Summary
यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए वैकल्पिक नैदानिक परीक्षण के रूप में रेबीज वायरस एंटीजन का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
रेबीज के लिए प्राथमिक नैदानिक तौर-तरीकों में से एक संक्रमित ऊतक नमूनों में वायरल राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर (एंटीजन) का पता लगाना है। जबकि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण या प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी) का उपयोग आमतौर पर एंटीजन डिटेक्शन के लिए किया जाता है, दोनों परीक्षणों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीजन डिटेक्शन से पहले स्लाइड पर इंप्रेशन के लिए ताजा और/या जमे हुए ऊतकों की आवश्यकता होती है । यदि नमूनों को एकत्र किया जाता है और फॉर्मेलिन में तय किया जाता है, तो एंटीजन डिटेक्शन के लिए न तो परीक्षण इष्टतम होता है, हालांकि, पैराफिन ब्लॉक और सेक्शनिंग में एम्बेड करने के बाद पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। इस आईएचसी विधि के साथ, ऊतकों को एंटी-रेबीज एंटीबॉडी से सना हुआ होता है, वर्गों को डिपैराफिनाइज्ड किया जाता है, आंशिक प्रोटेओलिसिस या अन्य तरीकों से एंटीजन प्राप्त किया जाता है, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड होता है। एंटीजन सहिजन पेरोक्सिडास/अमीनो एथिल कार्बाजोल का उपयोग करके दाग रहे हैं और हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दृश्य के लिए हेमेटॉक्सीलिन के साथ जवाबी दाग रहे हैं। विशिष्ट एंटीजन डिटेक्शन के अलावा, फॉर्मेलिन निर्धारण हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के निर्धारण, नमूना भंडारण और परिवहन (परिवेश के तापमान के तहत), पूर्वव्यापी मामलों का परीक्षण करने की क्षमता और संक्रामक एजेंटों की निष्क्रियता के माध्यम से बेहतर जैविक सुरक्षा जैसे अन्य फायदे प्रदान करता है।
Introduction
रेबीज एक तीव्र प्रगतिशील इंसेफेलाइटिस है जो1जीनस से संबंधित नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के कारण होता है । रेबीज वायरस (RABV), जीनस के प्रकार के सदस्य के साथ संक्रमण की वजह से सभी मानव मौतों का लगभग ९९%, कुत्तों द्वारा प्रेषित किया जाता है2। संदिग्ध जानवरों का रेबीज निदान मस्तिष्क केऊतकोंमें जीनोमिक आरएनए (राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स, आरएनपी) के साथ जटिल में एंटीजन (मुख्य रूप से वायरल एन्कोडेड न्यूक्लियोप्रोटीन, एन प्रोटीन) का पता लगाने पर निर्भर करता है। डायरेक्ट फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण द्वारा एंटीजन डिटेक्शन को रेबीज निदान 4 के लिए स्वर्ण मानक मानाजाताहै। विधि ताजा या ताजा जमे हुए मस्तिष्क सामग्री का उपयोग करती है, एक स्लाइड पर एक स्पर्श छाप, एसीटोन में निर्धारण, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट आइसोथियोसायनेट (फिटसी) लेबल मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी/पीएब्स) लेबल का उपयोग करते हैं और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी5द्वारा पढ़ते हैं। डीएफए परीक्षण ताजा मस्तिष्क ऊतक में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट है। हाल ही में, एक प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी), संशोधित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) तकनीक, डीएफए के प्रति इसीतरहकी संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शित की गई थी, लेकिन दृश्य 6 के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का लाभ प्रदान करती है। जबकि डीआरआईटी में उपयोग की जाने वाली डिटेक्शन विधि आईएचसी के समान है, प्रारंभिक चरण औपचारिक रूप से निर्धारण के बाद नमूने के स्पर्श इंप्रेशन उत्पन्न करने के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों का उपयोग करता है।
आईएचसी पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों में विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों और प्रोटीन का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। आईएचसी ऊतक अनुभाग 7 में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए एकस्थापितवैकल्पिक परीक्षण है। आईएचसी का उपयोग विशेष रूप से पूर्वव्यापी मामलों के निदान के लिए किया गया है, जिन्होंने रेबीज8के बोझ को निर्धारित करने के लिए न्यूरोलॉजिकल रोगों का प्रदर्शन किया । पैराफिन-एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक कई वर्षों के बाद भी पता लगाने के लिए प्रोटीन को संरक्षित करते हैं जब परिवेश तापमान 9 पर संग्रहीतहोताहै। फॉर्मेलिन उपचार अमीनो एसिड साइड चेन को क्रॉस-लिंकिंग और फेरबदल करके प्रोटीन को संशोधित करता है, जो एपिटोप्स को एंटीबॉडी10के खिलाफ अब प्रतिक्रियाशील नहीं बना सकता है। जबकि रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए आईएचसी परीक्षण में या तो एमएबी या पीएएस शामिल है, बाद में कई एपिटोप और अलग-अलग lyssaviruses का पता लगाया जा सकता है11के रूप में लाभप्रद है।
आईएचसी में शामिल मानक कदम ऊतकों के औपचारिक निर्धारण, पैराफिन ब्लॉकों में एम्बेडिंग, ऊतकों की धारा, डिपैराफिनाइजेशन और हाइड्रेशन, एपिटोप रिकवरी, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रतिक्रियाशीलता, और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स का उपयोग करके विकास हैं। यह पांडुलिपि रेबीज निदान के लिए प्रोटोकॉल के विस्तृत विवरण का वर्णन करती है। रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए, अमेरिका के रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) अटलांटा, जॉर्जिया में उत्पन्न राब वी (पीएब्स) के साथ प्रतिरक्षित माउस सीरम का उपयोग बायोटिनेलेटेड एंटी-माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन में किया जाता है। बायोटिनेलेटेड एब्स का पता स्ट्रेप्टाविडिन-सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) कॉम्प्लेक्स के अलावा पता लगाया जाता है जिसके बाद अमीनो-एथिलकारबाजोल सब्सट्रेट के साथ रंग विकास होता है।
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Protocol
जबकि आईएचसी प्रोटोकॉल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों पर किया गया था, जो यदि मौजूद है तो आरएबीवी को निष्क्रिय करता है, उचित जैवसेफ्टी प्रोटोकॉल का उचित पालन किया जाना चाहिए। सभी जैव सुरक्षा प्रक्रियाओं को माइक्रोबायोलॉजिकल और बायोमेडिकल प्रयोगशालाओं (बीएमबीएल) 5वें संस्करण (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) में जैव सुरक्षा में वर्णित किया गया है, जिसमें उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनना और टीकाकरण की आवश्यकता12वर्णित है। इसके अलावा, खतरनाक रसायनों (जैसे फॉर्मेलिन, एईसी और जाइलीन) की उचित रोकथाम और हैंडलिंग का पालन किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, धुएं हुड)।
1. ऊतकों का फॉर्मेलिन निर्धारण
- 24-72 घंटे के लिए नेक्रॉप्सी13 के बाद एकत्र 3-5 मिमी मस्तिष्क ऊतकों को 10% फॉस्फेट बफर फॉर्मेलिन समाधान (1:20 से 1:50 ऊतक/फॉर्मेलिन अनुपात) में रखें।
सावधानी: फॉर्मेलिन एक विषाक्त सुधारक है। - अनुमानित ऊतक वजन (आकार), ऊतक प्रकार (मस्तिष्क क्षेत्रों) और फॉर्मेलिन की मात्रा रिकॉर्ड करें। प्रयोगशालाओं के लिए यह महत्वपूर्ण है कि वे निर्धारण के समय रिकॉर्ड को दस्तावेज और बनाए रखें ।
- फॉर्मेलिन निर्धारण के बाद और प्रसंस्करण से पहले लंबे समय तक ऊतक भंडारण के लिए, ऊतक को 70% इथेनॉल में रखें।
2. ऊतक प्रसंस्करण
- नमूना निर्धारण के बाद, ऊतक को काटना महत्वपूर्ण मस्तिष्क क्षेत्रों जैसे, ब्रेनस्टेम के क्रॉस सेक्शन, सेरिबैलम (3 लोब्स), या हिप्पोकैम्पस (दोनों हिप्पोकैम्पी) प्रत्येक कट 3 से 5 मिमी मोटी और प्रसंस्करण कैसेट में रखा जाता है।
- पैराफिन वैक्स घुसपैठ के लिए ऊतक कैसेट को संसाधित करें, पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड और एक माइक्रोटॉम पर सेक्शन (3 से 6 माइक्रोन)।
3. सामग्री की तैयारी/
- चित्र 1 में दर्शाए गए धुंधला पकवान14 (सामग्रियों की तालिका) स्थापितकरें । समाधान के 250 एमएल के साथ प्रत्येक पकवान भरें।
- 3-अमीनो-9-एथिलकार्बिओल (एईसी) सब्सट्रेट स्टॉक समाधान की तैयारी
- एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके एन, एन, डाइमेथाइलफार्मेमाइड के 5 एमएल में 3-अमीनो 9-एथिलकारबाजोल (एईसी) की एक 20 मिलीग्राम गोली को भंग करें।
सावधानी: एईसी एक कैंसरकारक है।
- एक ग्लास पिपेट का उपयोग करके एन, एन, डाइमेथाइलफार्मेमाइड के 5 एमएल में 3-अमीनो 9-एथिलकारबाजोल (एईसी) की एक 20 मिलीग्राम गोली को भंग करें।
- एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए प्रोटीज (जैसे, प्रोनेस) स्टॉक समाधान की तैयारी
- पीबीएस के 200 मिलीलन में 7 मिलीग्राम प्रोटीज को घोलें।
- कुल्ला बफर पीबीएस-टी की तैयारी
- पीबीएस के ट्वीन 80 से 990 एमएल के 10 एमएल जोड़ें। एक समरूप समाधान बनाने के लिए इसे अच्छी तरह से मिलाएं।
4. डिपैराफिनाइजेशन और टिश्यू रिहाइड्रेशन
- माइक्रोटॉम का उपयोग करके 5 माइक्रोन पैराफिन सेक्शन बनाएं, इसे 38 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान पर फ्लोट करें और ग्लास स्लाइड पर इकट्ठा करें। एक अभिवाक प्रतिरोधी कलम/मार्कर के साथ स्लाइड लेबल ।
- स्लाइड्स को एक ट्रे पर रखें और 1 घंटे के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस ओवन में पिघल जाएं । तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न उठाएं क्योंकि यह वायरल एंटीजन को नष्ट कर सकता है।
- ओवन से स्लाइड निकालें और तुरंत 1, 2 और 3 व्यंजनों में 5 मिनट के लगातार 3 जाइलीन कुल्ला में deparaffinize ।
- इथेनॉल के कमजोर पड़ने को कम करने में अनुक्रमिक विसर्जन द्वारा स्लाइड पर वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें पानी को कम करें: (4 से 11 एक डुबकी कुल्ला है) पकवान 4: जाइलीन/100% इथेनॉल (1:1); डिश 5: 100% इथेनॉल; डिश 6: 100% इथेनॉल; डिश 7: 95% इथेनॉल; डिश 8: 95% इथेनॉल; डिश 9: 80% इथेनॉल; डिश 10: 70% इथेनॉल; डिश 11: डिसोनाइज्ड वॉटर(चित्रा 1. डिश सेट-अप)।
सावधानी: जाइलीन एक खतरनाक रसायन है और काम एक धुएं हुड में आयोजित किया जाना चाहिए।
5. प्रोटियोलिटिक एंटीजन रिट्रीवल
- डिश 12 में प्रोटियोलिटिक एंटीजन रिट्रीवल के लिए 30 मिनट के लिए प्रोटीज (पीबीएस के 2.5 μg/mL) के साथ स्लाइड का इलाज करें।
- फिर 10 मिनट (डिश 13) के लिए पीबीएस-टी में कुल्ला।
- 10 मिनट (डिश 14) के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज करें।
- फिर, 10 मिनट (डिश 15) के लिए पीबीएस-टी के साथ धोएं।
6. धुंधला प्रक्रिया
- एक समय में स्लाइड्स संभाल बफर में डूबे शेष स्लाइड रखते हुए (पूरे स्लाइड धारक को हटाएं नहीं - स्लाइड गीला रखें)। एक स्लाइड निकालें और ऊतक अनुभाग के आसपास से अतिरिक्त बफर (एक कागज तौलिया का उपयोग कर) बंद दाग ऊतक अनुभाग को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है । एक आर्द्रता कक्ष में इनक्यूबेट स्लाइड, गीला कागज तौलिए रखकर बनाया, प्रयोगशाला बेंच शीर्ष14 पर कमरे के तापमान पर सामांय बकरी सीरम (अवरुद्ध) के साथ 15 मिनट के लिए ।
- इष्टतम पूर्व निर्धारित कमजोर पड़ने के साथ इनक्यूबेट प्राथमिक एंटी-रेबीज एंटीबॉडी (माउस एंटी-रेबीज सीरम, अप्रकाशित) (सकारात्मक नियंत्रण) और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर ऊपर (चरण 6.1.) के साथ 60 मिनट के लिए बीच में कोई वॉश के साथ।
- 60 मिनट के बाद, 10 मिनट (डिश 16) के लिए पीबीएस-टी के साथ धोएं।
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी (विशिष्ट प्रजातियों) के साथ इनक्यूबेट (चरण 6.1 के रूप में समान हैंडलिंग)।
- 10 मिनट (डिश 16) के लिए पीबीएस-टी के साथ धोएं।
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी परिसर के साथ इनक्यूबेट (6.1 के रूप में ही हैंडलिंग)।
- 10 मिनट (डिश 16) के लिए पीबीएस-टी के साथ धोएं।
- पेरोक्सिडास सब्सट्रेट, अमीनो-एथिलकारबाजोल (एईसी) के साथ इनक्यूबेट, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आर्द्रता कक्ष में। उपयोग करने से ठीक पहले एईसी बनाएं। ऐसा करने के लिए, 0.1 M एसीटेट बफर, पीएच 5.2 के 14 एमएल में एईसी स्टॉक समाधान का 1 एमएल जोड़ें। 3% एच 2 ओ2के 0.15 एमएल जोड़ें। उपयोग से ठीक पहले मिश्रण को फ़िल्टर करें (0.45 माइक्रोन फ़िल्टर)।
नोट: एईसी का कार्य समाधान केवल 2-3 घंटे के लिए स्थिर है। एईसी स्टॉक सॉल्यूशन को लंबी अवधि के लिए फ्रिज में स्टोर किया जा सकता है। - डिएकाइज्ड वॉटर में धोएं 10 मिनट (डिश 17)
- गिल के हेमटॉक्सीलिन के साथ जवाबी दाग 1:2 2 मिनट (डिश 18) के लिए deionized पानी के साथ पतला ।
- डिओनाइज्ड वॉटर डिप कुल्ला (डिश 19 और 20) के साथ अतिरिक्त हेमटॉक्सीलिन को कुल्ला करना।
- स्कॉट नल का पानी 30 एस (ब्लूइंग समाधान) पकवान 21 में कुल्ला ।
- डिएकाइज्ड वॉटर में धोएं 10 मिनट (डिश 22)
- एक समय में स्लाइड एक निकालें-पानी में घुलनशील बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
- आगे की स्लाइड्स में पढ़िए हल्के माइक्रोस्कोप से।
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Representative Results
चित्रा 2 विभिन्न मस्तिष्क ऊतकों परीक्षण में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के प्रतिनिधि आईएचसी धुंधला परिणाम दर्शाता है। चित्रा 2ए, डी, जी 200x में सकारात्मक नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि चित्रा 2बी, ई, एच क्रमशः 400x आवर्धन के अनुरूप है। चित्रा 2ए-सी ब्रेनस्टेम के अनुरूप है; चित्रा 2डी-एफ सेरिबैलम और पुरकिंजे कोशिकाओं के अनुरूप है; और चित्रा 2जी-मैं हिप्पोकैम्पस के अनुरूप है। चित्रा 2सी, एफ, मैं नकारात्मक नियंत्रण नमूने हैं। मैजेंटा लाल धुंधला रेबीज एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी की प्रतिक्रियाशीलता के कारण नीले पृष्ठभूमि (हेमटॉक्सीलिन काउंटरस्टैन) में एईसी सब्सट्रेट का उपयोग करके रंग विकास को दर्शाता है। एईसी एक पेरोक्सिडास सब्सट्रेट है, जो ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया पर, एचआरपी द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे पानी अघुलनशील उत्प्रंत नमूदार होता है।
आईएचसी में एक सकारात्मक परिणाम ऊतक वर्गों में मैजेंटा लाल धुंधला से मेल खाती है। साइटोप्लाज्मिक समावेशन और अलग-अलग आकार के दानेदार समावेशन का धुंधला हिस्सा आरएबीवी संक्रमणों के लिए सकारात्मक नमूनों का संकेत है। नमूनों को नकारात्मक माना जाता है यदि कोई विशिष्ट लाल धुंधला या केवल हेमटॉक्सीलिन के कारण नीली पृष्ठभूमि देखी गई थी। सकारात्मक धुंधला करने के अलावा, समावेशन के वितरण के नमूने में रेबीज एंटीजन के स्तर का अप्रत्यक्ष मात्राकरण प्रदान कर सकता है, जो ऊतक नमूनों के वायरल लोड के अनुरूप हो सकता है । वितरण के स्तर के बावजूद, किसी भी विशिष्ट धुंधला आरएबीवी एंटीजन डिटेक्शन के लिए सकारात्मक के रूप में नमूना वर्गीकृत करेगा।
चित्रा 1: आईएचसी परीक्षण के लिए विभिन्न चरणों का संकेत देने वाला फ्लो चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: सकारात्मक और नकारात्मक रेबीज मस्तिष्क ऊतक के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। (A)इंट्रासाइटोप्लाज्मिक वायरल समावेशन और रेबीज वायरस एंटीजन डिटेक्शन में ब्रेनस्टेम 200x कुल आवर्धन; (ख)सकारात्मक ब्रेनस्टेम 400x; (ग)ब्रेनस्टेम निगेटिव कंट्रोल 200x; (घ)रेबीज वायरस सेरिबैलम 200x के भीतर समावेशन; (ई)सेरिबैलम और पुरकिंजे कोशिकाएं 400x; (एफ)सेरिबैलम निगेटिव कंट्रोल; (जी)हिप्पोकैम्पस 200x के भीतर वायरल समावेशन; (ज)हिप्पोकैम्पस 400x; हिप्पोकैम्पस नकारात्मक नियंत्रण 200x। लाल दाग स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स स्टेनिंग विधि (एईसी सब्सट्रेट) का उपयोग करके रेबीज वायरस एंटीजन की उपस्थिति को इंगित करता है। हेमटॉक्सीलिन काउंटरदाग (नीला)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
लक्षण शुरुआत के बाद रेबीज की उच्च मृत्यु दर के कारण, राबव संक्रमण के लिए संदिग्ध जानवरों का निदान एक उपयुक्त पोस्ट-एक्सपोजर रोगनिरोधी उपचार के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। रेबीज निदान मुख्य रूप से ताजा या जमे हुए ऊतकों का उपयोग करके डीएफए, डीआरआईटी और पीसीआर आधारित तकनीकों पर निर्भर करता है। फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के परीक्षण के लिए, आईएचसी परीक्षण राबवि एंटीजन के संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने के लिए एक वैकल्पिक विधि प्रदान करता है। जबकि फॉर्मेलिन में तय ऊतकों में क्रॉस-लिंकिंग जैसी साइड चेन के संशोधन के कारण प्रोटीन स्थिर होता है, लेकिन एंटीजन डिटेक्शन से पहले नमूनों को संसाधित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, एफएनपी परिसर में प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन को सक्षम करने के लिए प्रोटीज (जैसे, प्रोनेस) द्वारा आंशिक प्रोटियोलिटिक पाचन के माध्यम से एपिटोप बरामद किए गए थे। जबकि एन प्रोटीन के खिलाफ प्रतिक्रियाशील mAbs मुख्य रूप से डीएफए और डीआरआईटी में भरोसा कर रहे हैं, PAbs कि एन प्रोटीन पर कई epitopes के खिलाफ प्रतिक्रियाशील है एक IHC परीक्षण के लिए पसंद किया जाएगा । इसके अलावा, प्रतिक्रियाशीलता या पीएब्स विभिन्न राब वी वेरिएंट के खिलाफ और एमएबी की तुलना में गैर-रेबीज lyssaviruses के खिलाफ व्यापक हो सकता है।
आईएचसी परीक्षण की प्रमुख सीमाओं में से एक प्रोटोकॉल में कई अनुक्रमिक कदम शामिल हैं और इसे पूरा करने में लगभग 6 घंटे लगते हैं। यदि ऊतक को फॉर्मेलिन में तय करने और पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड करने की आवश्यकता है, तो ऊतक दाग होने से पहले अतिरिक्त 1 - 2 दिन की आवश्यकता होती है। एक अन्य सीमा आईएचसी परीक्षण के लिए वाणिज्यिक प्राथमिक एंटी-रेबीज एंटीबॉडी की अनुपलब्धता है। हालांकि, आईएचसी रेबीज निदान करने का विकल्प प्रदान करता है जब परीक्षण के लिए केवल एफएफ ऊतक उपलब्ध होते हैं। आईएचसी परीक्षण रेबीज के मामलों के परीक्षण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि ऊतकों का एक आधा फॉर्मेलिन (और डीएफए द्वारा परीक्षण किए गए अन्य अनसर्गेड ऊतकों) में संग्रहीत किया जाता है और निदान के लिए आवश्यक ब्रेनस्टेम और अन्य ऊतकों के पूर्ण क्रॉस सेक्शन का परीक्षण करना आवश्यक था। आईएचसी परीक्षण द्वारा रेबीज एंटीजन डिटेक्शन का उपयोग नैदानिक लक्षणों के आधार पर संदिग्ध मामलों के निदान और/या पूर्वव्यापी विश्लेषण के लिए मानव पोस्टमार्टम मस्तिष्क के नमूनों के लिए किया जा सकता है । जबकि आईएचसी को डीएफए की तरह रेबीज निदान के लिए प्राथमिक या पुष्टित्मक परीक्षण के रूप में अनुमोदित नहीं किया गया था, विधि रेबीज विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीजन का पता लगाती है। ताजा/जमे हुए बनाम एफएफ ऊतकों का उपयोग कर डीएफए की तुलना इसी तरह की संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान की15। जब तक एंटीबॉडी सीधे फिटसी (डीएफए परीक्षण के लिए आवश्यकता) के लिए संयुग्मित नहीं होते हैं, तब तक एचआरपी लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग आईएचसी में रेबीज एंटीजन को धुंधला करने के लिए किया जा सकता है। एचआरपी आधारित पता लगाने के साथ लाभ अवलोकन के लिए हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की क्षमता है। वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएफए अभिकर्दक, फिटसी संयुग्मित रेबीज विशिष्ट एंटीबॉडी (एमएबी) एपिटोप्स के संशोधन के कारण फॉर्मेलिन निर्धारण के बाद एंटीजन का पता नहीं लगाता है। हालांकि, यदि फिटसी ने रेबीज विशिष्ट पीएब्स उपलब्ध हैं, तो इसे एक धुंधला विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि विश्व स्वास्थ्य संगठनद्वारा अनुशंसित 16है। एंटीजन डिटेक्शन के अलावा, एफएफ ऊतकों को आरएनए अलगाव के अधीन किया जा सकता है जिसके बाद पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा आरएबीवी जीनोमिक आरएनए की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग किया जा सकता है।
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के अन्य फायदों में हेमाटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग विधि द्वारा हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों का निर्धारण शामिल है। जबकि फॉर्मेलिन उपचार प्रोटीन को बरकरार रखता है, यह प्रोटीन के व्यापक क्रॉसलिंकिंग और न्यूक्लिक एसिड के क्षरण या संशोधन के कारण नमूने में अधिकांश रोगजनकों को पूरी तरह से निष्क्रिय कर देता है। इस प्रकार, विधि डीएफए की तुलना में जैविक नमूना हैंडलिंग, शिपिंग और परीक्षण की सुरक्षा में सुधार करती है। डीएफए में एसीटोन फिक्सेशन कदम आरएबीवी को निष्क्रिय नहीं करता है और इसे उपयुक्त पीपीई17के साथ संभाला जाना चाहिए । फॉर्मेलिन निर्धारण के बाद नमूने स्थिर होते हैं और इन्हें परिवेश के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है, जो कम संसाधन वाले क्षेत्रों के लिए उपयुक्त है जहां कोल्ड स्टोरेज तक पहुंच सीमित है। इसी तरह, पैराफिन एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों को प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशीलता खोने के बिना परिवेश के तापमान पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए माना जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों के लिए नमूना प्रस्तुतियां के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य विभागों के साथ प्रयोगशालाओं, महामारी विज्ञानियों, और सहयोगी कंपनियों का शुक्रिया अदा करते हैं । निष्कर्ष और इस रिपोर्ट में निष्कर्ष लेखकों के उन है और जरूरी रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों की आधिकारिक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते । व्यापार के नाम और वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग केवल पहचान के लिए कर रहे है और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा समर्थन मतलब नहीं है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
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