Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקת אימונוהיסטוכימיה לגילוי אנטיגן וירוס כלבת כמבחן אבחון חלופי לרקמות קבועות פורמרין.
Abstract
אחת מאפשרויות האבחון העיקריות לכלבת היא זיהוי של קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין ויראלי (RNP) (אנטיגן) בדגימות הרקמה הנגועות. בעוד שבדיקת הנוגדן הפלואורסצנטי הישיר (DFA) או הבדיקה האימונוהיסטוכימית המהירה הישירה (DRIT) משמשות בדרך כלל לגילוי אנטיגן, שתי הבדיקות דורשות רקמות טריות ו/או קפואות להתרשמות בשקופיות לפני גילוי האנטיגן באמצעות נוגדנים. אם דגימות נאספות ומתוקנות בפורמלין, אף אחת מהבדיקה אינה אופטימלית לזיהוי אנטיגן, עם זאת, הבדיקות יכולות להתבצע על ידי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית (IHC) לאחר הטמעה בבלוקים ופרפין וחתך. בשיטת IHC זו, רקמות מוכתמות בנוגדנים נגד כלבת, חלקים הם deparaffinized, אנטיגן אחזור על ידי פרוטאוליזה חלקית או שיטות אחרות, ודגורה עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. אנטיגנים מוכתמים באמצעות peroxidase חזרת / אמינו אתיל קרבזול ומוכתם עם המטוקסילין להדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור. בנוסף לגילוי אנטיגן ספציפי, קיבוע פורמלין מציע יתרונות אחרים כמו קביעת שינויים היסתולוגיים, תנאים רגועים לאחסון ותובלה של דגימה (בטמפרטורות הסביבה), יכולת לבדוק מקרים רטרוספקטיביים ובטיחות ביולוגית משופרת באמצעות אי-החלמה של חומרים זיהומיים.
Introduction
כלבת היא דלקת המוח מתקדמת חריפה הנגרמת על ידי וירוסי RNA תחושה שלילית השייכים לסוג lyssavirus1. כמעט 99% מכלל מקרי המוות האנושיים הנגרמים על ידי זיהום בנגיף הכלבת (RABV), סוג הסוג, מועבר על ידי כלבים2. אבחון כלבת של בעלי חיים חשודים מסתמך על גילוי אנטיגן (בעיקר נוקלאופרוטאין מקודד ויראלי, חלבון N) בקומפלקס עם RNA גנומי (קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין, RNP) ברקמת המוח3. גילוי אנטיגן על ידי בדיקת נוגדן פלואורסצנטי ישיר (DFA) נחשב תקן הזהב לאבחון כלבת4. השיטה משתמשת בחומר מוח קפוא טרי או טרי, רושם מגע על שקופית, קיבוע אצטון, כתמים באמצעות איזוטיוציאנט פלואורסצנטי זמין מסחרית (FITC) שכותרתו נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים (mAbs / pAbs) ונקרא על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית5. בדיקת DFA מהירה, רגישה וספציפית לזיהוי אנטיגן כלבת ברקמת מוח טרייה. לאחרונה, בדיקה אימונוהיסטוכימית מהירה ישירה (DRIT), טכניקה אימונוהיסטוכימיה שונה (IHC), הודגמה להפגין רגישות דומה DFA אבל מציע את היתרון של מיקרוסקופיה אור להדמיה6. בעוד שיטת הזיהוי המשמשת DRIT, דומה IHC, השלב הראשוני משתמש ברקמות טריות או קפואות כדי ליצור רשמי מגע של המדגם ואחריו קיבעון פורמלין.
IHC היא טכניקה נפוצה לקביעת שינויים היסתולוגיים וזיהוי חלבונים באמצעות נוגדנים ספציפיים ברקמות קבועות פורמלין המוטמעות בלוקים פרפין. IHC הוא בדיקה חלופית הוקמה לגילוי אנטיגן כלבת בסעיפים7רקמה . IHC נוצל במיוחד לאבחון מקרים רטרוספקטיביים שהפגינו מחלות נוירולוגיות כדי לקבוע את נטל הכלבת8. רקמות קבועות פורמרין מוטבעות פרפין לשמר את החלבונים לגילוי גם לאחר מספר שנים כאשר מאוחסנים בטמפרטורתהסביבה 9. טיפול פורמלין משנה חלבונים על ידי הצלבה ושינוי שרשראות הצד של חומצות האמינו, מה שעלול לגרום לאפיטופים כבר לא להגיב נגד נוגדנים10. בעוד שבדיקת IHC לזיהוי אנטיגן נגד כלבת כוללת mAbs או pAbs, האחרון הוא יתרון כמו epitopes מרובים ו lyssaviruses מפוצלים ניתן לזהות11.
השלבים הסטנדרטיים המעורבים ב- IHC הם קיבוע פורמלין של רקמות, הטמעה בבלוקים פרפין, חלוקת רקמות, דפראפיזציה והידרציה, התאוששות אפיטופה, תגובתיות נגד נוגדנים ראשוניים ומשניים, והתפתחות באמצעות מצעים כרומוגניים. כתב יד זה מתאר תיאור מפורט של הפרוטוקול לאבחון כלבת. לגילוי אנטיגן כלבת, סרום עכבר מחוסן עם RABV (pAbs) המיוצר במרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה"ב (CDC) אטלנטה, ג'ורג'יה, בשילוב עם נוגדנים משניים נגד עכבר ביוטיניל מנוצלים. שרירי בטן ביוטינילאט מזוהים על ידי תוספת של קומפלקס peroxidase סטרפטאבידין-חזרת (HRP) ואחריו התפתחות הצבע עם מצע אמינו-אתילקרבאזול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בעוד פרוטוקול IHC בוצע על רקמות קבועות פורמלין, אשר מנטרל RABV אם קיים, פרוטוקולים בטיחות ביולוגית מתאימים יש לעקוב כראוי. כל נהלי הבטיחות הביולוגית מתוארים בבטיחות הביולוגית במעבדות מיקרוביולוגיות וביו-רפואיות (BMBL) מהדורה 5 (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) ודרישת חיסון כמתואר12. בנוסף, יש לעקוב אחר בלימה וטיפול נאותים בכימיקלים מסוכנים (כמו פורמלין, AEC וקסילן), (למשל, ברדסים אדים).
1. קיבוע פורמלין של רקמות
- מניחים רקמות מוח 3-5 מ"מ שנאספו לאחר נמק13 לתוך 10% תמיסת פורמרין חוצץ פוספט (1:20 עד 1:50 יחס רקמות / פורמלין) עבור 24-72 שעות.
זהירות: פורמלין הוא קיבעון רעיל. - להקליט את משקל הרקמה המשוער (גודל), סוג הרקמה (אזורי המוח) ואת נפח הפורמלין. חשוב שמעבדות יתעדו ויתחזקו רשומות בזמני הקיבעון.
- לאחסון רקמות ארוך יותר לאחר קיבוע פורמלין ולפני העיבוד, מניחים את הרקמה ב-70% אתנול.
2. עיבוד רקמות
- לאחר קיבוע הדגימה, לנתח את הרקמה כדי לכלול את אזורי המוח החשובים כגון, חתכים צולבים של גזע המוח, המוח הקטן (3 אונות), או ההיפוקמפוס (שניהם היפוקמפי) כל לחתוך 3 עד 5 מ"מ עובי להציב לתוך קלטות עיבוד.
- לעבד את קלטות הרקמה עבור חדירת שעוות פרפין, מוטבע לתוך בלוקים פרפין מחולק (3 עד 6 מיקרומטר) על microtome.
3. הכנת חומרים / כלים מכתימים
- הגדר את צלחת הכתמים14 (שולחן החומרים)כפי שמוצג באיור 1. ממלאים כל מנה ב-250 מ"ל של הפתרון.
- הכנת פתרון מלאי מצע 3-Amino-9-אתילקרביזואל (AEC)
- ממיס טבליה אחת של 20 מ"ג של 3 אמינו 9-אתילקרבאזול (AEC) לתוך 5 מ"ל של N,N, דימתילפורמיד באמצעות פיפטה זכוכית.
זהירות: AEC הוא מסרטן.
- ממיס טבליה אחת של 20 מ"ג של 3 אמינו 9-אתילקרבאזול (AEC) לתוך 5 מ"ל של N,N, דימתילפורמיד באמצעות פיפטה זכוכית.
- הכנת פתרון המניות של הפרוטאז (למשל, פרונאז) לאחזור האנטיגן
- להמיס 7 מ"ג של פרוטאז ב 200 מ"ל של PBS.
- הכנת חיץ השטיפה PBS-T
- הוסף 10 מ"ל של Tween 80 עד 990 מ"ל של PBS. מערבבים אותו היטב כדי ליצור פתרון הומוגני.
4. דפראפיזציה והידרציה מחדש של רקמות
- הפוך 5 מיקרומטר סעיף פרפין באמצעות microtome, לצוף אותו על אמבט מים ב 38 °C (5 °F) ולאסוף על מגלשות זכוכית. סמן את השקופיות באמצעות עט/סמן עמידים לריגנט.
- מניחים את השקופיות על מגש וממיסים בתנור 55-60 מעלות צלזיוס למשך שעה. אין להעלות את הטמפרטורה מעל 60 °C (60 °F) כפי שהוא יכול להרוס את האנטיגן הנגיפי.
- מוציאים מגלשות מהתנור ומיד מסירים ב-3 שטפונות קסילן רצופות של 5 דקות כל אחת בכלים 1, 2 ו-3.
- Rehydrate את החלקים על השקופית על ידי טבילה רציפה בהפחתת דילול של אתנול למים deionized: (4 עד 11 הוא לשטוף לטבול) צלחת 4: קסילן / 100% אתנול (1:1); מנה 5: 100% אתנול; מנה 6: 100% אתנול; מנה 7: 95% אתנול; מנה 8: 95% אתנול; מנה 9: 80% אתנול; מנה 10: 70% אתנול; מנה 11: מים דה-יוניים (איור 1). הגדרת צלחת).
זהירות: קסילן הוא כימיקל מסוכן ועבודה צריכה להתבצע במכסה אדים.
5. אחזור אנטיגן פרוטאוליטי
- לטפל שקופיות עם פרוטאז (2.5 מיקרוגרם / מ"ל של PBS) במשך 30 דקות עבור אחזור אנטיגן פרוטאוליטי בצלחת 12.
- לאחר מכן לשטוף PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 13).
- לטפל עם 3% מי חמצן במשך 10 דקות (צלחת 14).
- שוב, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 15).
6. הליך הכתמת
- טפל בשקופיות אחת בכל פעם תוך שמירה על השקופיות הנותרות שקועות במאגר (אל תסיר את כל מחזיק השקופיות - שמור שקופיות רטובות). הסר שקופית אחת ולהכתים את חוצץ עודף (באמצעות מגבת נייר) מסביב לאזור הרקמה נזהר לא להפריע סעיף הרקמה. דגירה מחליקה בתא לחות, שנעשו על ידי הצבת מגבות נייר לחות, על ספסל המעבדההעליון 14 בטמפרטורת החדר עם סרום עזים רגיל (חסימה) במשך 15 דקות.
- דגירה עם נוגדן דילול ראשוני אופטימלי שנקבע מראש נגד כלבת (1:250 דילול של סרום נגד כלבת עכבר, לא פורסם) (שליטה חיובית) ונוגדני שליטה שלילית בטמפרטורת החדר זהה לעיל (שלב 6.1.) במשך 60 דקות ללא שטיפה בין לבין.
- לאחר 60 דקות, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
- דגירה עם הנוגדן הביוטינילי (ספציפי למינים) בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה לשלב 6.1).
- לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
- דגירה עם מתחם סטרפטאבידין-HRP בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה ל-6.1).
- לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 16).
- דגירה עם מצע פרוקסידאז, אמינו-אתילקרבזול (AEC), בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפוך AEC ממש לפני השימוש. כדי לעשות זאת, להוסיף 1 מ"ל של פתרון מלאי AEC 14 מ"ל של 0.1M חוצץ אצטט, pH 5.2. הוסף 0.15 מ"ל של 3% H2O2. מסננים את התערובת ממש לפני השימוש (מסנן 0.45 מיקרומטר).
הערה: פתרון העבודה של AEC יציב רק עבור 2-3 שעות. ניתן לאחסן את פתרון המלאי של AEC במקרר לתקופות ארוכות יותר. - לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 17)
- עם ההמטוקסילין של גיל מדולל 1:2 עם מים דה-יון במשך 2 דקות (מנה 18).
- לשטוף עודף המטוקסילין עם שטיפת מטבל מים deionized (צלחת 19 ו 20).
- יש לשטוף במי הברז של סקוט 30 s (תמיסת סומק) 21.
- לשטוף במים דה-יונו 10 דקות (מנה 22)
- הסר שקופיות אחת בכל פעם - הר עם מדיום הרכבה מסיס במים.
- קרא שקופיות על מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מדגים תוצאות הכתמת IHC מייצגות של דגימות שליטה חיוביות ושליליות ברקמות מוח שונות שנבדקו. איור 2A,D,G מייצג דגימות חיוביות ב- 200x, ואילו איור 2B,E,H תואם להגדלה של פי 400, בהתאמה. איור 2A-C תואם לגזע המוח; איור 2D-F מתאים לתאי המוח הקטן והפורקיניה; ואיור 2G-I מתאים להיפוקמפוס. איור 2,אף, אני דגימות שליטה שליליות. הכתם האדום של המגנטה מדגים את התפתחות הצבע באמצעות מצע AEC ברקע הכחול (הנגדי המטוקסילין) בשל התגובה של נוגדנים נגד אנטיגן כלבת. AEC הוא מצע peroxidase, אשר על תגובת חמצון, מזורז על ידי HRP, תוצאות משקעים בלתי מסיסים מים נצפה תחת מיקרוסקופ אור.
תוצאה חיובית IHC מתאים מכתמים אדומים מגנטה בקטעי רקמות. הכתמת תכלילים ציטופלסמיים והכללים פרטניים בגדלים שונים מעידים על דגימות חיוביות לזיהומים RABV. דגימות נחשבות שליליות אם לא נצפתה כתם אדום ספציפי או רק הרקע הכחול עקב המטוקסילין. בנוסף להכתמה החיובית, התפלגות ההכללות יכולה לספק כימות עקיף של רמות האנטיגן של כלבת במדגם, אשר עשוי להתאים את העומס הנגיפי של דגימות הרקמה. ללא קשר לרמות ההפצה, כל כתם ספציפי י לסווג את המדגם כחיובי לזיהוי אנטיגן RABV.
איור 1: תרשים זרימה המציין שלבים שונים לבדיקת IHC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כתמים אימונוהיסטוכימיים של רקמת מוח חיובית ושלילית של כלבת. (A)תכלילים ויראליים Intracytoplasmic וזיהוי אנטיגן וירוס כלבת בגזע המוח 200x הגדלה כוללת; (B) גזע מוח חיובי 400x; (C)גזע המוח שליטה שלילית 200x; (D)תכלילים וירוס כלבת בתוך המוח הקטן 200x; (E)תאי המוח הקטן והפורקיניה 400x; (F)שליטה שלילית במוח הקטן; (G)תכלילים ויראליים בתוך היפוקמפוס 200x; (H)היפוקמפוס 400x; היפוקמפוס שליטה שלילית 200x. הכתם האדום מציין את נוכחותו של אנטיגן וירוס כלבת באמצעות שיטת הכתמה קומפלקס סטרפטאבידין-ביוטין (מצע AEC). כתם נגד המטוקסילין (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל שיעור התמותה הגבוה של כלבת לאחר הופעת הסימפטום, האבחנה של בעלי חיים חשודים לזיהום RABV היא קריטית ביותר לטיפול מניעתי מתאים לאחר חשיפה. אבחון כלבת תלוי בעיקר בטכניקות DFA, DRIT ו- PCR באמצעות רקמות טריות או קפואות. לבדיקת רקמות קבועות פורמרין, בדיקת IHC מספקת שיטה חלופית לזיהוי רגיש וספציפי של אנטיגן RABV. בעוד הרקמות קבועות פורמלין יש חלבונים התייצבו עקב שינוי של שרשראות צד כמו קישור צולב, הדגימות צריך להיות מעובד לפני גילוי אנטיגן. בפרוטוקול זה, האפיטופים נמצאו באמצעות העיכול הפרוטאוליטי החלקי על ידי הפרוטאז (למשל, פרונאז) כדי לאפשר את כריכת הנוגדנים העיקריים לתסביך RNP. בעוד mAbs תגובתי נגד חלבון N מסתמכים בעיקר על DFA ו- DRIT, pAbs כי הם מגיבים נגד epitopes מרובים על חלבון N יועדף לבדיקת IHC. בנוסף, תגובתיות או pAbs יכול להיות רחב יותר נגד גרסאות RABV שונות נגד lyssaviruses שאינם כלבת לעומת mAbs.
אחת המגבלות העיקריות של מבחן IHC היא הפרוטוקול כרוך במספר צעדים רציפים ולוקח כ 6 שעות להשלמה. אם הרקמה צריכה להיות קבועה בפורמלין ומוטמעת בלוקים פרפין, זה דורש 1 - 2 ימים נוספים לפני הרקמה יכול להיות מוכתם. מגבלה נוספת היא אי זמינות של נוגדנים מסחריים ראשוניים נגד כלבת לבדיקת IHC. עם זאת, IHC מספק אפשרות לבצע אבחון כלבת כאשר רק רקמות FF זמינים לבדיקה. בדיקת IHC חשובה במיוחד לבדיקת מקרי כלבת אם מחצית מהרקמות מאוחסנות בפורמלין (ורקמות לא מנוצלות אחרות שנבדקו על ידי DFA) והיה צורך לבדוק חתך מלא של גזע המוח ורקמות אחרות, כנדרש לאבחון. גילוי אנטיגן כלבת על ידי בדיקת IHC יכול לשמש עבור דגימות מוח לאחר המוות אנושי לאבחון ו / או ניתוח רטרוספקטיבי של מקרים חשודים המבוססים על הסימפטומים הקליניים. בעוד IHC לא אושרה כמבחן ראשוני או מאשר לאבחון כלבת, כמו DFA, השיטה מזהה אנטיגן באמצעות נוגדנים ספציפיים לכלבת. השוואה של DFA באמצעות רקמות טריות / קפואות לעומת FF סיפקה רגישותוספציפיות דומות 15. אלא אם כן נוגדנים מצומדים ישירות ל- FITC (הדרישה לבדיקת DFA), ניתן להשתמש בנוגדנים המסומנים על ידי HRP ב- IHC להכתמת אנטיגן כלבת. היתרון בזיהוי מבוסס HRP הוא היכולת להשתמש במיקרוסקופ אור לתצפית. ריאגנטים DFA זמין מסחרית הנוכחי, FITC מצומד כלבת נוגדנים ספציפיים (mAbs) אינו מזהה אנטיגן לאחר קיבוע פורמלין עקב שינוי של epitopes. עם זאת, אם FITC מצומד כלבת ספציפי pAbs זמינים, זה יכול לשמש כשיטת כתמים, כפי שהומלץ על ידי ארגון הבריאות העולמי16. בנוסף לגילוי אנטיגן, רקמות FF יכולות להיות כפופות לבידוד RNA ואחריו PCR ורצף באמצעות פריימרים ספציפיים לאישור נוכחות של RNA גנומי RABV.
היתרונות האחרים של רקמות קבועות פורמרין כוללים קביעת שינויים היסטואליים על ידי שיטת הכתמת המטוקסילין ואאוזין. בעוד הטיפול פורמלין משמר חלבון, זה לחלוטין מנטרל את רוב הפתוגנים במדגם בשל crosslinking נרחב של חלבונים השפלה או שינוי של חומצות גרעין. לכן, השיטה משפרת את הבטיחות של טיפול מדגם ביולוגי, משלוח ובדיקה בהשוואה DFA. שלב קיבוע אצטון ב- DFA אינו מושבת RABV ויש לטפל בו עם PPE17 המתאים. הדגימות לאחר קיבוע הפורמלין יציבות וניתן לאחסן בטמפרטורת הסביבה, המתאימה לאזורים בעלי משאבים נמוכים שבהם הגישה לאחסון קר מוגבלת. באופן דומה, ניתן לשקול רקמות קבועות פורמרין מוטמעות פרפין לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורות הסביבה מבלי לאבד את תגובתיות הנוגדנים נגד חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למעבדות, לאפידמיולוגים ולשותפים עם מחלקות בריאות הציבור על הגשת מדגמים למרכז לבקרת מחלות ומניעתן. הממצאים והמסקנות בדו"ח זה הם של המחברים ואינם מייצגים בהכרח את עמדתם הרשמית של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן. השימוש בשמות מסחריים ומקורות מסחריים מיועד לזיהוי בלבד ואינו מרמז על תמיכה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
