Summary
Bu protokol sentetik idrar ve insan serumlarında sıtma önleyici primaquine (PMQ) tespiti için yeni bir kolorimetrik yöntemi açıklar.
Abstract
Primaquine (PMQ), önemli bir anti-sıtma ilaç, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından P. vivax ve ovaleneden olduğu hayatı tehdit eden enfeksiyonların tedavisi için tavsiye edilmiştir. Ancak, PMQ glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği olan hastalarda akut hemoloz yol istenmeyen yan etkileri vardır. Dozaj takibi amacıyla PMQ tayini için basit ve güvenilir yöntemler geliştirilmesi gerekmektedir. 2019'un başlarında, PMQ kolorimetrik nicelleştirme için UV-Vis ve çıplak gözle dayalı bir yaklaşım bildirdik. Algılama, RENKLI azo ürünleri üretebilen PMQ ve aneninler arasındaki Griess benzeri reaksiyona dayanıyordu. Sentetik idrarda PMQ doğrudan ölçümü için algılama sınırı nanomolar aralığındadır. Ayrıca, bu yöntem klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda insan serum örneklerinden PMQ nicelliği için büyük bir potansiyel göstermiştir. Bu protokolde, renkli azo ürünlerinin sentezi ve karakterizasyonu, reaktif hazırlığı ve PMQ tayini prosedürleri ile ilgili teknik detayları açıklayacağız.
Introduction
PMQ en önemli sıtma ilaçları biridir, bu nüks önlemek için bir doku şizontosit olarak değil, aynı zamanda hastalıkiletimikesmek için bir gametositocide olarak sadece çalışır 1,2,3,4. İntravasküler hemoliz PMQ ilgili yan etkilerinden biridir, G6PD bu eksik son derece ciddi hale gelir. Sıtma endemik bölgelerinde G6PD genetik bozukluğunun %3-30 arasında bir gen frekansı ile dünya çapında dağıtıldığı bilinmektedir. PMQ zayıflığının şiddeti G6PD eksikliğinin derecesine ve pmq maruziyetinin dozuna ve süresine bağlıdır5,6. Riski azaltmak için, WHO sıtma tedavisi için PMQ tek bir düşük doz (0.25 mg baz/ kg) tavsiye etti. Ancak, bu hala hasta ilaç duyarlılığı varyasyonları tarafından meydan5,7. Doz izleme PMQ uygulamadan sonra farmakokinetiği değerlendirmek için gereklidir, sınırlı toksisite ile başarılı bir tedavi için doz ayarlaması etkisi olabilir.
Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) PMQ klinik tayini için en yaygın olarak kullanılan tekniktir. Endoh ve ark. bir C-18 polimer jel sütun8kullanarak serum PMQ quantification için bir UV dedektörü ile bir HPLC sistemi bildirdi. Onların sisteminde, serum proteinleri ilk asetonitril ile çöktürüldü, ve daha sonra supernatant PMQ HPLC için ayrıldı. Kalibrasyon eğrisi 0.01-1.0 μg/mLarasındakonsantrasyon aralığında doğrusal dı. 254 nm UV tespiti ile ters faz HPLC dayalı başka bir yöntem PMQ ve büyükmetabolitleri9 nicelliği için bildirilmiştir. PMQ için kalibrasyon eğrisi 0.025-100 μg/mL aralığında doğrusal dı. Organik faz olarak karışık heksane ve etil asetat ile ek bir sıvı-sıvı ekstraksiyon yüzde kurtarma% 899ulaştı PMQ ayırma için kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, Miranda ve ark 3 μg/mL10bir algılama sınırı ile tablet formülasyonlarında PMQ analizi için 260 nm UV algılama ile bir UPLC yöntemi geliştirdi.
HPLC yöntemleri ilaç tayini nde umut verici bir duyarlılık sergilese de ve HPLC kütle spektrometresi ile donatılmışsa hassasiyet ilerlenebilse de, hala bazı dezavantajları vardır. Biyolojik sıvılarda doğrudan ilaç ölçümlerine genellikle HPLC tarafından erişilemez, çünkü birçok biyomolekül analizi büyük ölçüde etkileyebilir. Ek ekstraksiyonh plc analizi11,12önce endojen molekülleri kaldırmak için gereklidir. Ayrıca, Bir HPLC-UV dedektörü ile PMQ algılama genellikle maksimum emme dalga boyunda yapılır (260 nm).; ancak, 260 nm (örneğin, amino asitler, vitaminler, nükleik asitler ve ürokrom pigmentler) güçlü bir emicilik ile biyolojik sıvılarda birçok endojen moleküller vardır, böylece PMQ UV tespiti ile müdahale. Makul hassasiyet ve seçicilik ile PMQ belirlenmesi için basit ve uygun maliyetli yöntemler geliştirmek için bir ihtiyaç vardır.
Griess reaksiyonu ilk kez 1879 yılında nitrit tespiti için kolorimetrik test olarak sunuldu13,14,15,16. Son zamanlarda, bu reaksiyon kapsamlı sadece nitrit değil, aynı zamanda diğer biyolojik olarak ilgilimoleküller17,18,19,20tespit etmek için araştırılmıştır. Daha önce PMQ ile beklenmeyen griess reaksiyonunun ilk sistematik çalışmasını bildirmişiz (Şekil 1). Bu sistemde, PMQ asidik koşullar altında nitrit iyonlarının varlığında yerine aniline ile birleştiğinde renkli azos oluşturmak mümkün. Ayrıca azos renginin aniline21'dekiikame elektron bağışı etkisini artırırken sarıdan maviye değiştiğini gördük. 4-methoxyaniline ve PMQ arasında optimize reaksiyon yoluyla PMQ nicelleştirme için UV-vis emilim bazlı kolorimetrik yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, biyo-ilgili sıvılarda PMQ hassas ve seçici algılama için büyük bir potansiyel göstermiştir. Burada, bu kolorimetrik stratejiye dayalı PMQ belirleme için ayrıntılı prosedürleri açıklamayı hedefliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Renkli Azos Sentezi
- 25 mL yuvarlak alt şişede (RBF), anilin (0.1 mmol) ve primaquine bifosfatı (45.5 mg, 0.1 mmol) 10 mL H3PO4 çözeltisine (%5 v/v) çözünür. Bir buz banyosu Üzerinde RBF koyun, çözelti içine uygun boyutta bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakası üzerinde RBF koyun.
NOT: Azo 3g sentezi için(Şekil 2),primaquine bifosfat 0.2 mmol kullanın. - NaNO2 (6.9 mg, 0.1 mmol) 1 mL soğutulmuş su çözün ve daha sonra damla reaksiyon karışımı içine ekleyin. Buz banyosunu çıkarın ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığında karıştırın.
- Reaksiyonu silika jel kaplı ince tabaka kromatografi (TLC) plakası ile izleyin. TLC için elüent olarak bir diklorotan (DCM)/metanol (MeOH) karışımı (vol/vol = 5:1) kullanın. Azo ürün çıplak gözlerle ayırt etmek kolaydır TLC plaka, renkli noktalar sergiler. TLC'de PMQ noktaları kaybolduğunda reaksiyonu durdurun.
- Reaksiyon karışımını bir buz banyosunda NaOH (2 M) ile pH >10'a ayarlayın. Her biri için 20 mL etil asetat ile karışımı 3 kez çıkarmak için 50 mL ayırma hunisi kullanın, birleştirmek ve bir döner buharlaştırıcı kullanarak vakum altında organik faz konsantre.
NOT: Çıkarmadan önce, reaksiyon çözeltilerinin pH değerini 10'un üzerinde ayarlayın. Bu, birincil aminin iyonize olmayan formu olarak koruyabilir, böylece ekstraksiyonu kolaylaştırabilir. - MeOH/H2O'yu elüent olarak kullanarak, normal basınç altında ters faz silika jeli ile flaş kromatografisi ile artıkları arındırın. İstenilen azo ürünlerini vermek için ürün çözeltisini lyophilization ile kurulayın.
NOT: Aynı reaksiyon seyreltilmiş HCl çözeltilerinde de (0,2 M) yapılabilir.
2. UV-Vis Ölçümleri ve Teorik Hesaplama
- Saf azo (50 μM) distile suda veya sırasıyla %5 H3PO4 çözeltisinde (pH 1.1) çözün. Oda sıcaklığında (25 °C) bir spektrofotometrede UV-vis emilim spektrumlarını (250-700 nm) kaydedin. Daha fazla analiz için verileri .xls/.xlsx dosyaları olarak dışa aktarın.
-
Gaussian 16 programını kullanarak PMQ kendisi ve azo ürünleri için tüm teorik hesaplamaları gerçekleştirin. 6-31G temel ilerli kalarak zamana bağımlı yoğunluk fonksiyonel teorisini (TD-DFT) kullanın. Su kullanarak polarize continuum modeli (PCM) formalizmi ile çözücü etkileri içerir.
- Yapıları çizmek ve sonra yapıyı Gaussian giriş dosyası (.gif) olarak kaydetmek için yazılımı (örn. Chemdraw Office) kullanın.
- Gauss View ile gif dosyasını açın ve Hesapladüğmesine tıklayın. Gaussian Hesaplama Kurulumu, Opt+Freqve zemin durumu-DFT-B3LYP-6-31G'yiseçin; sonra Gönder'itıklatın. Geometri optimizasyonu bir .log dosyası oluşturur.
- Yukarıdaki yordamı izleyerek, bu günlük dosyasını açmak için Gauss View'ı kullanın. Hesapla-Gaussian Hesaplama Kurulumu'na tıklayın ve yalnızca enerji ve TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet'ıseçin. Sonra Gönder. Enerji hesaplaması başka bir günlük dosyası ve bir küp dosyası oluşturur.
- Enerji hesaplamasından günlük dosyasını açmak için Gauss Görünümü'ni kullanın. Öngörülen emilimi görmek için Sonuçlar-UV/Vis'i tıklatın.
- Küp dosyasını açmak için Gauss Görünümü'ni kullanın. Yörüngelerigörmek için Sonuç'u tıklatın ve yüzey ve kontur-yüzey hareketlerini ve yeni yüzeyi seçin.
-
Hem deneysel ölçüm hem de Gaussian hesaplamasonuçlarını karşılaştırın. Aşağıdaki denkleme göre hesaplanan ve ölçülen değerler arasındaki yüzde hatasını hesaplayın.
Hata = | (Wmax cal.-Wmaxexper.) / Wmaxexper. | × %100
Wmax cal. teorik hesaplama ve Wmax exper maksimum emici dalga boyu temsil eder. deneysel sonuç dalga boyunu temsil eder.
3. PMQ Tayini
- 96 kuyulu bir plaka kullanılarak PMQ ölçümü (Şekil 5)
- 200 mM aniline çözeltisi, R1 için 0,2 M HCl içinde 4-methoxyaniline çözünür. 5 mM çözelti, R2 elde etmek için distile suda sodyum nitrit çözünür. Kullanmadan önce tüm çözümleri buzdolabında 4 °C'de saklayın.
- 96 kuyulu bir tabağa 100 μL R1 ekleyin ve R1 ile karıştırmak için plakaya numune içeren 50 μL PMQ ekleyin. Ardından, plakaya 50°L R2 ekleyin. Tekrarlanan pipetleme ile çözeltileri karıştırın.
- Tabağı oda sıcaklığında 15 dakika bekletin ve ardından UV-vis emicisini 504 nm olarak kaydedin. Her test için 3x'i tekrarlayın. Azo ürün oda ışık maruziyeti ile istikrarlı; plakayı karanlık altında tutmak gerekli değildir.
- Daha fazla analiz için verileri .xls/.xlsx dosyaları olarak dışa aktarın.
- İdrar örneğinde doğrudan PMQ ölçümü için kalibrasyon eğrisi
- Sırasıyla 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM'de sentetik idrar kullanarak PMQ çözeltileri hazırlayın.
- 96 kuyulu bir tabağa 100 μL R1 ekleyin ve R1 ile karıştırmak için 50 μL PMQ idrar çözeltisi ekleyin. Daha sonra yukarıdaki karışıma 50 μL R2 ekleyin. Tekrarlanan pipetleme ile çözeltileri karıştırın. Tabağı oda sıcaklığında 15 dakika bekletin ve ardından UV-vis emicisini 504 nm olarak kaydedin.
- EmiciI504 ve PMQ konsantrasyonlarına göre bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. PMQ'suz kuyulardan gelen değerleri boş olarak kullanın ve veri işlemeden önce tüm testlerdeki boş değerleri çıkarın.
- Y = aX+bolarak doğrusal denklemler oluşturmak için doğrusal bir uyum gerçekleştirin, Y 504 nm de absorbans yoğunluğu, X PMQ konsantrasyonu, a eğim, ve b doğrusal çizginin y-kesme olduğunu.
- İnsan serum örneğinde doğrudan PMQ ölçümü için kalibrasyon eğrisi
- 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM'de INSAN serumu kullanarak PMQ çözeltileri hazırlayın.
- 96 kuyulu bir tabağa 100 μL R1 ekleyin ve R1 ile karıştırmak için 50 μL PMQ serum çözeltisi ekleyin. Yukarıdaki karışıma 50 μL R2 ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile çözeltileri karıştırın. Tabağı 15 dakika oda sıcaklığında tutun ve uv-vis emicisini 504 nm'de kaydedin. Daha fazla analiz için verileri .xls/.xlsx dosyası olarak dışa aktarın.
- EmiciI504 ve PMQ konsantrasyonlarına göre bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. PMQ'suz kuyulardan gelen değerleri boş olarak kullanın ve veri işlemeden önce tüm testlerdeki boş değerleri çıkarın.
- Y = aX+bolarak doğrusal denklemler oluşturmak için doğrusal bir uyum gerçekleştirin, Y 504 nm de absorbans yoğunluğu, X PMQ konsantrasyonu, a eğim, ve b doğrusal çizginin y-kesme olduğunu.
- Serumdan PMQ ekstraksiyonu
- PMQ içeren serumu simüle etmek için insan serumuna belirli bir miktar PMQ ekleyin. PMQ ekstraksiyonu için, 15 mL'lik bir santrifüj tüpe 2 mL PMQ içeren seruma 6 mL etil asetat/heksan (7:1 v/v) karışımı ekleyin.
- Ekstraksiyon sistemine 100 μL sodyum hidroksit (2 M) çözeltisi ekleyin. Şiddetle 30 s. organik tabaka toplamak ve vakum altında bir döner buharlaştırıcı kullanarak konsantre bir girdap karıştırıcı kullanarak tüp sallamak.
- 200 μL distile su ile kalıntıyı yeniden çözün ve 220 nm gözenek boyutunda disk şeklindeki bir membrandan sızarak çözünmez lipid bileşenlerini çıkarın. Test için son çözümü kullanın.
- Ekstraksiyon ile serumdan PMQ'yu belirleyin
- Distile suda PMQ için kalibrasyon eğrisi oluşturmak için 3.2 veya 3.3 adımlarını izleyin. Adım 3.4'e göre PMQ içeren serumlardan PMQ ayıklayın.
- 96 kuyulu bir tabağa 100 μL R1 ve 50 μL PMQ çözeltisi ekleyin. Karışıma 50 μL R2 ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile çözeltileri karıştırın.
- Tabağı 15 dakika oda sıcaklığında tutun ve UV-vis emicisini 504 nm'de kaydedin. Kontrol olarak PMQ olmadan R1 ve R2 ile kuyukullanın. Daha fazla analiz için verileri .xls/.xlsx dosyaları olarak dışa aktarın.
- Her test için I504 emici değerlerinden kontrol değerlerini çıkarın ve ardından kalibrasyon eğrisinden astar denklemine göre konsantrasyon hesaplamaları için sonucu kullanın.
NOT: Her durumda PMQ için algılama sınırı (LOD) standart biryöntem22göre hesaplanabilir. Hesaplama kalibrasyon fonksiyonuna dayanıyordu: LOD = 3.3 × SD/b, SD boş standart sapma ve b regresyon hattının eğimi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tepkime koşullarını optimize etmek için(Şekil 2),Griess reaksiyonu ile PMQ ile çift için çeşitli anilinler kullanıldı. Farklı renklerde bir dizi azos elde ettik. Bu bir elektron bağış ikame ile anisiline UV-vis emilim spektrumunda bir kırmızı kayma neden olabilir bulunmuştur. Kuramsal hesaplamalar zamana bağımlı yoğunluk fonksiyonel teorisi (TD-DFT) ile yapılmıştır. Şekil 2A'dasunulduğu gibi, hesaplama sonucu ortalama %3,1 hata ile optik ölçümlerle iyi bir uyum içinde ydi. 4-methoxyaniline sonra tepki hızı, ürün çözünürlüğü ve istikrar21iyi performans nedeniyle PMQ algılama reaksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Ayrıca, 4-methoxyaniline gelen azo ürün çıplak gözlerle ayırt etmek kolaydır renk, kırmızıdır. Bu nedenle, bu reaksiyon çıplak göz PMQ algılama potansiyeli sunar (Şekil 3).
Şekil 4A, azo ürün 3d'nin UV-vis emilim spektrumu üzerindeki pH etkisini göstermektedir. PH'ı1.0'dan 6.0'a yükselterken I504 değişmez. I504 pH 7.0 altında hafif bir azalma sergiler, temel pH (8.0 ve 9.0) büyük ölçüde emilimini etkiler. Şekil 4B, PMQ çözeltilerinin Griess reaksiyonu üzerindeki pH etkilerini göstermektedir. Çeşitli pH'lar (4.0, 5.0 ,6.0, 7.0, 8.0, 9.0) ile PBS arabelleğindeki PMQ (50 μM) bölüm 3.1'de açıklandığı gibi test reaktifi ile ayrı ayrı karıştırıldı. I504 sonra oda sıcaklığında 15 dakika sonra ölçüldü. Belirtildiği gibi, PMQ çözümlerinin temel pH'ları (8.0, 9.0) reaksiyonu potansiyel olarak etkiler. Şekil 5 PMQ algılama için Griess reaksiyonu gerçekleştirmek için genel prosedürü gösterir. Protokol bölümünde açıklandığı gibi, analiz için I504 emilimi verilerini elde etmek için dört adım gereklidir. Şekil 6A ve 6B, idrar ve serum örneklerinden pmq'nin doğrudan saptanması için kalibrasyon eğrilerini, numune ön tedavileri olmaksızın gösterir. Sentetik idrarda PMQ 0 ile 200 μM arasında değiştiğinde mükemmel bir doğrusal ilişki (R2 = 0.998) bulunmuştur. Serum numunesi döneminde konsantrasyonda 10 ila 200 μM arasında değişen doğrusal bir ilişki saptandı.
Şekil 7A serum PMQ ayıklamak için prosedürü gösterir. Kalıntılar, ekstraksiyon ve konsantrasyondan sonra distile suda yeniden çözündü ve sonra filtrasyonu yapıldı. Gerçek bir PMQ içeren serumu simüle etmek için, PMQ insan serumuna 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 μM son konsantrasyonları ile eklenmiştir. Serumlarda 3.4 ve 3.5 adımlarını kullanarak PMQ konsantrasyonlarının sırasıyla 0.02, 0.14, 0.44, 0.90 ve 1.78 μM olduğu saptandı (Şekil 7C). Sonuca göre, PMQ kurtarma yüzdesi önceki raporlar9ile karşılaştırılabilir serum, 0,5 μM üzerinde iken PMQ kurtarma yüzdesi yaklaşık% 90 olduğu bulunmuştur.
Şekil 1: PMQ griess reaksiyon şeması. (A) Nitrit analizi için klasik griess reaksiyonu. (B) Önerilen PMQ algılama yönteminde Griess reaksiyonu. Bu rakam önceki çalışma21izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sentetik azosun fotofizik özellikleri. (A) UV-vis ölçümü ve farklı anenofinlerden üretilen azos maksimum emilimi teorik hesaplama. Ayraçların dışındaki sayılar, nötr pH koşullarına yakın distile H2O'da maksimum emici ölçüm için temsil edilir; parantezdeki sayılar %5 H3PO4 çözeltisindeki (pH 』 1.1) ölçüme başvurur. λabs/nm exper. deney verilerini temsil eder ve λabs/calc. teorik hesaplama verilerini temsil eder. Eexc uyarma enerjisi (eV) ve f osilatör gücüdür. (B) PMQ ve farklı ikameler ile azo ürünlerinin fotoğraf görüntüleri, 50 μM% 5 fosforik asit çözeltisi. (C) Sentetik ürünlerin UV-vis spektrumları. Değerler 0 ile 1 arasında bir aralıkta normalleştirildi. Bu rakam önceki çalışma21izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PMQ'nun kolorimetrik tayini. (A) Emicilik değişikliklerinin zamana bağlı bir şekilde maksimum I504'te izlenmesi. Reaksiyon 4-methoxyaniline kullanılarak yapıldı ve PMQ 100 μM'de kullanıldı; (B) PMQ'nun farklı konsantrasyonlarında reaksiyonun renk değişimleri: 400 μL 4-methoxyaniline çözeltisi (0,2 M HCl'de 200 mM) ve suda 200 μL sodyum nitrit (5 mM), farklı konsantrasyonlarda 200 μL PMQ çözeltisi (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PMQ algılamada pH etkisi. (A) azo ürün 3d (50 μM) UV-vis absorbansı üzerinde pH etkileri; (B) PMQ (50 μM) PBS tampon farklı pHs (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) adım 3.1 açıklandığı gibi reaksiyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. On beş dakika sonra, 504 nm de absorbans ölçüldü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 96 kuyulu plaka tabanlı sistemde Griess reaksiyonu ile PMQ tayini. R1, 0,2 M HCl'de 200 mM 4-methoxyaniline çözeltisi anlamına gelir; R2 distile suda 5 mM sodyum nitrit anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (A) sentetik idrar ve (B) insan serum örneklerinden PMQ tayini için kalibrasyon eğrileri. PMQ konsantrasyonu 0-200 μM arasında değişmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Serum örneklerinden PMQ tayini. (A) Kantitatif analiz için serum örneklerinden PMQ ekstraksiyonunun şematik illüstrasyonu. (B) 0ile 100 μM aralığında I504 ve PMQ konsantrasyonu arasında bulunan doğrusal ilişki. (C) Serumdaki PMQ, Griess reaksiyon tabanlı yöntemle seruma eklenen tam miktarla karşılaştırıldığında ölçüldü. Bu rakam önceki çalışma21izni ile değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1. Günlük D'nin teorik hesaplanması ve PMQ ve CPMQ'nin su dağıtım yüzdesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun PMQ ölçümü için kolorimetrik bir yöntem tanımladık. Potansiyel olarak en basit ve uygun maliyetli akım yöntemidir. Daha da önemlisi, bu yöntem herhangi bir ekipman kullanmadan çıplak gözle respq ölçümü sağlar.
PMQ algılama için optimize edilmiş Griess reaksiyonu 504 nm maksimum emilimi ile kırmızı renk azo üretebilir. Endojen biyomoleküllerin UV-vis emiliminin potansiyel etkisi sınırlıdır, böylece biyolojik sıvılarda PMQ'nun doğrudan ölçümü için söz veren yöntem dir. Sonuç olarak,0-200 μM konsantrasyon aralığında idrar PMQ tespiti için mükemmel bir doğrusal ilişki (R 2 = 0.998) bulundu(Şekil 6A). PMQ için algılama sınırı (LOD) 0.63 μM olarak bulundu. Bu yöntem aynı zamanda insan serumpmq doğrudan ölçümü için büyük potansiyelleri göstermiştir. Serum PMQ tespiti için konsantrasyonda 10 ila 200 μM arasında değişen mükemmel bir doğrusal ilişki saptandı(Şekil 6B). Serum örneğini ekstraksiyon ve konsantrasyon yoluyla ön tedavi ederek hassasiyeti daha da artırabiliriz. Şekil 7'nin basit bir ekstraksiyon işlemiile gösterdiği gibi, bu yöntem serum PMQ'u klinik olarak ilgili aralıklarda ölçebilir. Reaksiyon mekanizmasına dayanarak, PMQ ana karboksil metaboliti (CPMQ) potansiyel benzer UV-Vis özelliklere sahip bir azo ürün oluşturabilirsiniz. Ancak, temel pH koşulları altında sıvı-sıvı ekstraksiyon potansiyel CPMQ girişim en aza indirebilirsiniz. Tablo 1, hem PMQ hem de CPMQ'nin hesaplanan günlük D'sini ve su dağılımını gösterir. Görüldüğü gibi, pH >10'da PMQ'nun %6,33'ünden azı su fazında bulunurken, CPMQ'nun %98,54'ünden fazlası su fazında olacaktır. Bu nedenle, teorik olarak, PMQ'nun %93,7'sinden fazlası ve CPMQ'nun %1,56'dan azı test için çıkarılabilir. Bu ana metabolit CPMQ gelen girişim sınırlı olduğu sonucuna varılabilir.
PMQ algılama prosedürü çok işlenir kolaydır. Örnek olarak 96 kuyulu plaka tabanlı sistemi ele almak, tüm prosedür dört adımdan oluşur: 1) 4-methoxyaniline çözeltisi (0,2 M HCl 200 mM) R1 100 μL ekleyerek 96-iyi plaka içine; 2) R1 ile karıştırmak için PMQ konsantrasyonu bilinmeyen örnek 50 μL ekleme; 3) oda sıcaklığında reaksiyon gerçekleştirmek için 50 μL R2 (5 mM sodyum nitrit çözeltisi) ekleyerek; ve 4) bir spektrometre kullanarak 504 nm UV-vis emilimini kayıt. Bilinmeyen bir örnekten PMQ konsantrasyonu emilim yoğunluğu I504 ve kalibrasyon eğrisi nden doğrusal denklemi dayalı hesaplanabilir. Tüm işlem kuluçkaya gerek kalmadan oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Renkli ürün oda ışığına duyarlı olmadığı için tüm prosedür için karanlık bir ortam gerekli değildir.
Reaksiyon çözeltisinin doymuş I504'e ulaşma zamanının ısıya bağlı olduğu unutulmamalıdır. Şekil 3'tegösterildiği gibi, oda sıcaklığında (25 °C) en az 12 dakika gereklidir. Reaksiyon 25 °C'nin altındaki sıcaklıklarda ise reaksiyon süresi daha uzun olacaktır. PMQ çözeltilerinin temel pH durumu I504emiciliğini potansiyel olarak etkileyebilir. Bu sorunu gidermek için PMQ çözümünün pH'ını 7.0'dan az olarak ayarlayın. Aksi takdirde, pH 7.0 üzerinde olan çözüm için yeni bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Buna ek olarak, test edilen numunelerde içsel nitritler tespiti etkileyebilir. Ancak, bu durum sadece standart bir testte yüksek nitrit konsantrasyonu (5 mM) kullanıldığından, içsel nitrit konsantrasyonu son derece yüksek olduğunda ortaya çıkabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Çin Tıbbı Guangzhou Üniversitesi'nden Start-Up Hibe ve GZUCM gençlik bilimsel araştırma eğitim projesi (2019QNPY06) kabul. Ayrıca tesisleri desteklemek için Guangzhou Çin Tıbbı Üniversitesi Lingnan Tıbbi Araştırma Merkezi kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
- Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
- Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67 (11), 1670-1676 (2018).
- Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
- McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27 (20), 4597-4600 (2017).
- Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13 (1), 418 (2014).
- Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
- Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111 (1), 16-24 (2008).
- Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579 (1), 123-129 (1992).
- Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675 (1), 93-98 (1996).
- Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
- Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20 (5), 281-286 (1996).
- Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
- Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851 (1), 51-70 (2007).
- Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50 (58), 7813-7816 (2014).
- Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
- Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
- Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
- Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54 (24), 2978-2981 (2018).
- Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56 (9), 1162-1165 (2015).
- Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9 (38), 14627-14634 (2017).
- Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
- Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2 (1), 21-25 (2011).
