT'ın enzim ayrıştırılmış yağ dokusuna göre terapötik üstünlüğünü tam olarak açıklayan nedir? Fraksiyondan hemen sonra mat enzimatik olarak ayrıştırılan akış sitometri analizi, mezenkimal kök hücrelerin doğuştan öncüleri olarak bilinen perisitlerin daha yüksek bir oranını ortaya çıkardı14, toplam aspire edilen yağ dokusu ile karşılaştırıldığında15 . Daha doğrudan, MAT ve SVF kültür supernatants karşılaştırmalı analizi gösterdi ki eski salgılar, nitel ve nicel, daha fazla büyüme faktörleri ve sitokinler dolaylı doku onarımı dahil. Bu pro-anjiojenik faktörlerin yanı sıra immün-inflamasyon çeşitli mediatörleri içerir15.
Bu son sonuçların ötesinde, MAT terapötik potansiyelinin moleküler temeli ile ilgili olarak anlaşılması gereken çok şey vardır. Bu amaçla, burada açıklanan yöntem yağ niş düşük etkili basit, hızlı bir tekniği temsil eder ve daha fazla deneysel manipülasyon için MAT ideal oluşturur. Yardımcı bir bakış açısıyla, klinikte MAT'ın kullanılabilirliğini artırmak için araştırmalar da yapılmaktadır; bu bağlamda, mikro-parçalanmış yağ dokusunun gecikmiş otolog veya allojenik uygulama için dondurulup dondurulamayacağının belirlenmesi öncelik olarak görülmektedir. Son olarak, diğer doku ve organlar kemik iliği, pankreas veya iskelet kası gibi, ancak birkaç, aynı cihaz ile mikro-parçalanmış olabilir ve bozulmamış mikrovaskülature ilişkili hücresel nişler münasip sağlamak gibi belirlemek için önemli olacaktır deneysel müdahaleye.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT, Lipogems'in kurucusudur.
Acknowledgments
Yazarlar Edinburgh Üniversitesi'nden Claire Cryer ve Fiona Rossi'ye akış sitometrisi konusunda uzman yardımları için teşekkür etmek istiyorlar. Ayrıca doku örnekleri sağlayarak katkıda bulunan Murrayfield hastanesi personeline de teşekkür ederiz.
Bu çalışma, İngiliz Kalp Vakfı ve Lipogems'in yağ doku işleme kitleri sağlayan bağışları ile desteklenmiştir. İnsan erişkin doku örnekleri Güney Doğu İskoçya Araştırma Etik Komitesi'nin tam etik izni ile temin edilmiştir (referans: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
