Summary
يصف هذا البروتوكول طريقه جديده لقياس ألوان للكشف عن پريماكين المضادة للملاريا (PMQ) في القنفذ الاصطناعية والأمصال البشرية.
Abstract
وقد أوصت منظمه الصحة العالمية پريماكين (pmq) ، وهو دواء هام لمكافحه الملاريا ، لعلاج التهابات التي تهدد الحياة الناجمة عن p. متصور واوفال. ومع ذلك, PMQ له اثار ضاره غير مرغوب فيها التي تؤدي إلى انحلال النصفي الحاد في المرضي الذين يعانون من نقص الجلوكوز-6-فوسفات (G6PD) عوز. هناك حاجه لتطوير أساليب بسيطه وموثوق بها لتحديد PMQ مع الغرض من رصد الجرعة. في وقت مبكر 2019 ، وقد أبلغنا عن الاشعه فوق البنفسجية والنهج القائم علي العين المجردة للقياس الكمي اللوني PMQ. واستند الكشف علي رد فعل مثل Griess بين PMQ وانانينس ، والتي يمكن ان تولد المنتجات azo الملونة. الحد الأقصى للكشف عن القياس المباشر لل PMQ في البول الاصطناعي هو في نطاق نانومولار. وعلاوة علي ذلك ، أظهرت هذه الطريقة إمكانات كبيره للقياس الكمي PMQ من عينات المصل البشري في تركيزات ذات الصلة سريريا. في هذا البروتوكول ، سوف نقوم بوصف التفاصيل الفنية المتعلقة بالتوليفات وتوصيف منتجات azo الملونة ، واعداد الكاشف ، وإجراءات تحديد PMQ.
Introduction
Pmq هي واحده من أهم الادويه المضادة للملاريا ، وانها لا تعمل فقط كانسجه شيزونتوسيدي لمنع الانتكاس ولكن أيضا كجاميتوسيتوسيدي لمقاطعه انتقال المرض1،2،3،4. انحلال الاوعيه هو واحد من الآثار الجانبية المتعلقة PMQ ، والتي تصبح خطيره للغاية في تلك التي تعاني من نقص في G6PD. ومن المعروف ان الاضطراب الوراثي G6PD موزع في جميع انحاء العالم مع وجود تردد الجينات بين 3-30 ٪ في المناطق الموبوءة بالملاريا. شده ضعف pmq يعتمد علي درجه نقص G6PD فضلا عن الجرعة ومده التعرض pmq5,6. ولخفض المخاطر ، أوصت منظمه الصحة المحدودة بجرعة منخفضه واحده (0.25 ملغم أساس/كغ) من PMQ لعلاج الملاريا. ومع ذلك ، لا يزال هذا التحدي من الاختلافات في حساسية المخدرات المريض5،7. رصد الجرعة ضروري لتقييم الدوائية بعد أداره PMQ, التي يمكن ان تؤثر علي تعديل الجرعة لعلاج ناجح مع سميه محدوده.
اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC) هو الأسلوب الأكثر استخداما لتحديد السريرية PMQ. وذكرت endoh وآخرون نظام HPLC مع كاشف للاشعه فوق البنفسجية للقياس الكمي PMQ المصل باستخدام C-18 البوليمر هلام العمود8. في نظامهم, وقد عجلت البروتينات المصل لأول مره مع اسيتلونيتريل, ومن ثم تم فصل pmq في ماده طافي ل hplc. وكان منحني المعايرة الخطية علي مدي تركيز من 0.01-1.0 ميكروغرام/مل8. وقد ابلغ عن طريقه أخرى علي أساس المرحلة العكسية HPLC مع الكشف عن الاشعه فوق البنفسجية في 254 نانومتر للقياس الكمي من PMQ والأيض الرئيسية9. وكان منحني المعايرة ل PMQ خطيه في المدى بين 0.025-100 ميكروغرام/مل. تم استخدام استخراج سائل سائل إضافي مع الهكسين المختلطة والخلات ايثيل كمرحله عضويه للفصل PMQ مع النسبة المئوية للاسترداد إلى 89%9. وفي الاونه الاخيره ، وضعت ميراندا وآخرون طريقه UPLC مع الكشف عن الاشعه فوق البنفسجية في 260 nm لتحليل PMQ في تركيبات الكمبيوتر اللوحي مع حد الكشف في 3 ميكروغرام/مل10.
علي الرغم من ان أساليب HPLC تظهر حساسية واعده في تحديد المخدرات والحساسية يمكن زيادة تحسين إذا تم تجهيز HPLC مع مطياف الشامل ، لا تزال هناك بعض العيوب. وعاده ما يتعذر الوصول إلى قياسات المخدرات المباشرة في السوائل البيولوجية بواسطة HPLC ، لان العديد من الجزيئات الحيوية يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي التحليل. استخراج اضافيه مطلوبه لأزاله جزيئات الذاتية قبلhplcالتحليل 11,12. وعلاوة علي ذلك ، يتم اجراء كشف PMQ بواسطة كاشف HPLC-الاشعه فوق البنفسجية عاده في الطول الموجي للامتصاص الأقصى (260 نانومتر).; ومع ذلك ، هناك العديد من الجزيئات الذاتية في السوائل البيولوجية مع امتصاص قوي في 260 نانومتر (علي سبيل المثال ، الأحماض الامينيه والفيتامينات والأحماض النووية واصباغ اوروكروم) ، التالي تتداخل مع الكشف عن الاشعه فوق البنفسجية PMQ. وهناك حاجه إلى وضع أساليب بسيطه وفعاله من حيث التكلفة لتحديد الكفاءة الاقتصادية بحساسية وانتقائية معقولتين.
وقدم رد فعل griess لأول مره في 1879 كاختبار قياس ألوان للكشف عن النتريت13,14,15,16. في الاونه الاخيره ، تم استكشاف هذا التفاعل علي نطاق واسع للكشف ليس فقط النتريت ولكن أيضا الجزيئات الأخرى ذات الصلة بيولوجيا17،18،19،20. وقد سبق لنا الإبلاغ عن الدراسة المنهجية الاولي لرد فعل Griess غير متوقع مع PMQ (الشكل 1). في هذا النظام ، PMQ قادره علي تشكيل azos الملونة عندما يقترن مع الانينات المستبدلة في وجود أيونات النتريت في ظل الظروف الحمضية. وقد وجدنا كذلك ان لون azos متنوعة من الأصفر إلى الأزرق عند زيادة الكترون التبرع تاثير مستبدل علي الانينينات21. وقد تم تطوير طريقه القياس اللوني للاشعه فوق البنفسجية مقابل امتصاص القياس الكمي PMQ من خلال رد فعل الأمثل بين 4-ميثوكسيانيلين و PMQ. وقد أظهرت هذه الطريقة إمكانات كبيره للكشف الحساسة والانتقائية من PMQ في السوائل ذات الصلة الحيوية. هنا ، ونحن نهدف إلى وصف الإجراءات التفصيلية لتحديد PMQ استنادا إلى هذه الاستراتيجية اللونية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليف من Azos الملونة
- في قارورة القاع جولة 25 مل (RBF) ، تذوب الانيلين (0.1 ملليمول) و پريماكين بيفسفات (45.5 ملغ ، 0.1 ملليمول) إلى 10 مل من ح3بو4 الحل (5 ٪ v/v). وضع RBF علي حمام الجليد ، أضافه شريط ضجة مع الحجم المناسب في الحل ، ووضع RBF علي لوحه يحركها.
ملاحظه: لتوليف azo الجيل الثالث 3g (الشكل 2) ، استخدم 0.2 ملليمول من پريماكين بيفسفات. - تذوب نانو2 (6.9 ملغ ، 0.1 ملليمول) في 1 مل من المياه المبردة ومن ثم أضافه إلى خليط رد الفعل قطره. أزاله حمام الجليد ، والحفاظ علي خليط التفاعل اثار في درجه حرارة الغرفة.
- مراقبه رد الفعل مع هلام السيليكا المغلفة طبقه رقيقه اللوني (TLC) لوحه. استخدام ثنائي كلورو ميثان (DCM)/الميثانول (meoh) الخليط (المجلد/المجلد = 5:1) كما الشاطف ل TLC. المنتجات azo المعروضات البقع الملونة علي لوحه TLC ، والتي من السهل التمييز بين العينين العارية. وقف رد الفعل عندما تختفي البقع PMQ علي TLC.
- ضبط خليط التفاعل إلى درجه الحموضة > 10 من NaOH (2 M) علي حمام الجليد. استخدام قمع فصل 50 mL لاستخراج الخليط 3 مرات مع 20 مل من خلات ايثيل لكل منهما ، والجمع بين وتركيز المرحلة العضوية تحت فراغ باستخدام المبخر الدوارة.
ملاحظه: قبل الاستخراج ، وضبط قيمه الأس الهيدروجيني من حلول رد فعل أكثر من 10. هذا يستطيع حافظت الأمين أوليه كشكله [نون-متاين], لذلك يسهل استخراج. - تنقيه البقايا عن طريق الفصل اللوني فلاش مع المرحلة العكسية هلام السيليكا تحت الضغط العادي ، وذلك باستخدام MeOH/H2O كما التملص. جفف محلول المنتج من خلال التجميد لإعطاء منتجات azo المرغوبة.
ملاحظه: ويمكن أيضا ان يتم تنفيذ نفس رد الفعل في محلول HCl المخفف (0.2 M).
2. الاشعه فوق البنفسجية مقابل القياسات والحساب النظري
- تذوب نقيه azo (50 μM) في الماء المقطر أو في 5 ٪ ح3بو4 الحل (pH 1.1) ، علي التوالي. سجل أطياف امتصاص الاشعه فوق البنفسجية-فيس (250-700 نانومتر) علي مقياس طيفي في درجه حرارة الغرفة (25 درجه مئوية). تصدير البيانات كملفات .xls/. xlsx لمزيد من التحليل.
-
اجراء جميع الحسابات النظرية ل PMQ نفسها والمنتجات azo باستخدام برنامج Gaussian 16. استخدام الوقت المعتمدة الكثافة الوظيفية نظرية (TD-DFT) مع مجموعه أساس 6-31G. وتشمل تاثيرات المذيبات بواسطة نموذج التواصل المستقطب (PCM) الشكلية باستخدام الماء.
- استخدام البرمجيات (علي سبيل المثال ، مكتب Chemdraw) لرسم الهياكل ومن ثم حفظ الهيكل كملف الإدخال غاوس (gif).
- فتح ملف gif مع عرض غوس وانقر فوق الزر حساب. حدد الاعداد حساب غاوس، اختيار + freq، والأرض الدولة-dft-B3LYP-6-31g؛ من ثم انقر فوق إرسال. سيؤدي تحسين الهندسة إلى إنشاء ملف .log.
- اتباع الاجراء أعلاه ، استخدم غوس فيو لفتح ملف السجل هذا. انقر فوق حساب-الاعداد حساب غاوسي وحدد الطاقة والدفتيريا--التي--B3LYP---------------------------------- ثم إرسال. سيقوم حساب الطاقة بإنشاء ملف سجل آخر وملف مكعب.
- استخدم طريقه عرض غوس لفتح ملف السجل من حساب الطاقة. انقر فوق النتائج-UV/فيس لرؤية الامتصاص المتوقع.
- استخدام غوس عرض لفتح ملف مكعب. انقر فوق النتيجةs وحدد السطح وملامح سطح الإجراءات وسطح جديد لرؤية المدارات.
-
قارن النتائج من كل من القياس التجريبي وحساب الغوسيه. حساب خطا النسبة المئوية بين القيم المحسوبة والمقيسة ، وفقا للمعادلة التالية.
خطا = | (Wماكس كال.-wماكسexper.) /Wماكسexper. | × 100%
حيث يمثل Wmax كال الحد الأقصى لامتصاص الطول الموجي من الحساب النظري و wماكس exper. يمثل الطول الموجي من نتيجة تجريبية.
3. تصميم PMQ
- قياس Pmq باستخدام لوحه 96-بئر (الشكل 5)
- حل 4-ميثوكسيانيلين في 0.2 M HCl للحصول علي محلول انيلين 200 mM ، R1. يذوب نيتريت الصوديوم في الماء المقطر للحصول علي محلول 5 ملم ، R2. الحفاظ علي جميع الحلول في الثلاجة في 4 درجه مئوية قبل الاستخدام.
- أضافه 100 μL من R1 في لوحه 96 ، وأضافه 50 μL من PMQ التي تحتوي علي عينه في لوحه لخلط مع R1. ثم ، أضافه 50 μL من R2 في لوحه. خلط الحلول عن طريق التنضيد المتكررة.
- الحفاظ علي لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه ، ومن ثم تسجيل الامتصاص UV-فيس في 504 nm. كرر 3x لكل اختبار. المنتج azo مستقره مع التعرض للضوء الغرفة ؛ فانه ليس من الضروري للحفاظ علي لوحه تحت الظلام.
- تصدير البيانات كملفات .xls/. xlsx لمزيد من التحليل.
- منحني المعايرة لقياس PMQ المباشر في عينه البول
- اعداد حلول PMQ باستخدام البول الاصطناعية مع تركيزات PMQ في 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM, علي التوالي.
- أضافه 100 μL من R1 في لوحه 96 ، وأضافه 50 μL من محلول البول PMQ لخلط مع R1. ثم قم باضافه 50 μL من R2 إلى الخليط أعلاه. خلط الحلول عن طريق التنضيد المتكررة. الحفاظ علي لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه ، ومن ثم تسجيل الامتصاص UV-فيس في 504 nm.
- إنشاء منحني معايره استنادا إلى الامتصاص I504 وتركيزات pmq. استخدم القيم من الآبار بدون PMQ كفارغه ، واطرح القيم الفارغة من كافة الاختبارات قبل معالجه البيانات.
- تنفيذ نوبة خطيه لتوليد المعادلات الخطية ك y = aX + b، حيث y هي كثافة الامتصاص عند 504 نانومتر ، X هو تركيز pmq ، a هو الميل ، و b هو تقاطع Y للخط الخطي.
- منحني المعايرة لقياس PMQ مباشره في عينه مصل الإنسان
- اعداد حلول PMQ باستخدام مصل الإنسان مع تركيزات PMQ في 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM علي التوالي.
- أضافه 100 μL من R1 إلى لوحه 96 وأضافه 50 μL من محلول المصل PMQ لخلط مع R1. أضافه 50 μL من R2 إلى الخليط أعلاه ومزج الحلول عن طريق التنضيد المتكررة. الحفاظ علي لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه ومن ثم تسجيل الامتصاص الاشعه فوق البنفسجية-vis في 504 nm. تصدير البيانات كملف .xls/. xlsx لمزيد من التحليل.
- إنشاء منحني معايره استنادا إلى الامتصاص I504 وتركيزات pmq. استخدم القيم من الآبار بدون PMQ كفارغه ، واطرح القيم الفارغة من كافة الاختبارات قبل معالجه البيانات.
- تنفيذ نوبة خطيه لتوليد المعادلات الخطية ك y = aX + b، حيث y هي كثافة الامتصاص عند 504 نانومتر ، X هو تركيز pmq ، a هو الميل ، و b هو تقاطع Y للخط الخطي.
- استخراج PMQ من المصل
- أضافه كميه معينه من PMQ في مصل الإنسان لمحاكاة المصل التي تحتوي علي PMQ. لاستخراج PMQ ، أضافه 6 مل من خليط خلات ايثيل/الهكسان (7:1 v/v) في 2 مل من المصل التي تحتوي علي PMQ في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
- أضافه 100 μL من هيدروكسيد الصوديوم (2 M) حل لنظام الاستخراج. هز الأنبوب بعنف باستخدام خلاط دوامه لمده 30 ثانيه. جمع الطبقة العضوية والتركيز عليه باستخدام المبخر الدوارة تحت فراغ.
- أعاده أذابه بقايا مع 200 μL من الماء المقطر وأزاله مكونات الدهون غير قابله للذوبان عن طريق الترشيح من خلال غشاء علي شكل قرص مع حجم المسام 220 nm. استخدم الحل النهائي للاختبار.
- تحديد PMQ من المصل مع استخراج
- اتبع الخطوات 3.2 أو 3.3 لتوليد منحني المعايرة ل PMQ في الماء المقطر. استخراج PMQ من الأمصال التي تحتوي علي PMQ وفقا للخطوة 3.4.
- أضافه 100 μL من R1 و 50 μL من محلول PMQ في لوحه 96 حسنا. أضافه 50 μL من R2 إلى الخليط أعلاه ، ومزج الحلول عن طريق التنضيد المتكررة.
- الحفاظ علي لوحه في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه وتسجيل الامتصاص الاشعه فوق البنفسجية-vis في 504 nm. استخدام الآبار مع R1 و R2 ولكن بدون PMQ كعناصر التحكم. تصدير البيانات كملفات .xls/. xlsx لمزيد من التحليل.
- اطرح قيم عنصر التحكم من قيم الامتصاص I504 لكل اختبار ، ثم استخدم النتيجة لحسابات التركيز وفقا لمعادله البطانة من منحني المعايرة.
ملاحظه: يمكن حساب حد الكشف (اللد) ل PMQ في جميع الحالات وفقا للأسلوب القياسي22. واستند حساب علي وظيفة المعايرة: اللد = 3.3 × SD/b، حيث sd هو الانحراف المعياري لل فارغه و b هو الميل من خط الانحدار
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحسين ظروف التفاعل (الشكل 2) ، وقد استخدمت الانينات المختلفة للزوجين مع pmq من خلال رد فعل griess. لقد حققنا سلسله من azos مع ألوان مختلفه. وقد وجد ان الانانينات مع الكترون التبرع مستبدل يمكن ان يسبب التحول الأحمر في طيف امتصاص الاشعه فوق البنفسجية-فيس. وأجريت الحسابات النظرية من خلال نظرية الكثافة الوظيفية المعتمدة علي الوقت (TD-DFT). وكما هو مبين في الشكل 2 الف، كانت نتيجة الحساب في اتفاق جيد مع القياسات البصرية التي بلغ متوسط الخطا فيها 3.1 في المائة. 4-ميثوكسيانيلين كان يستخدم بعد ذلك لاجراء رد فعل الكشف PMQ بسبب أدائها الجيد في معدل التفاعل ، والذوبان في المنتج ، والاستقرار21. وعلاوة علي ذلك ، فان المنتج azo من 4-ميثوكسيانيلين هو اللون الأحمر ، والتي من السهل التمييز مع عيون عاريه. ولذلك ، فان هذا التفاعل يوفر امكانيه للكشف عن PMQ العين العارية (الشكل 3).
الشكل 4A يظهر تاثير الأس الهيدروجيني علي الطيف امتصاص الاشعه فوق البنفسجية vis من المنتج azo 3d. انا504 لا يتغير عند زيادة درجه الحموضة من 1.0 إلى 6.0. I504 تحت ph 7.0 المعارض انخفاض طفيف ، في حين ان الأس الهيدروجيني الأساسي (8.0 و 9.0) يؤثر بشكل كبير علي الامتصاص. يظهر الشكل 4B تاثيرات الرقم الهيدروجيني لحلول pmq علي رد فعل griess. PMQ (50 μM) في المخزن المؤقت لتلفزيوني مع مختلف الشخصيات (4.0 ، 5.0 ، 6.0 ، 7.0 ، 8.0 ، 9.0) كانت مختلطة بشكل فردي مع كاشف الاختبار كما هو موضح في القسم 3.1. I504 تم قياس ثم بعد 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. كما هو مبين ، الاساسيه (8.0 ، 9.0) من حلول PMQ يحتمل ان تؤثر علي رد الفعل. يبين الشكل 5 الاجراء العام لتنفيذ رد فعل griess للكشف عن pmq. كما هو موضح في قسم البروتوكول ، مطلوب أربع خطوات للحصول علي بيانات الاستيعاب I504 للتحليل. الشكل 6A و 6a إظهار منحنيات المعايرة للكشف المباشر عن pmq من البول وعينات المصل ، علي التوالي ، دون عينه المعالجات المسبقة. وقد وجدت علاقة خطيه ممتازة (R2 = 0.998) عندما pmq في البول الاصطناعية يتراوح من 0 إلى 200 μM. في الفترة من عينه المصل ، تم العثور علي علاقة خطيه في تركيز تتراوح بين 10 إلى 200 μM.
يظهر الشكل 7A الاجراء لاستخراج pmq من المصل. وأعيد أذابه البقايا في الماء المقطر بعد الاستخراج والتركيز ، ثم الترشيح. لمحاكاة المصل الذي يحتوي علي PMQ الحقيقي ، تم أضافه PMQ في مصل الإنسان مع تركيزات النهائية في 0 ، 0.2 ، 0.5 ، 1.0 ، 2.0 μM. باستخدام الخطوات 3.4 و 3.5 ، تم العثور علي تركيزات PMQ في الأمصال ان تكون 0.02 ، 0.14 ، 0.44 ، 0.90 و 1.78 μM ، علي التوالي (الشكل 7C). واستنادا إلى النتيجة ، تم العثور علي نسبه الاسترداد PMQ لتكون حوالي 90 ٪ عندما كان PMQ أكثر من 0.5 μM في المصل ، والتي كانت مماثله للتقارير السابقة9.
الشكل 1: الرسمالتخطيطي لرد الفعل GRIESS علي pmq. (ا) رد فعل تقليدي من الوقاحة لتحليل النتريت. (ب) رد فعل griess في طريقه الكشف عن pmq المقترحة. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من العمل السابق21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فوتوفيسيكال خصائص azos الاصطناعية. (ا) قياس الاشعه فوق البنفسجية والحساب النظري للامتصاص الأقصى لامتصاص الازوس المتولد من الانينات المختلفة. الأرقام خارج الأقواس تمثل للحد الأقصى لقياس الامتصاص في المقطر H2س بالقرب من شروط الحموضة المحايدة; الأرقام في الأقواس تشير إلى القياس في 5 ٪ ح3بو4 الحل (pH ≈ 1.1). λabs/nm exper. يمثل بيانات التجربة و λabs/الكالسيوم يمثل بيانات الحساب النظري. Eexc هو الطاقة الاثاره (eV) ، و f هو قوه مذبذب. (ب) صور الصورة من pmq ومنتجات azo مع بدائل مختلفه ، 50 μM في محلول حمض الفوسفوريك 5 ٪. (ج) أطياف الاشعه فوق البنفسجية للمنتجات التركيبية. تم تطبيع القيم إلى نطاق بين 0 و 1. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من العمل السابق21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد القياس اللوني ل pmq. (ا) رصد التغيرات في الامتصاص بحد اقصي504 Iفي طريقه تعتمد علي الوقت. تم تنفيذ رد الفعل باستخدام 4-ميثوكسيانيلين ، واستخدمت PMQ في 100 μM ؛ (ب) تغييرات اللون من رد الفعل مع تركيزات مختلفه من pmq: 400 μl من محلول 4-ميثوكسيانيلين (200 mm في 0.2 M HCl) و 200 μl من نيتريت الصوديوم في الماء (5 ملم) ، مع 200 μl من محلول pmq من تركيزات مختلفه (0 ، 1 ، 2 ، 5 ، 10 ، 20 ، 50 ، 100 μM). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تاثير الرقم الهيدروجيني علي كشف pmq. (ا) اثار الحموضة علي امتصاص الاشعه فوق البنفسجية-vis من المنتج azo 3d (50 μM) ؛ (B) pmq (50 μM) في المخزن المؤقت لتلفزيوني مع مختلف العمليات العامة (4.0 ، 5.0 ، 6.0 ، 7.0 ، 8.0 ، 9.0) استخدمت لتنفيذ رد الفعل كما هو موضح في الخطوة 3.1. خمسه عشر دقيقه في وقت لاحق ، تم قياس الامتصاص في 504 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصميم pmq من خلال رد فعل griess علي نظام لوحه 96-حسنا. R1 يشير إلى 200 mM 4-ميثوكسيانيلين الحل في 0.2 M HCl; يشير R2 إلى 5 مم نيتريت الصوديوم في الماء المقطر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: منحنيات المعايرة لتحديد Pmq من (ا) البول الاصطناعي و (ب) عينات المصل البشري. ويتراوح تركيز PMQ من 0-200 μM. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحديد pmq من عينات المصل. (ا) توضيح تخطيطي لاستخراج pmq من عينات المصل للتحليل الكمي. (ب) العلاقة الخطية التي تم العثور عليها بين I504 و pmq تركيز داخل النطاق من 0 إلى 100 μM. (C) تم قياس المصل بواسطة الأسلوب القائم علي رد الفعل griess بالمقارنة مع الكمية المحددة المضافة إلى المصل. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من العمل السابق21. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1 الحساب النظري للسجل D والنسبة المئوية لتوزيع المياه من PMQ و CPMQ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا طريقه القياس اللوني لقياس الكمية المناسبة ل PMQ. ومن المحتمل ان تكون الطريقة الحالية الأكثر بساطه وفعالية من حيث التكلفة. الأهم من ذلك ، يوفر هذا الأسلوب يتيح قياس PMQ علي أساس العين المجردة دون استخدام اي معدات.
رد فعل Griess الأمثل للكشف عن PMQ يمكن ان تولد اللون الأحمر azo مع امتصاص اقصي في 504 nm. التاثير المحتمل للاشعه فوق البنفسجية-فيس امتصاص الجزيئات الحيوية الذاتية محدود ، مما يجعل الطريقة واعده للقياس المباشر ل PMQ في السوائل البيولوجية. كما هو مبين في النتيجة ، تم العثور علي علاقة خطيه ممتازة (R2 = 0.998) للكشف عن البول pmq علي مدي تركيز 0-200 μM (الشكل 6a). تم العثور علي حد الكشف (اللد) ل PMQ 0.63 μM. وقد أظهرت هذه الطريقة أيضا إمكانات كبيره للقياس المباشر لل PMQ في مصل الإنسان. تم العثور علي علاقة خطيه ممتازة في تركيز تتراوح بين 10 إلى 200 μM للكشف عن المصل PMQ (الشكل 6B). يمكننا زيادة تحسين الحساسية عن طريق المعالجة المسبقة لعينه المصل من خلال الاستخراج والتركيز. كما يظهر الشكل 7 مع عمليه استخراج بسيطه ، وهذا الأسلوب يمكن قياس المصل pmq في النطاقات ذات الصلة سريريا. واستنادا إلى اليه التفاعل ، فان المستقلب الكربوكسيل الرئيسي من PMQ (CPMQ) يمكن ان تشكل منتجا azo مع خصائص مماثله للاشعه فوق البنفسجية-فيس. ومع ذلك ، فان استخراج السائل السائل تحت ظروف الأس الهيدروجيني الاساسيه يمكن ان يقلل من التدخل من CPMQ. ويبين الجدول 1 السجل المحسوب D وتوزيع المياه لكل من PMQ و cpmq. كما هو مبين ، في درجه الحموضة > 10 ، سيتم العثور علي اقل من 6.33 ٪ من PMQ في مرحله المياه ، في حين ان أكثر من 98.54 ٪ من CPMQ سيكون في مرحله المياه. ولذلك ، نظريا ، يمكن استخراج أكثر من 93.7 ٪ من PMQ واقل من 1.56 ٪ من CPMQ للاختبار. ويمكن الخلوص إلى ان التداخل من الأيض الرئيسي CPMQ محدود.
الاجراء للكشف عن PMQ من السهل جدا للتعامل معها. أخذ النظام القائم علي لوحه 96 بشكل جيد علي سبيل المثال ، يتكون الاجراء بأكمله من أربع خطوات: 1) أضافه 100 μL من محلول 4-ميثوكسيانيلين (200 ملم في 0.2 M HCl) R1 في لوحه 96-حسنا ؛ 2) أضافه 50 μL من تركيز PMQ-عينه غير معروفه لخلط مع R1 ؛ 3) أضافه 50 μL من R2 (محلول نيتريت الصوديوم 5 مم) لأداء رد الفعل في درجه حرارة الغرفة ؛ و 4) تسجيل امتصاص الاشعه فوق البنفسجية-فيس في 504 nm باستخدام مطياف. يمكن حساب تركيز PMQ من عينه غير معروفه استنادا إلى كثافة الامتصاص I504 والمعادلة الخطية من منحني المعايرة. يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في درجه حرارة الغرفة دون الحاجة إلى الحضانة. بيئة مظلمة ليست ضرورية للاجراء بأكمله ، كما ان المنتج الملون ليست حساسة للضوء الغرفة.
وتجدر الاشاره إلى ان الوقت لحل رد الفعل للوصول إلى المشبعة I504 هو درجه الحرارة المعتمدة. كما هو مبين في الشكل 3، كان مطلوبا علي الأقل 12 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (25 درجه مئوية). وقت رد الفعل سيكون أطول إذا أداء رد الفعل في درجات حرارة اقل من 25 درجه مئوية. حاله الأس الهيدروجيني الاساسيه للحلول PMQ يمكن ان تؤثر علي الامتصاص I504. لمعالجه هذه المشكلة ، ضبط درجه الحموضة للحل PMQ ان تكون اقل من 7.0. خلاف ذلك ، هناك حاجه إلى منحني معايره جديده للحل مع pH أكثر من 7.0. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تؤثر النتريت المتاصله في العينات المختبرة علي الكشف. ومع ذلك ، قد يحدث هذا فقط عندما يكون تركيز النتريت الذاتية مرتفعا للغاية نظرا لاستخدام تركيز عالي من النتريت (5 مم) في اختبار قياسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي أصحاب البلاغ ما يعلنونه.
Acknowledgments
ويعترف المؤلفون بمنحه البدء من جامعه قوانغتشو للطب الصيني ومشروع التدريب علي البحث العلمي للشباب في غزوم (2019QNPY06). ونحن نعترف أيضا مركز لينغنان للبحوث الطبية في جامعه قوانغتشو للطب الصيني لدعم المرافق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418 (2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
