Summary
여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.
Abstract
광견병에 대한 1 차적인 진단 양식의 한은 감염된 조직 견본에 있는 바이러스성 리보뉴클레오단백질 (RNP) 복합체 (항원)의 검출입니다. 직접 형광 항체(DFA) 테스트 또는 직접적인 신속한 면역 조직화학 시험(DRIT)이 항원 검출에 가장 일반적으로 활용되지만, 두 검사 모두 항체를 사용하여 항원 검출 전에 슬라이드에 대한 노출을 위해 신선 및/또는 냉동 조직을 필요로 한다. 시료를 포름포민에서 채취및 고정하는 경우, 어느 테스트도 항원 검출에 최적이지만, 파라핀 블록 및 단면에 포함된 후 종래의 면역히토화학(IHC)에 의해 시험을 수행할 수 있다. 이 IHC 방법을 사용하면 조직은 항 광견병 항체로 염색되고, 섹션은 탈파화되고, 부분 적인 proteolysis 또는 그밖 방법에 의해 회수된 항원, 및 1 차 및 이차 항체로 배양됩니다. 항원은 고추냉이 과록시다제/아미노 에틸 카르바졸을 사용하여 염색되고 가벼운 현미경을 사용하여 시각화를 위해 헤마톡슬린으로 대응한다. 특정 항원 검출 외에도 포르말린 고정은 조직학적 변화의 결정, 표본 저장 및 운송을 위한 완화된 조건(주변 온도 미만), 회고적 사례를 테스트하는 능력 및 전염성 제의 불활성화를 통한 생물학적 안전 성 향상과 같은 다른 이점을 제공합니다.
Introduction
광견병은 속 리사바이러스1에속하는 부정적인 감각 RNA 바이러스에 의해 유발되는 급성 진행성 뇌염이다. 광견병 바이러스 (RABV)로 인한 모든 인간 사망의 거의 99 %는 개2에의해 전달됩니다. 의심되는 동물의 광견병 진단은 뇌 조직3에서게놈 RNA (리보뉴클레오 단백질 복합체, RNP)와 복합체에서 항원 (주로 바이러스 인코딩 뉴클레오 단백질, N 단백질)의 검출에 의존한다. 직접 형광 항체(DFA) 시험에 의한 항원 검출은 광견병 진단4에대한 금본위제로 간주된다. 이 방법은 신선하거나 신선한 냉동 뇌 물질, 슬라이드에 터치 인상, 아세톤에 고정, 시판되는 형광 이소티오카네이트(FITC)를 사용하여 염색하고 단클론 또는 폴리클론 항체(mAbs/pAbs)로 표시하고 형광 현미경검사법 5에의해 읽습니다. DFA 시험은 신선한 두뇌 조직에서 광견병 항원 검출을 위해 급속하고, 민감하고, 특정합니다. 최근에는 직접 신속한 면역조직화학시험(DRIT), 수정된 면역조직화학(IHC) 기술이 DFA와 유사한 민감성을 나타내고 있음을 입증했지만, 시각화를 위한 광현미경검사의 장점을6. DRIT에서 사용되는 검출 방법은 IHC와 유사하지만 초기 단계는 신선하거나 냉동된 조직을 사용하여 시료의 터치 노출을 생성한 다음 포르말린에 고정됩니다.
IHC는 파라핀 블록에 내장된 포르말린 고정 조직에서 특정 항체를 사용하여 단백질의 조직학적 변화 및 검출을 결정하는 데 널리 사용되는 기술이다. IHC는 조직 섹션7에서광견병 항원 검출을 위한 확립된 대체 시험이다. IHC는광견병8의 부담을 결정하기 위해 신경질환을 전시한 회고적 사례의 진단을 위해 특히 활용되고 있다. 파라핀-임베디드 포멀린 고정 조직은 주변 온도9에저장될 때 몇 년 후에도 검출을 위한 단백질을 보존한다. 포르말린 치료는 아미노산 측면 사슬을 교차 연결하고 변경하여 단백질을 수정하여, 이는 에피토프가 항체에 대해 더 이상 반응하지 않을 수있습니다(10). 광견병 항원 검출을 위한 IHC 시험은 mAbs 또는 pAbs를 포함하지만, 후자는 다중 에피토프및 발산 리사바이러스가11을검출할 수 있기 때문에 유리하다.
IHC에 관여하는 표준 단계는 조직의 포르말린 고정, 파라핀 블록에 포함, 조직의 단면화, 분리 및 수분 공급, 에피토프 복구, 1 차 및 이차 항체에 대한 반응성, 및 염색체 기판을 사용하여 개발. 이 원고는 광견병 진단을위한 프로토콜의 상세한 설명을 설명합니다. 광견병 항원 검출의 경우, 미국 질병통제예방센터(CDC)에서 생성된 RABV(pAbs)로 면역화된 마우스 혈청이 생물신생 항마우스 이차 항체와 함께 활용된다. 생물요닉 복근은 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다제(HRP) 복합체의 첨가에 의해 검출되고, 아미노 에틸카르바졸 기판으로 색이 발달한다.
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Protocol
IHC 프로토콜은 포르말린 고정 조직에서 수행되었지만, 이 조직이 있는 경우 RABV를 비활성화하는 동안 적절한 생체 안전 프로토콜을 적절히 따라야 합니다. 모든 생물안전 절차는 미생물 및 생물의학 연구소(BMBL) 제5판(https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm)의 생물안전에 설명되어 있으며, 여기에는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함한, 그리고12에기술된 바와 같이 예방 접종 요건이 기재되어 있다. 또한, 유해 화학물질(예: 포르말린, AEC 및 자일렌)의 적절한 봉쇄 및 취급(예: 연기 후드)을 따라야 합니다.
1. 조직의 포르말린 고정
- 24-72 h에 대해 13개의 인산염 완충 포르말린 용액(1:20 ~ 1:50 조직/포르말린 비율)으로13년 후에 수집된 3-5mm 뇌 조직을 놓습니다.
주의: 포르말린은 독성 고정제입니다. - 대략적인 조직 중량 (크기), 조직 모형 (두뇌 영역) 및 포르말린의 양을 기록합니다. 실험실은 고정 시간에 대한 레코드를 문서화하고 유지하는 것이 중요합니다.
- 포르말린 고정 후 및 처리 전에 더 긴 조직 저장을 위해, 70% 에탄올에 조직을 놓습니다.
2. 조직 처리
- 시편 고정에 따라, 뇌간, 소뇌(3개의 로브) 또는 해마(둘 다 해마)의 교차면과 같은 중요한 뇌 영역을 포함하도록 조직을 해부하여 각각 3~5mm 두께를 절단하고 카세트처리에 배치한다.
- 파라핀 왁스 침투를 위한 조직 카세트를 처리하고, 파라핀 블록에 내장되어 미세토메에 단면(3~6μm)을 한다.
3. 재료 준비 /스테인딩 요리
- 도 1에 도시된 바와같이 염색접시(14)를 설정한다. 각 접시에 250mL의 용액을 채웁니다.
- 3-아미노-9-에틸카르비졸(AEC) 기판 스톡 솔루션 준비
- 유리 파이펫을 사용하여 N,N, 디메틸포르마미드의 5mL에 3-아미노 9-에틸카르바졸(AEC)의 20 mg 정제를 용해시키면 된다.
주의: AEC는 발암 물질입니다.
- 유리 파이펫을 사용하여 N,N, 디메틸포르마미드의 5mL에 3-아미노 9-에틸카르바졸(AEC)의 20 mg 정제를 용해시키면 된다.
- 항원 회수용 프로테아제(예를 들어, Pronase) 스톡 솔루션의 제조
- PBS의 200 mL에서 프로테아제 7 mg을 녹입니다.
- 헹구는 버퍼 PBS-T의 준비
- PBS의 Tween 80 ~ 990 mL의 10 mL을 추가합니다. 균일 한 용액을 형성하기 위해 잘 섞는다.
4. 분리및 조직 재수화
- 마이크로토메를 사용하여 5 μm 파라핀 섹션을 만들고 38 °C의 수조에 띄워 유리 슬라이드에 수집하십시오. 시약 저항 펜/마커로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
- 슬라이드를 트레이에 놓고 55-60°C 오븐에서 1시간 동안 녹입니다. 바이러스 항원이 파괴 될 수 있으므로 60 °C 이상의 온도를 올리지 마십시오.
- 오븐에서 슬라이드를 제거하고 즉시 3 연속 자일렌 헹구기 에서 5 분 씩 요리 1, 2 및 3에서 분리하십시오.
- 에탄올의 희석을 감소시켜 분화하여 슬라이드의 섹션을 재수화: (4~11은 딥 린스) 접시 4: 자일렌/100% 에탄올(1:1); 접시 5: 100% 에탄올; 접시 6: 100% 에탄올; 접시 7: 95% 에탄올; 접시 8: 95% 에탄올; 접시 9: 80% 에탄올; 접시 10: 70% 에탄올; 접시 11: 탈이온된 물(그림 1. 접시 설정).
주의: 자일렌은 유해한 화학 물질이며 연기 후드에서 작업을 수행해야합니다.
5. 프로테올리틱 항원 회수
- 프로테아제(PBS의 2.5 μg/mL)로 슬라이드를 30분 간 처리하여 접시(12)에서 프로테오리틱 항원 검색을 위해 30분 간 처리합니다.
- 그런 다음 PBS-T에서 10 분 동안 헹구습니다 (접시 13).
- 과산화수소 3%를 10분 동안 치료합니다(접시 14).
- 다시, 10 분 PBS-T로 씻어 (접시 15).
6. 염색 절차
- 핸들은 버퍼에 잠긴 나머지 슬라이드를 한 번에 하나씩 슬라이드합니다(전체 슬라이드 홀더를 제거하지 않음 - 슬라이드를 젖은 상태로 유지). 하나의 슬라이드를 제거하고 조직 섹션을 방해하지 않도록주의하는 조직 섹션에서 (종이 타월을 사용하여) 여분의 버퍼 (종이 타월사용)를 제거합니다. 습한 종이 타월을 실온에서14번 실험실 벤치 탑에 15분 동안 일반 염소 세럼(차단)에 배치하여 만든 습도 챔버에서 인큐베이션 슬라이드가 슬라이드됩니다.
- 최적의 미리 결정된 희석 제1항광견 항체(마우스 항광견혈청의 1:250 희석, 미공개) 및 음수 대조군 항체를 위와 같은 실온(단계 6.1.)으로 60분 동안 배양하여 그 사이에 세척없이 배양한다.
- 60분 후 PBS-T로 10분 간 씻으시면(16분).
- 15분 동안 실온에서 습도 챔버에서 생체개화 항체(종 별)를 배양한다(6.1단계와 동일하게 취급).
- PBS-T로 10분 간 씻으시면(접시 16분).
- 15분 동안 실온에서 습도 챔버에 스트렙타비딘-HRP 복합체와 함께 배양한다(6.1.와 동일).
- PBS-T로 10분 간 씻으시면(접시 16분).
- 퍼록시다아제 기판, 아미노 에틸카르바졸(AEC)으로 10분 동안 실온에서 습도 챔버에 배양한다. 사용하기 직전에 AEC를 만드십시오. 이렇게 하려면 0.1M 아세테이트 버퍼, pH 5.2의 14mL에 AEC 스톡 솔루션 1mL을 추가합니다. 3 % H 2 O2의0.15 mL을추가하십시오. 사용하기 직전에 혼합물을 필터링하십시오(0.45 μm 필터).
참고: AEC의 작업 솔루션은 2-3h에 대해서만 안정적입니다. AEC 스톡 솔루션은 장기간 냉장고에 보관할 수 있습니다. - 탈이온수로 10분 세척(17접시)
- 길의 헤마톡클린과 함께 1:2를 희석시켰고, 2분 동안 탈온화된 물로 희석(접시 18).
- 여분의 헤마톡슬린을 탈온화된 물 딥 린스(접시 19및 20)로 헹구세요.
- 스콧의 수돗물 30 s (블러잉 용액) 접시 21에서 헹구는.
- 탈이온수로 세척 10분(접시 22)
- 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거 - 수용성 장착 매체마운트.
- 가벼운 현미경에서 슬라이드를 읽으십시오.
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Representative Results
도 2는 테스트된 다른 뇌 조직에서 양성 및 부정적인 대조샘플의 대표적인 IHC 염색 결과를 보여줍니다. 그림 2A,D, G는 200x에서 양수 샘플을 나타내고, 그림 2B, E, H는 각각 400배율에 해당한다. 도 2A-C는 뇌간에 해당; 도 2D-F는 소뇌 및 푸르킨제 세포에 해당; 도 2G-I는 해마에 해당합니다. 그림 2C, F, 나는 부정적인 제어 샘플입니다. 마젠타 레드 스테닝은 광견병 항원에 대한 항체의 반응성으로 인해 파란색 배경(Hematoxylin 카운터스테인)에서 AEC 기판을 사용하여 색 발달을 보여줍니다. AEC는 HRP에 의해 촉매화된 산화 반응시, 가벼운 현미경하에서 관측가능한 물 불용성 침전물을 초래하는 peroxidase 기판입니다.
IHC의 양성 결과는 조직 단면에서 마젠타 적색 염색에 해당합니다. 세포질 포함 및 다양한 크기의 세분화 된 포함의 염색은 RABV 감염에 대해 긍정적 인 샘플을 나타냅니다. 시료는 헤마톡슬린으로 인한 특정 적색 염색이나 파란색 배경만 관찰되지 않은 경우 부정적으로 간주됩니다. 양성 염색 이외에, 포함물의 분포는 조직 견본의 바이러스성 하중에 대응할 수 있는 견본에 있는 광견병 항원의 수준의 간접적인 정량화를 제공할 수 있었습니다. 분포 수준에 관계없이, 임의의 특정 염색은 RABV 항원 검출을 위한 양성으로 견본을 분류할 것입니다.
그림 1: IHC 테스트에 대해 서로 다른 단계를 나타내는 흐름 차트입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 양성 및 부정적인 광견병 뇌 조직의 면역 조직 화학 염색. (A)뇌간에서 내트라토플라스바이러스 내성 및 광견병 바이러스 항원 검출 200x 총 배율; (B)양성 뇌간 400x; (C)뇌간 음성 제어 200x; (D)광견병 바이러스 내의 소뇌 200x; (E)소뇌 및 푸르킨제 세포 400x; (F)소뇌 음의 제어; (G)해마 내 의 바이러스 포함 200x; (H)해마 400x; 해마 음성 제어 200x. 적색 얼룩은 스트렙타비딘-비오틴 복합 염색 방법(AEC 기판)을 이용한 광견병 바이러스 항원의 존재를 나타낸다. 헤마톡시린 카운터스테인(블루). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
증상 발병 후 광견병의 높은 사망률로 인해 RABV 감염에 대한 의심스러운 동물의 진단은 적절한 노출 후 예방 치료에 매우 중요합니다. 광견병 진단은 주로 신선하거나 냉동 된 조직을 사용하여 DFA, DRIT 및 PCR 기반 기술에 달려 있습니다. 포르말린 고정 조직의 테스트를 위해 IHC 검사는 RABV 항원의 민감하고 특정 검출을 위한 대체 방법을 제공합니다. 포르말린에 고정된 조직은 교차 연결같이 측사슬의 변형때문에 단백질이 안정되어 있는 동안, 견본은 항원 검출의 앞에 처리될 필요가 있습니다. 본 프로토콜에서, 에피토프는 RNP 복합체에 대한 1차 항체의 결합을 가능하게 하기 위해 프로테아제(예를 들어, Pronase)에 의한 부분적인 프로테오리틱 소화를 통해 회수되었다. N 단백질에 대한 mAbs 반응성이 주로 DFA 및 DRIT에 의존하지만, N 단백질에 대한 여러 전형체에 반응하는 pAbs는 IHC 테스트에 선호될 것입니다. 또한, 반응성 또는 pAbs는 mAbs에 비해 다른 RABV 변이체 및 비 광견병 리사바이러스에 대해 더 광범위할 수 있습니다.
IHC 테스트의 주요 제한 사항 중 하나는 프로토콜에 여러 가지 순차적 단계가 포함되며 완료하는 데 약 6 시간이 걸린다는 것입니다. 조직이 포르말린에 고정되고 파라핀 블록에 내장되어야 하는 경우, 조직이 염색되기 전에 추가 1 - 2 일이 필요합니다. 또 다른 제한은 IHC 시험을 위한 상업적인 1 차적인 항광견 항체의 비가용성입니다. 그러나, IHC는 FF 조직만 시험할 수 있을 때 광견병 진단을 능력을 발휘할 수 있는 선택권을 제공합니다. IHC 시험은 조직의 절반이 포르말린 (및 DFA에 의해 시험된 그밖 고정되지 않은 조직)에 저장되고 진단에 요구되는 대로 두뇌줄기 및 그밖 조직의 완전한 단면을 시험하는 것이 필요한 광견병 케이스를 시험하기 위해 특히 중요합니다. IHC 시험에 의한 광견병 항원 검출은 임상 증상에 기초하여 의심되는 경우의 진단 및/또는 회고적 분석을 위해 인간 사후 뇌 샘플에 활용될 수 있다. IHC는 DFA와 같은 광견병 진단을 위한 1차 또는 확확인 시험으로 승인되지 않았지만, 이 방법은 광견병 특정 항체를 사용하여 항원을 검출한다. 신선/냉동 대 FF 조직을 이용한 DFA의 비교는 유사한 민감도 및특이성(15)을제공했다. 항체가 FITC(DFA 시험의 요구 사항)에 직접 공주되지 않는 한, HRP 표지된 항체는 광견병 항원 염색을 위해 IHC에서 사용될 수 있다. HRP 기반 검출의 장점은 관찰을 위해 광 현미경을 사용하는 기능입니다. 현재 시판되는 DFA 시약, FITC 공액 광견병 특정 항체(mAbs)는 에피토프의 변형으로 인한 포르말린 고정 후 항원을 검출하지 않는다. 그러나 FITC 공액 광견병 특정 pAbs를 사용할 수 있는 경우세계보건기구(16)가권장하는 염색 방법으로 사용할 수 있다. 항원 검출 이외에, FF 조직은 RABV 게놈 RNA의 존재를 확인하기 위한 특정 프라이머를 사용하여 PCR 및 시퀀싱에 선행된 RNA 절연을 실시할 수 있다.
포르말린 고정 조직의 다른 장점은 혈소클린과 에오신 염색 방법에 의한 조직학적 변화의 결정을 포함한다. 포르말린 치료는 단백질을 보존하는 동안, 단백질의 광범위한 교차 연결 및 저하 또는 핵산의 변형으로 인해 샘플의 대부분의 병원균을 완전히 비활성화합니다. 따라서, 이 방법은 DFA에 비해 생물학적 시료 취급, 운송 및 검사의 안전성을 향상시킨다. DFA의 아세톤 고정 단계는 RABV를 비활성화하지 않으며 적절한 PPE17로처리해야 합니다. 포르말린 고정 후 샘플은 안정적이며 주변 온도에서 저장할 수 있으며, 이는 냉장 보관에 대한 액세스가 제한된 낮은 자원 영역에 적합합니다. 유사하게, 파라핀 임베디드 포르말린 고정 조직은 단백질에 대한 항체 반응성을 잃지 않고 주변 온도에서 장기 저장을 고려할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 질병 통제 및 예방 센터에 견본 제출을 위한 공중 위생 부서와 가진 실험실, 역학자 및 계열사에게 감사합니다. 이 보고서의 사실 인정 그리고 결론은 저자의 그이며 반드시 질병 통제 및 예방 센터의 공식적인 위치를 대표하지 않습니다. 무역 이름과 상업 소스의 사용은 식별을위한 것이며 질병 통제 및 예방 센터의 보증을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging - microscope | Multiple vendors |
References
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